专利名称：抗水禽细小病毒vp3蛋白单克隆抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为涉及抗水禽细小病毒VP3 蛋白单克隆抗体。
背景技术：
水禽细小病毒主要包括鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)和番鸭细小病毒 (Muscovy duck parvovirus, MDPV)，是小鹅瘟和番鸭细小病毒病的病原，均属于细小病 毒科细小病毒属，基因组大小约5kb，病毒粒子直径20 22nm，无囊膜，呈二十面体对称 (Zadori et al. ,1994,1995 ；Tatar-Kis et al.，2004)。鹅细小病毒可感染鹅和番鸭，其危害极为严重，在雏鹅和雏番鸭表现高发病率和 高死亡率。番鸭细小病毒仅感染番鸭，不感染鹅；是以雏番鸭为易感的急性传染性疾病， 临床以腹泻、呼吸困难、脚软、渗出性肠炎为主要症状，也具有较高的死亡率(Takehara et al. , 1995,1998 ；Gough, 2003 Jansson et al. ,2007) 目前细小病毒感染已成为水禽养殖 业中危害最为严重的病原，给水禽养殖业造成巨大的损失。GPV和MDPV基因组都包括两个开放阅读框(Open Read Frame，0RF)，左侧ORF 编码非结构蛋白NSl和NS2，它们具有相同的终止密码子；右侧ORF编码结构蛋白VP1， VP2和VP3，其中VPl包含了 VP2和VP3，它们使用同一终止密码子(Zddori et al.，1994， 1995 ；Tatar-Kis et al. ,2004) VP3基因由1605bp组成，编码534个氨基酸，分子量为 60kDa(Zadori et al. , 1995 ；Chu et al. ,2001) 鹅细小病毒与番鸭细小病毒VP3间的同 源性为85-93%以上。VP3基因是编码病毒粒子衣壳的主要蛋白，是刺激机体产生保护性抗体的主要成 分，与病毒的毒力及致病性有关(Le Gall-Recule et al.，1996)。以MDPV VP3重组蛋白制 备特异性单克隆抗体可为水禽细小病毒的研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨VP3蛋 白在水禽细小病毒粒子形成及其致病方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗MDPV和GPV VP3蛋白单克隆抗体。本发明的单抗隆抗体是用纯化的MDPV VP3重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法 获得的，能够同时特异识别MDPV和GPV感染细胞病毒VP3蛋白的单克隆抗体。MDPV VP3重 组蛋白是将MDPV VP3基因克隆与原核表达载体pET-30a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表 达，纯化的VP3重组蛋白。该单克隆抗体的具体制备方法如下1、根据MDPV VP3基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长VP3基 因，将MDPV P22株VP3基因克隆于原核表达载体pET-30a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导 表达VP3蛋白；进行SDS-PAGE检测及Western blot分析鉴定后，裂解表达菌体，分离包涵 体，用pH 8.0的尿素裂解沉淀，离心后取上清经镍亲和层析过柱纯化(购自Qiagen公司，Valencia, CA公司)，将纯化后蛋白用6mol/L尿素进行梯度透析复性获得VP3重组蛋白。2、用MDPV VP3重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行 细胞融合，以HAT培养基(购自Invitrogen公司)选择性培养后，经VP3重组蛋白和His 蛋白进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株2D5 ；将杂交瘤细胞注BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗VP3蛋白单克隆抗体特性进 行鉴定。3、以ELISA测定抗VP3蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗VP3蛋 白单克隆抗体与MDPV和GPV病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒 (Zymed Laboratories, Inc.)鉴定抗VP3蛋白单克隆抗体的Ig亚类。本发明的优点是(1)本发明提供的MDPV VP3重组蛋白制备方法简单，纯度高； (2)本发明提供抗MDPV和GPV VP3蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗 MDPV/GPV VP3蛋白单克隆抗体可用于VP3蛋白结构和功能研究。具体地，在一个方面，本发明提供分泌抗水禽细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的杂 交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC No. 3671。另一方面，本发明提供针对水禽细小病毒VP3蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为 CGMCC No. 3671的杂交瘤细胞系分泌。再一方面，本发明提供用于治疗水禽细小病毒病的药物组合物，其包含上述定义 的单克隆抗体。在另一个发明，本发明提供用于治疗水禽细小病毒病的试剂盒，其包含上述定义 的单克隆抗体。在另一个方面，本发明提供上述定义的单克隆抗体在制备用于治疗水禽细小病毒 病的药物中的应用。在又一个方面，本发明涉及所述单克隆抗体在制备检测水禽细小病毒病的要求中 的应用。在本发明上述技术方案的优选实施方案中，所述水禽细小病毒病是鹅细小病毒病 或番鸭细小病毒病。杂交瘤细胞株2D5，于2010年3月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No. 3671。
图1为MDPV VP3重组表达质粒pET30a_VP3的鉴定图，泳道1是质粒pET30a_VP3 的PCR结果；泳道2和3是2kb DNA ladder ；泳道4是质粒pET30a_VP3的Bam Hl/Sall酶 切鉴定产物。图 2 为 MDPV VP3 表达蛋白的 SDS-PAGE (A)和 Western blotting (Bi 和 B2)鉴定 图，其中泳道1、5和8是蛋白质Marker，泳道2是BL21 (DE3)/pET30a_VP3诱导表达菌体， 泳道3是BL21 (DE3) /pET-30a诱导表达菌体，泳道4是纯化的VP3重组蛋白；泳道6和7分 别是BL21 (DE3) /pET30a-VP3和BL21 (DE3) /pET_30a诱导表达菌体在番鸭抗MDPV阳性血清 下的 Western blotting 结果；泳道 9 和 10 分别是 BL21 (DE3)/pET30a_VP3 和 BL21 (DE3) / pET-30a诱导表达菌体在番鸭抗GPV阳性血清下的Western blotting结果。
图3为抗VP3蛋白单克隆抗体的IFA鉴定图，图中MDPV、GPV和Negative分别是 单克隆抗体2D5与MDPV和GPV感染及正常鸭胚成纤维细胞(DFl)的反应结果。
具体实施例方式实施例1. MDPV VP3重组蛋白的制备根据MDPV序列设计引物，PCR扩增MDPV VP3基因，将其克隆于原核表达载体 PET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达MDPV VP3蛋白；收集表达菌体，冻融 3次后，离心分离包涵体，用pH 8. 0的尿素裂解沉淀，经镍亲和层析纯化，获得MDPV VP3重 组蛋白，最后该蛋白经6M尿素进行梯度透析复性。1). VP3重组表达质粒的构建根据MDPV VP3核苷酸序列(SEQ ID NO 1)设计合成特异性引物，上游引物pVP3F 5'-TTT GGATCC ATGGCAGAGGGAGGAAGCGGAGCTA-3，(SEQID NO :2，下划线为 Bam Hl 位点)，下 游引物 PVP3R :5，-GGGGTCGACTTACAGATTCTGAGTC-3’ (SEQID NO :3，下划线为 Sal I 位点)。 以PCR从MDPV P22株(哈尔滨兽医研究所提供)反转录的cDNA中扩增VP3基因(PCR反 应条件为94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 3min，32 个循环；72°C延伸 lOmin，4°C保 存。)pET30a(购自Novagen公司)经BamHl/Sall双酶切消化后，将扩增的VP3基因连接到 原核表达载体pET-30a的BamHl/Sall位点间，转化大肠杆菌ToplO，提取转化细菌的质粒， 以PCR鉴定重组表达质粒(图1)，经序列测定验证，获得VP3重组表达质粒pET-30a-VP3。阳 性重组表达质粒pET-30a-VP3转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Invitrogen公司)，SDS-PAGE 和Western blotting表明，表达的72kDa重组VP3蛋白均可被鹅和番鸭细小病毒阳性血清 所识别(图2)，其中鹅和番鸭细小病毒阳性血清是分别利用由哈尔滨兽医研究所提供的鹅 小病毒GPV-2T和番鸭细小病毒MDPV P22株免疫番鸭制备，即分别将纯化的100 μ g GPV和 MDPV与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备免疫抗原，免疫4周龄番鸭。免疫3次，每次 IOOyg/每只(0.2mL)；第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原，肌肉注射；间隔14天，用弗氏不 完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫；间隔14天，用不加佐剂的免疫抗原进行三免，肌肉注 射；免疫10天后，采血，分离鹅和番鸭细小病毒阳性血清。2). MDPV VP3重组蛋白的表达与纯化以氯化钙法将重组表达质粒pET-30a-VP3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，取阳性克隆 用LB液体培养基(含50 μ g/mL Kan)，37°C 250r/min振荡培养过夜，次日按1 100的比 例接种于含IOmL新鲜LB培养基IOOmL锥形瓶中，37°C 300r/min振荡培养，当OD6tltl = 0.6 时，加入终浓度为ImM IPTG诱导表达2h，4°C 12000r/min离心30sec，收集菌体，冻融三次， 40C 12000r/min离心lOmin，SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀，分析VP3蛋白的表达情 况。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀，振荡至溶液澄清，4°C 12000r/min离心lOmin，弃沉淀， 上清转移至镍离子亲和层析柱中(购自Qiagen公司，Valencia，CA)，振荡lh，由pET_30a 表达的带有His标签的VP3表达蛋白与镍离子螯合，先后用2倍体积柱床体积pH = 8. 0的 8M尿素溶液，3倍柱床体积pH = 6. 3的8M尿素，3倍柱床体积pH = 5. 9的8M尿素和5倍 柱床体积pH = 4. 5的8M尿素洗脱柱床，收集洗脱液Iml/管；用SDS-PAGE分析洗脱液，经 6mol/L尿素进行梯度透析复性，获得高纯度的VP3重组蛋白。实施例2.抗VP3蛋白单克隆抗体的制备
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用等量弗氏佐剂(Sigma公司)乳化纯化的IOOug VP3重组蛋白，免疫6周龄雌 性BALB/c小鼠，15天后用不完全弗氏佐剂(Sigma公司)乳化等体积蛋白进行二次免疫， 二次免疫后十天断尾采血用ELISA方法检测小鼠血清效价，此时小鼠血清效价已经明显上 升，经第三次免疫后检测小鼠血清效价，阳性值达1.0以上，P/N大于10时取其脾细胞与骨 髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(Invitrogen公司)作用下进行细胞融合，用HAT培养基(购 自Invitrogen公司)进行选择性培养；以纯化的VP3重组蛋白和His蛋白(购自KPL)为 检测抗原，用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，阳性杂交瘤经连续5次有限 稀释法克隆化，获得稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D5，将其于2010年3 月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，100101)，保藏号为CGMCC No. 3671 ；将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水， 获得抗MDPV VP3蛋白单克隆抗体2D5。具体如下。1).小鼠免疫分别将纯化的MDPV VP3重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备VP3免 疫抗原，免疫6周龄BALB/c小鼠8只(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)。免疫3次， 每次IOOyg/每只(0. 2mL)；第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原，背部皮下多点注射；间隔20 天，用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫，腹腔注射；间隔20天，用不加佐剂的VP3 免疫抗原进行三免，肌肉注射；免疫15天后，尾静脉采血，以VP3重组蛋白为检测抗原，用间 接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平，免疫小鼠抗体滴度达到1 4000以上，表明 小鼠获得良好免疫效果。2).杂交瘤细胞株的建立i)细胞融合细胞融合前3天，以不加佐剂的VP3重组蛋白尾静脉注射小鼠，每只 100 μ g(0. ImL)，无菌取脾脏，分离脾细胞，计数后按5 1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞 (2 X IO7)混合，在PEG4000作用下进行细胞融合(《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社， 1994年12月出版)；用HAT选择培养基(购自Invitrogen公司)重悬，置5% CO2 37°C进 行选择性培养，5天后半量换液，10天后改为HAT培养基(购自Invitrogen公司)。待细胞 克隆长至1/4-1/2培养孔时，取细胞培养上清检测分泌抗体。ii).杂交瘤细胞筛选分别用纯化的VP3重组蛋白和His蛋白(购自KPL公司)作为检测抗原，对杂交 瘤细胞培养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测，筛选阳性杂交瘤细胞。用0. 05M碳酸 盐包被缓冲液(PH9. 6)稀释纯化的VP3重组蛋白或His蛋白，按100 μ L 0. 045g/孔加入酶 标板中，37°C包被Ih后转入4°C过夜；用含0. 05%吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次， 加5%脱脂奶粉37°C封闭lh，每孔加入杂交瘤细胞培养上清100μ L，37°C孵育2h ；PBST洗 3次，加入1 5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中 杉金桥生物技术有限公司)，37°C孵育lh，PBST洗4次，加入显色底物OPD-H2O2 (购自北京 中杉金桥生物技术有限公司)，避光反应IOmin后，用2M H2SO4终止反应，用酶标仪读取OD49tl 值，以与阴性OD49tl值的比值大于2. 1判为阳性。VP3重组蛋白阳性而His蛋白阴性检测的 杂交瘤细胞孔为阳性克隆。iii).有限稀释法克隆化获得杂交瘤细胞系和保藏
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用HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/ml，每孔0. Iml接入96孔培养板，细胞含 量分别为2个/孔和1个/孔，置5% C023 7°C培养，5-7天观察细胞克隆生长情况，选取单 克隆生长孔细胞上清，以ELISA检测分泌抗体；对阳性克隆进行连续5次克隆，获得稳定分 泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D5，使其抗体分泌阳性率达95%以上。杂交瘤 细胞株2D5扩大培养，500转/分钟离心5分钟，收集细胞培养上清，将细胞沉淀用37°C提 前预热的DMEM冻存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亚砜)重悬，每管2ml分装，-70°C 冻存细胞。该杂交瘤细胞株于2010年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC-3671。3).抗VP3蛋白单克隆抗体2D5的制备。成年雌性BALB/c小鼠经0. 2ml/只降植烷腹腔注射，致敏1周后，腹腔注射杂交瘤 细胞2D5悬液5 X IO6-I X IO7, 7-10天后采集腹水，12000g离心5min，收集上清。上清加入 等量 PH7. 2 巴比妥缓冲盐水(VBS ；0. 004mol/L 巴比妥，0. 15mol/L NaCl, 0. 8mmol/L Mg2+， 0. 3mmol/L Ca2+)稀释；每IOml稀释腹水中加150mg 二氧化硅(Sigma公司)，混勻，悬液在 室温孵育30分钟，摇动；2000g离心20分钟，即得到澄清的单克隆抗体2D5腹水，_70°C冻 存。4).抗VP3蛋白单克隆抗体2D5的腹水效价的测定。首先抗VP3蛋白单克隆抗体2D5腹水用PBS缓冲液1000倍稀释，然后倍比稀释， VP3重组蛋白(2 μ g/ml) 100 μ L/孔包被的酶标板(购白Corning公司)，37°C孵育2h ；加 入倍比稀释(1 2000)的抗VP3蛋白单克隆抗体2D5腹水100μ 1，37°C孵育lh，PBST洗 涤3次后加入1 5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，37°C孵育lh，PSBT洗涤后，加 入显色底物OPD-H2O2 (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，避光反应lOmin，用2M H2SO4 终止反应，用酶标仪读取OD49tl值，以与阴性OD49tl值比值大于2. 1判为阳性，以阳性孔的最大 稀释度为抗VP3蛋白单克隆抗体2D5腹水效价。结果测得单克隆抗体2D5腹水的ELISA效 价分别为:6·4Χ10_7。实施例3.抗VP3蛋白单克隆抗体2D5的特性鉴定以纯化VP3重组蛋白为检测抗原用间接ELISA方法测定抗VP3蛋白单克隆抗体 2D5的腹水效价；以间接免疫荧光鉴定抗VP3蛋白单克隆抗体2D5与MDPV/GPV病毒蛋白的 反应性和特异性；用Zymed Laboratories，Inc公司亚型测定试剂盒鉴定抗VP3蛋白单克隆 抗体2D5重链和轻链的Ig亚型。i).抗VP3蛋白单克隆抗体2D5与水禽细小病毒的反应性和特异性鉴定以间接免疫荧光测定抗VP3蛋白单克隆抗体与MDPV和GPV病毒蛋白的反应性和 特异性。鸡胚成纤维细胞DFl经MDPV和GPV病毒(由哈尔滨兽医研究所提供)感染24h， PBS洗两次；100 μ 1/孔加入甲醇固定，Ih后弃固定液，分别加入单克隆抗体2D5的细胞培 养上清，100μ1/孔，37°C孵育lh;PSB洗涤3次，加入1 100稀释的FITC标记羊抗鼠 IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37°C孵育30min ；PBS洗涤后，加入PBS 100 μ 1，荧光显微镜观察并照相。结果单克隆抗体2D5株均特异识别MDPV和GPV病毒VP3 蛋白(图3)。ii).抗VP3蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定。利用Zymed Laboratories, Inc.公司亚型测定试剂盒测定抗VP3蛋白单克隆抗体
7Ig亚型。结果显示，单克隆抗体4E5的重链为IgGl，轻链均为κ。参考文献Zadori Z,Erdei J,Nagy J,Kisary J. Characteristics of the genome of goose parvovirus. Avian Pathol. 1994. 23，359—364.Zadori Z， Stefancsik R， Rauch T， Kisary J.Analysis of the complete nucleotide sequences of goose and muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adeno—associated virus 2. Virology 1995. 212,562-573.Tatar-Kis TiMato TiMarkos BiPalya V. Phylogenetic analysis of Hungarian goose parvovirus isolates and vaccine strains. Avian Pathol. 2004. 33,438-444.Chu CY, Pan MJ,Cheng JT. Genetic variation of the nucleocapsid genes of waterfowl parvovirus. J. Vet. Med. Sci. 2001. 63，1165-1170.Le Gall-ReculeG,Jestin V,Chagnaud PiBlanchard P，Jestin A. Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3)in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins. J. Gen. Virol. 1996. 77，2159-2163.Takehara K，Ni shio T，Hayashi Y，Kanda J，Sasaki M，Abe N，Hiraizumi M， Saito S，Yamada TiHaritani M. An outbreak of goose parvovirus infection in Japan. J. Vet. Med. Sci. 1995. 57，777-779.Gough RE. Goose parvovirus infection. In :Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR, Fadly AM，McDougal LR, Swayne DE. (Eds·)，Diseases of Poultry. Ilth ed. Iowa State Univ. Press, Ames，IA，2003. pp. 367—374.Jansson DS, Feinstein R，Kardi V，MatoT, Palya V. Epidemiologic investigation of an outbreak of goose parvovirus infection in Sweden. Avian Dis. 2007. 51,609-613.
权利要求
分泌抗水禽细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC No.3671。
2.针对水禽细小病毒VP3蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCCNo.3671的杂交瘤细 胞系分泌。
3.用于治疗水禽细小病毒病的药物组合物，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述水禽细小病毒病是鹅细小病毒病或番鸭细小病毒病。
5.用于治疗水禽细小病毒病的试剂盒，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于治疗水禽细小病毒病的药物中的应用。
7.权利要求6的应用，其中所述水禽细小病毒病是鹅细小病毒病或番鸭细小病毒病。
8.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测水禽细小病毒病的药物中的应用。
9.权利要求8的应用，其中所述水禽细小病毒病是鹅细小病毒病或番鸭细小病毒病。 全文摘要
本发明涉及一种抗水禽细小病毒VP3蛋白单克隆抗体细胞株2D5，其保藏号是CGMCC No.3671。本发明还涉及所述细胞株分泌的单克隆抗体，及其应用。
文档编号C07K16/08GK101914499SQ20101024609
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者刘明, 张云, 李娜, 王笑梅 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所