专利名称：一种具有抑制血管生成活性的多肽的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽 (H-KI系列多肽)。该多肽可抑制体外血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成和可抑制体内鸡胚尿囊膜和小鼠视网膜新生血管。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
血管新生是指在原有毛细血管网的基础上，通过血管内皮细胞增殖、迁移进而形成新生血管的过程。血管新生在体内胚胎发育、损伤修复等生理过程中发挥重要作用，同时也是众多新生血管性疾病，如肿瘤生长与转移、增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、类风湿关节炎等疾病的主要病理变化。因此新生血管抑制剂的研究与应用对于一些难治性新生血管相关疾病具有重要意义。眼部新生血管与多种眼病都有密切的关系，它常常导致严重的视力损害并最终致盲，例如糖尿病视网膜病变(DR)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，角膜新生血管，新生血管性青光眼等。目前临床上的治疗手段主要包括手术、激光和药物。手术需要一定的指征，患者痛苦大，且风险和并发症相对较高；激光治疗亦存在一定的痛苦，可造成局部视野缺损、诱发新生血管，中长期疗效也不甚理想。因此，一种无痛苦、便捷、有效、患者依从性高的药物治疗眼部新生血管的方法成为了近十余年来国内外研究的热点。血管内皮生长因子(VEGF)是相当重要的血管生长刺激因子，目前临床中已经得到应用或者仍在实验研究中的药物主要是一些针对VEGF或者其受体(VEGFR)的抗新生血管制剂。包括抑制VEGF表达的VEGF反义寡核苷酸；抑制VEGF受体表达的VEGF受体反义寡核苷酸；中和血循环中VEGF的抗VEGF抗体、可溶性VEGF受体、VEGF !"rap、抗VEGFR抗体、酪氨酸激酶抑制剂等，这些制剂在肿瘤治疗中应用广泛。在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体Bevacizumab (Avastin,最初用以治疗转移性结肠直肠肿瘤)、 重组抗人VEGF单克隆抗体片段Ranibizumab (Lucentis，)等。虽然这几种药物抑制眼部新生血管的作用已经得到肯定，但它们价格高昂，已报道有多种眼部或全身不良反应，且穿透血眼屏障能力低，给药方式受到限制。多肽类新生血管抑制剂与目前研究广泛的蛋白类新生血管抑制剂相比具有合成方法简单、容易进行化学修饰、免疫原性低、溶解性好、生物利用率高、组织穿透性强、给药途径多样、价格低廉等突出优势。然而，目前尚没有来自肝细胞生长因子(HGF)的、效果令人满意的小分子多肽。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9 ]-[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[X
aal9]-[Xaa20]-[Xaa21] (I)
式中，
XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
Xaal是选自下组的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 Ala ；
Xaa2是选自下组的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 Ala ；
Xaa3是选自下组的氨基酸Gly 或 Ala ；
Xaa4是选自下组的氨基酸Lys 或 Arg ；
Xaa5是选自下组的氨基酸Gly 或 Ala ；
Xaa6是选自下组的氨基酸Arg, Lys 或 Gly ；
Xaa7是选自下组的氨基酸Ser 或 Thr ；
XaaS是选自下组的氨基酸Tyr 或 Phe ；
Xaa9是选自下组的氨基酸Lys 或 Arg ；
XaalO是选自下组的氨基酸:Gly 或 Ala ；
Xaall是选自下组的氨基酸:Thr 或 Ser ；
Xaal2是选自下组的氨基酸:Val, Leu, lie, Met 或 Ala
Xaal3是选自下组的氨基酸:Ser 或 Thr ；
Xaal4是选自下组的氨基酸:Ile, Leu, Val, Met 或 Ala
Xaal5是选自下组的氨基酸:Thr 或 Ser ；
Xaal6是选自下组的氨基酸:Lys 或 Arg ；
Xaa 17是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；XaalS是选自下组的氨基酸Gly或Ala;Xaal9 是选自下组的氨基酸Ile，Leu，Val，Met 或 Ala ；Xaa20是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；Xaa21是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为2046个氨基酸。在另一优选例中，所述多肽的长度为20-23个氨基酸。在另一优选例中，XaaO和/或Xaa21是1_3个氨基酸构成的肽段。更佳地，XaaO 为 C、NC、或 RNC ；禾口 / 或 Xaa21 为 C、CQ 或 CQP。在另一优选例中，Xaal是选自下组的氨基酸Ile或Leu ；)(aa2是选自下组的氨基酸Ile或Leu ；Xaa3是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；Xaa5是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa6是选自下组的氨基酸Arg或Lys ；Xaa7是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；Xaa8是选自下组的氨基酸Tyr或Phe ；Xaa9是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是选自下组的氨基酸Gly或Ala;Xaall是选自下组的氨基酸Thr或kr ；Xaa 12是选自下组的氨基酸Val或Leu ；Xaa 13是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；Xaal4是选自下组的氨基酸Ile或Leu ；Xaa 15是选自下组的氨基酸Thr或kr ；Xaa 16是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；Xaa 17是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；Xaal8是选自下组的氨基酸Gly或Ala;Xaal9是选自下组的氨基酸Ile或Leu ；和/或Xaa20是选自下组的氨基酸Lys或Arg。在另一优选例中，Xaa6为Gly。在另一优选例中，所述多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO 1所示氨基酸序列经过1_5个(较佳地1_3，更佳地1_2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQID NO 1的所示多肽的抑制血管新生活性。在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO 1的相同性彡80 %，较佳地 ^ 90%；更佳地彡95%。
本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途， 它们被用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、 Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜， 包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的对象是人。在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了 MTS细胞增殖实验中各组OD值均值。对照组(control)和VEGF组差异有显著性(P = 0. 001)，VEGF组和多肽组差异有显著性(P < 0.001)，加入IOnM, IOOnM, 1 μ M，10 μ M H-KI20后的OD值，呈递减趋势。星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义(F = 7. 684，P < 0. 001)。(con :H_KI20浓度；1 =IOnM ； 2 =IOOnM ； 3 :1μΜ;4 :10 μ Μ)。图2显示了 Transwell细胞迁移实验中VEGF组和VEGF+不同浓度多肽组通过多孔膜的细胞数量(条柱图)以及VEGF组和加不同浓度的Η-ΚΙ20组迁移过多孔膜的细胞情况(彩色照片)。在条柱图中可以看到，多肽组较VEGF组细胞数目明显减少，且随浓度增加呈递减趋势。组间差异具统计学意义(F = 562. 3，P < 0. 001)。星号表示该组与VEGF组之间差异具有统计学意义。照片中透明的小圆孔为多孔膜的孔，蓝紫色的细胞是被苏木苏着染的通过小孔迁移过滤膜的细胞。图3显示了内皮细胞体外管腔形成实验中空白对照组、VEGF组和VEGF+不同浓度多肽组每100倍视野形成管腔的平均总长度(条柱图)，以及空白对照组、VEGF组和VEGF+10 μ M Η-ΚΙ20组的内皮细胞管腔形成情况(照片)。在条柱图中可以看到，VEGF+多肽组较VEGF组管腔形成总长度明显下降，且随浓度增加呈递减趋势。组间差异具统计学意义(F = 294. 9，Ρ < 0. 001)。星号表示该组与VEGF 组之间差异具有统计学意义。(con :H-KI20浓度；1 =IOnM ； 2 =IOOnM ； 3 :1μΜ;4 :10 μ Μ)。图4显示了 PBS组和多肽组鸡胚尿囊膜(CAM)上血管生长情况(彩色照片)以及评估实验中各组CAM血管计数情况(条柱图)。照片中白色的圆片为滤纸片，黑色的线圈划定的范围为血管计数范围，橙黄色的血管膜为鸡胚尿囊膜，可以看到加有10μ g/μ 1H-KI20的滤纸片周围的血管数目显著少于 PBS组。条柱图中control表示对照组(PBS组)，可以看到5 μ g/μ 1H-KI20组以及10 μ g/ μ 1Η-ΚΙ20组血管数量较PBS组显著下降，且随浓度增加呈递减趋势。星号表示该组与对照组之间差异具有统计学意义(F = 54. 762，P < 0. 001)。图5是视网膜新生血管模型的视网膜铺片、眼球切片照片以及对眼球切片中新生血管管腔数目的统计结果(条柱图)。在正常氧浓度下饲养的对照组幼鼠视网膜血管发育良好，未见无灌注区和新生血管，通过高氧环境诱导的视网膜新生血管模型组幼鼠的视网膜铺片中央可见大面积无灌注区以及新生血管团(椭圆圈标示)，经过玻璃体腔注射Η-ΚΙ20干预后的视网膜新生血管模型组幼鼠的视网膜铺片中新生血管团数目明显减少。从眼球切片中可以看到，正常组视网膜前未见新生血管管腔，视网膜新生血管模型幼鼠的视网膜前可以看到较多新生血管管腔(黑色箭头所示)，经Η-ΚΙ20干预后这些新生血管管腔数目显著减少，星号表示该组与 VEGF组之间差异具有统计学意义(F = 79. 320，P < 0. 001)。(con :H_KI20浓度；1 =IOmM ； 2 :50mM)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自肝细胞生长因子(HGF) 的、具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD (如仅约2kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列， 采用固相法将其合成后，再经鸡胚尿囊膜血管模型、VEGF诱导的细胞株增殖模型和缺氧诱导小鼠视网膜新生血管模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，能穿透血眼屏障、可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。活性多肽在本发明中，术语“本发明多肽”、“H-KI20多肽”、“H-KI20小肽”、“短肽H-KI20”或 “肽H-KI20”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽H-KI20氨基酸序列(SEQ ID N0 1)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQID NO :1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。本发明还包括H-KI20多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)H_KI20多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3 个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表 I
权利要求
1. 一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]_[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[Xaal9]-[Xaa20]-[Xaa21] (I) 式中，XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸:Ile, Leu，Val，Met或Ala ；Xaa2是选自下组的氨基酸11 e，Leu，Val，Met或Ala ；Xaa3是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；Xaa5是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa6是选自下组的氨基酸Arg，Lys或Gly ；Xaa7是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；XaaS是选自下组的氨基酸Tyr或Wie ；Xaa9是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是选自下组的氨基酸Gly 或 Ala ；Xaall是选自下组的氨基酸Thr 或 Ser ；Xaa 12是选自下组的氨基酸Val, Leu, lie, Met 或 AlaXaa 13是选自下组的氨基酸Ser 或 Thr ；Xaa 14是选自下组的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 AlaXaa 15是选自下组的氨基酸Thr 或 Ser ；Xaa 16是选自下组的氨基酸Lys 或 Arg ；Xaa 17是选自下组的氨基酸Ser 或 Thr ；Xaa 18是选自下组的氨基酸Gly 或 Ala ；Xaa 19是选自下组的氨基酸lie, Leu, Val, Met 或 AlaXaa20是选自下组的氨基酸Lys 或 Arg ；Xaa21是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为2046个氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和/或Xaa21是1_3个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaal是选自下组的氨基酸Ile或Leu； Xaa2是选自下组的氨基酸IIe或Leu ；Xaa3是选自下组的氨基酸Gly或Ala ； Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg ； Xaa5是选自下组的氨基酸Gly或Ala ； Xaa6是选自下组的氨基酸Arg或Lys ； Xaa7是选自下组的氨基酸Ser或Thr ； XaaS是选自下组的氨基酸Tyr或Wie ； Xaa9是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；XaalO是选自下组的氨基酸Gly或Ala ； Xaall是选自下组的氨基酸Thr或kr ； Xaal2是选自下组的氨基酸Val或Leu ； Xaal3是选自下组的氨基酸Ser或Thr ； Xaal4是选自下组的氨基酸IIe或Leu ； Xaa 15是选自下组的氨基酸Thr或kr ； Xaal6是选自下组的氨基酸Lys或Arg ； Xaal7是选自下组的氨基酸Ser或Thr ； Xaal8是选自下组的氨基酸Gly或Ala ； Xaal9是选自下组的氨基酸Ile或Leu ；和/或 Xaa20是选自下组的氨基酸Lys或Arg。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组(a)具有SEQIDNO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、 眼用凝胶或眼药膏。
8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger' s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。
10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及一种具有抑制血管生成活性的多肽。具体地，本发明涉及源自肝细胞生长因子(HGF)的具有抑制新生血管作用的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
文档编号C07K7/08GK102336812SQ20101023916
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者徐艺, 许迅, 赵卉 申请人:上海市第一人民医院