专利名称：一种从螺旋藻中分离高纯度藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种藻蓝蛋白的分离方法，特别是涉及一种从螺旋藻中高效分离纯化 藻蓝蛋白的方法，属于藻蓝蛋白分离纯化技术领域。
背景技术：
藻蓝蛋白(PC)是一种普遍存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中的捕光色素蛋 白，在螺旋藻中的含量高达7 % 20 %，在光合作用中能以近乎100 %的高效率将光能优先 传递给光系统。藻蓝蛋白不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义，而且可 以作为荧光分子探针应用于生物医学研究，作为无毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成 染料应用于食品、化妆品以及医药中。有研究表明，藻蓝蛋白具有抗肿瘤活性，可提高免疫 机能，其特性受到了国内外的重视，并已应用于老年痴呆症和帕金森症的治疗。虽然藻蓝蛋白具有十分广阔的应用前景，但由于藻蓝蛋白的纯度(A620nm/ A280nm)要达到4. 0以上才可作为生化试剂和临床药物，其分离纯化步骤繁琐，造成藻蓝 蛋白商品价格昂贵，使其应用受到了一定限制。藻蓝蛋白纯化过程的费用约占其成本的 50% 90%，因此，解决问题的关键在于纯化方法的简化和高效性。传统的藻蓝蛋白纯化方 法包括两大部分，首先进行细胞裂解以获取粗提物，常用超声、反复冻融、酶解和高压均质 等方法。然后将硫酸铵沉淀法与多种色谱层析法(如羟基磷灰石柱、离子交换色谱、分子排 阻色谱等)结合使用，达到分离纯化藻蓝蛋白的目的。传统方法]的主要缺陷在于(1)采用 超声或高压均质等机械法处理藻粉，能耗高；(2)传统方法常需要多步色谱串联使用，才能 获取高纯度藻蓝蛋白，不仅耗时长、得率低，而且因色谱填料的昂贵造成纯化成本的骤增。 近年来，涌现出一些取代传统方法的新工艺，比如双水相萃取技术(KALYANI M，MUNISHWAR N G. IPSITA R. Affinity-Based Strategies for protein purification[J]. American chemical society, 2006, 34 99-104)。但双水相萃取法所用的聚乙二醇PEG与藻蓝蛋白可 稳定结合，目前将藻蓝蛋白与PEG完全分离仍存在一定困难。我国螺旋藻等蓝藻已经逐渐实现工业化培养，有非常丰富的资源，为分离纯化藻 蓝蛋白提供了很好的原料来源。但我国在螺旋藻的开发和利用方面仍处于初级加工阶段， 深加工产品还比较少。高纯度螺旋藻藻蓝蛋白的生产还处于实验室研究阶段，缺少适合于 工业化生产的绿色工艺技术，使得藻蓝蛋白的规模化开发利用受到了极大的限制。因此，开 发一种简单、高效的高纯度藻蓝蛋白分离纯化技术，是实现高纯度藻蓝蛋白大量制备的关 键。
发明内容
针对目前技术的不足，本发明的目的是提供一种从螺旋藻中高效制备高纯度藻蓝 蛋白的方法。高纯度藻蓝蛋白是指藻蓝蛋白的纯度(A620nm/A280nm)要达到4. 0以上。为实现本发明目的，采用如下技术方案一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，步骤如下
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(1)将螺旋藻粉原料采用0. 05 0. 5M的磷酸缓冲液浸提法，使藻蓝蛋白从螺旋藻 细胞中渗出，在4 12°C，离心收集上清液，得到藻蓝蛋白粗提液；(2)向步骤(1)得到的藻蓝蛋白粗提液中加入水溶性壳聚糖，控制藻蓝蛋白溶液 中壳聚糖质量浓度为0. 1%，搅拌均勻，调整溶液PH至6. 5 7. 5，继续搅拌3 15 分钟后，在4 12°C，离心收集上清液；(3)向步骤(2)所得的上清液加入活性炭，搅拌3 10分钟，离心收集上清液，再 次向所得上清液中加入活性炭，搅拌3 10分钟，离心收集上清液；两次所用活性炭加入量 的质量之比为1 0.5 1 2，活性炭质量与处理溶液体积之比均为50g/L 100g/L;(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为30 60%硫酸铵沉淀，使藻 蓝蛋白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用PH6. 5 7. 5、5 50mM磷酸缓冲液溶解，并 用10 50kDa超滤膜超滤，除去硫酸铵；(5)在8 20°C，避光条件下，将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液，用离子交换层析， 并用含0. 05 0. 25M氯化钠的磷酸缓冲液梯度洗脱，获得高纯度的藻蓝蛋白溶液。为进一步实现本发明目的，所述步骤(1)的磷酸缓冲液浸提法是指将螺旋藻粉用 蒸馏水洗涤1 3次后，按固液质量比为1 10 1 20加入0. 05 0. 5M的磷酸缓冲 液，以6000 13000r/min磁力搅拌2 6小时。所述步骤(1)和步骤(2)的离心收集上清液是以6000 13000r/min离心6 20min，收集上清液。所述步骤⑴和步骤(3)中调整溶液pH至6. 5 7. 5都是通过加入0. 1 0. 5M 氢氧化钠或0. 1 0. 5M盐酸调整。所述步骤(3)所用的活性炭为木质粉状活性炭，规格为100 800目。所述步骤(5)的离子交换层析是将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAES^hadex A-25离子交换层析柱。所述含0. 05 0. 25M氯化钠的磷酸缓冲液梯度洗脱是指用pH为6. 5 7. 5，含 0. 05 0. 25M氯化钠的0. 01 0. 03M的磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度为0. 5 1. 2mL/min。所述步骤(1)、(4)和(5)中的磷酸缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。以上操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。本发明具有如下优点和有益效果(1)本方法采用缓冲液浸提法提取藻蓝蛋白，前处理简便，不需要超声破碎仪和高 压均质设备，能耗小；(2)使用价格低廉、来源广泛的活性炭和壳聚糖处理藻蓝蛋白粗提液，处理时间不 足1小时，就可使藻蓝蛋白纯度达到2. 5以上，具有耗时短，操作便捷的优点；(3)采用一步色谱法就可制备出纯度大于4. 0的藻蓝蛋白，可大大减少填料成本；(4)本方法只需2天就可制备出高纯度藻蓝蛋白，不仅生产周期短，而且对设备要 求简单，易于大量制备藻蓝蛋白，降低生产成本。
图1是螺旋藻藻蓝蛋白粗提液经壳聚糖和活性炭处理后所得藻蓝蛋白的吸收光 谱，620nm处的吸收峰是藻蓝蛋白的特征吸收峰，纯度A620/A280为2.6。
图2是最终纯化得到的藻蓝蛋白的吸收光谱，纯度A620/A280达到了 4. 3，表明已
经高度纯化。图3是最终纯化得到的藻蓝蛋白的荧光发射光谱，用590nm激发，荧光发射峰位于 643nm。图4是纯化各个步骤所制得的藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(图中A 蛋白marker ； B 藻蓝蛋白粗提液；C 壳聚糖-活性炭处理后藻蓝蛋白；D 柱层析后藻蓝蛋白)。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但具体实施方式
不 应理解为是对本发明保护范围的限定。实施例1从螺旋藻中高效分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)取螺旋藻粉，用蒸馏水洗涤1次，然后按固液质量比1 10加入0.05M的磷酸 钾缓冲液，磁力搅拌6小时，在4°C，以6000r/min离心20min，取上清液，即为藻蓝蛋白粗提液。(2)向步骤(1)的粗提液中加入水溶性壳聚糖，使其在藻蓝蛋白溶液中的质量浓 度为0. 1 %，搅拌均勻，调整溶液PH至6. 5，继续搅拌15分钟后，在4°C，以6000r/min离心 20min，取上清液。(3)向步骤(2)所得的上清液加入木质粉状活性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶 液体积之比为100g/L，搅拌3分钟，离心收集上清液，向所得上清液中继续加入木质粉状活 性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶液体积之比为50g/L，搅拌10分钟，离心收集上清液，得 纯度高于2. 5的藻蓝蛋白溶液(图1)。藻蓝蛋白纯度检测条件为使用Unico UV2300紫 外可见分光光度计于室温下测定，扫描速率为400nm/min，狭缝宽度为2nm，采用光径Icm的 样品池，藻蓝蛋白的纯度为620nm和280nm处吸收值的比值(A620/A280)。(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为30%硫酸铵沉淀法，使藻蓝蛋 白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用PH6. 5、5mM磷酸钾缓冲液溶解，并用IOkDa超滤 膜超滤，除去硫酸铵。(5)将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAE Sephadex A-25离子交换层析柱，然 后分别用PH为6. 5，含0. 05M氯化钠的0. 01M、0. 02M、0. 03M的磷酸钾缓冲液以0. 5mL/min 的洗脱速度梯度洗脱，每2ml收集一管，用UnicOUV2300紫外可见分光光度计测定每管在 280、620nm处的吸收值，收集A620/A280 >4.0的洗脱液。整个柱层析包括洗脱过程均在 8 °C、避光条件下进行。(6)将步骤(5)获得的藻蓝蛋白溶液，进行紫外可见全波长扫描和荧光发射光谱 扫描，测试条件为紫外可见全波长扫描检测条件与步骤(3)相同；荧光发射光谱扫描使用 HITACHI F-4500荧光分光光度计测量，激发、发射光狭缝为5nm，扫描速率为240nm/min，激 发波长为590nm。吸收光谱和荧光发射光谱分别如图2和图3所示，分别显示620nm处的 藻蓝蛋白特征吸收峰和643nm处的藻蓝蛋白最大荧光发射峰。通过图2与图1相比，峰形 更加明显，表明经过步骤(5)处理后藻蓝蛋白纯度更高，纯度620/280可达到4. 3。使用 SDS-PAGE方法进一步检测步骤(1)、(3)和(5)所得藻蓝蛋白的纯度，检测条件为取40yL
5藻蓝蛋白溶液，加入等体积的上样缓冲液(含5% SDS、2%巯基乙醇和10%甘油的50mM Tris溶液，pH = 6. 8)，混勻后沸水煮5min，IOOOOg离心5min，取上清上样，样品在浓缩胶中 电泳电压为80V，进入分离胶后电压为120V ；剥胶后，以0. 考马斯亮蓝R-250染色，用含 30%甲醇的10%乙酸脱色。电泳使用Tris-甘氨酸缓冲体系，浓缩胶、分离胶的质量浓度分 别为5%和15%。电泳仪为BIO-RAD mini3蛋白电泳仪，标准蛋白为SDS-PAGE低分子量标 准蛋白(购自大连宝生物工程有限公司)。结果如图4所示，图中A、B、C和D分别表示蛋 白marker、藻蓝蛋白粗提液、壳聚糖-活性炭处理后藻蓝蛋白和柱层析后藻蓝蛋白。与粗提 液相比，经过步骤(3)和步骤(5)处理后，SDS-PAGE显示的杂条带逐渐减少，柱层析后所得 的藻蓝蛋白样品在14kDa和20kDa之间出现清晰的两条藻蓝蛋白亚基条带，为α和β亚 基，与藻蓝蛋白结构相符合。以上利用藻蓝蛋白的光谱特性和变性电泳结果证明用本发明 方法制得的藻蓝蛋白为高纯度藻蓝蛋白。为了比较本发明的方法和传统的螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化方法，将已公开的多种 螺旋藻藻蓝蛋白纯化方法总结如表1所示。从表1可以看出，与各种传统藻蓝蛋白分离纯化方法相比，本发明实施例的方法 具有成本低、操作简便和耗时短等优点，而且提取的藻蓝蛋白纯度高。由于本发明避开了传 统的冻融法和超声破碎法，前处理操作简单，无需特殊设备，条件温和，对藻蓝蛋白的生物 活性影响小。此外，本发明将价格低廉的活性炭和壳聚糖用于藻蓝蛋白纯化，不仅使藻蓝蛋 白在不足1小时的处理时间里纯度提高到2. 5以上，而且为一步柱层析法制备高纯度藻蓝 蛋白创造了有利条件，使生产周期缩短，生产成本得到有效控制。表 1 实施例2从螺旋藻中高效分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，步骤如下
(1)取螺旋藻粉，用蒸馏水洗涤3次，然后按固液质量比1 20加入0. 5M的磷酸 钾缓冲液，磁力搅拌2小时，在8°C，以13000r/min离心6min，取上清液，即为藻蓝蛋白粗提液。(2)向步骤(1)的粗提液中加入水溶性壳聚糖，使其在藻蓝蛋白溶液中的质量浓 度为1%，搅拌均勻，调整溶液PH至7. 5，继续搅拌3分钟后，在8°C，以13000r/min离心 6min，取上清液。(3)向步骤(2)所得的上清液加入木质粉状活性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶 液体积之比为50g/L，搅拌10分钟，离心收集上清液，向所得上清液中继续加入木质粉状活 性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶液体积之比为100g/L，搅拌3分钟，离心收集上清液，得 纯度高于2. 5的藻蓝蛋白溶液。藻蓝蛋白纯度检测条件为使用Unico UV2300紫外可见分 光光度计于室温下测定，扫描速率为400nm/min，狭缝宽度为2nm，采用光径Icm的样品池， 藻蓝蛋白的纯度为620nm和280nm处吸收值的比值(A620/A280)。(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为60%硫酸铵沉淀法，使藻蓝蛋 白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用pH7.5、50mM磷酸钾缓冲液溶解，并用50kDa超滤 膜超滤，除去硫酸铵。(5)将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAE Sephadex A-25离子交换层析柱，然 后分别用PH为7. 5，含0. 25M氯化钠的0. 01M、0. 02M、0. 03M的磷酸钾缓冲液以1. 2mL/min 的洗脱速度梯度洗脱，每2ml收集一管，用UnicOUV2300紫外可见分光光度计测定每管在 280、620nm处的吸收值，收集A620/A280 >4.0的洗脱液。整个柱层析包括洗脱过程均在 20°C，避光条件下进行。检测方法与结果基本同实施例1。实施例3从螺旋藻中高效分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)取螺旋藻粉，用蒸馏水洗涤2次，然后按固液质量比1 15加入0. 2M的磷酸 钠缓冲液，磁力搅拌4小时，在10°C，以8000r/min离心lOmin，取上清液，即为藻蓝蛋白粗 提液。(2)向步骤(1)的粗提液中加入水溶性壳聚糖，使其在藻蓝蛋白溶液中的质量浓 度为0. 5%，搅拌均勻，调整溶液pH至6. 8，继续搅拌5分钟后，在10°C，以8000r/min离心 lOmin，取上清液。(3)向步骤(2)所得的上清液加入木质粉状活性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶 液体积之比为80g/L，搅拌5分钟，离心收集上清液，向所得上清液中继续加入木质粉状活 性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶液体积之比为80g/L，搅拌5分钟，离心收集上清液，得纯 度高于2. 5的藻蓝蛋白溶液。藻蓝蛋白纯度检测条件为使用Unico UV2300紫外可见分光 光度计于室温下测定，扫描速率为400nm/min，狭缝宽度为2nm，采用光径Icm的样品池，藻 蓝蛋白的纯度为620nm和280nm处吸收值的比值(A620/A280)。(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为60%硫酸铵沉淀法，使藻蓝蛋 白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用PH6. 8、IOmM磷酸钠缓冲液溶解，并用30kDa超滤 膜超滤，除去硫酸铵。(5)将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAE Sephadex A-25离子交换层析柱，然 后分别用pH为6. 8，含0. IM氯化钠的0. 01M、0. 02M、0. 03M的磷酸钠缓冲液以0. 8mL/min的洗脱速度梯度洗脱，每2ml收集一管，用UnicOUV2300紫外可见分光光度计测定每管在280、 620nm处的吸收值，收集A620/A280 > 4. 0的洗脱液。整个柱层析包括洗脱过程均在10°C， 避光条件下进行。检测方法与结果基本同实施例1。实施例4从螺旋藻中高效分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)取螺旋藻粉，用蒸馏水洗涤2次，然后按固液质量比1 13加入0. IM的磷酸 钠缓冲液，磁力搅拌3小时，在12°C，以lOOOOr/min离心8min，取上清液，即为藻蓝蛋白粗 提液。(2)向步骤(1)的粗提液中加入水溶性壳聚糖，使其在藻蓝蛋白溶液中的质量浓 度为0. 7%，搅拌均勻，调整溶液pH至7. 0，继续搅拌4分钟后，在12°C，以lOOOOr/min离心 8min，取上清液。(3)向步骤(2)所得的上清液加入木质粉状活性炭，使活性炭质量与藻蓝蛋白溶 液体积之比为90g/L，搅拌4分钟，离心收集上清液，向所得上清液中继续加入木质活性炭， 使活性炭质量与藻蓝蛋白溶液体积之比为60g/L，搅拌8分钟，离心收集上清液，得纯度高 于2. 5的藻蓝蛋白溶液。藻蓝蛋白纯度检测条件为使用Unico UV2300紫外可见分光光度 计于室温下测定，扫描速率为400nm/min，狭缝宽度为2nm，采用光径Icm的样品池，藻蓝蛋 白的纯度为620nm和280nm处吸收值的比值(A620/A280)。(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为50%硫酸铵沉淀法，使藻蓝蛋 白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用pH7.0、20mM磷酸钠缓冲液溶解，并用30kDa超滤 膜超滤，除去硫酸铵。(5)将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAE Sephadex A_25离子交换层析柱，然 后分别用PH为7. 0，含0. 15M氯化钠的0. 01M、0. 02M、0. 03M的磷酸钠缓冲液以1. OmL/min 的洗脱速度梯度洗脱，每2ml收集一管，用UnicOUV2300紫外可见分光光度计测定每管在 280、620nm处的吸收值，收集A620/A280 >4.0的洗脱液。整个柱层析包括洗脱过程均在 15°C，避光条件下进行。检测方法与结果基本同实施例1。
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权利要求
一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将螺旋藻粉原料采用0.05～0.5M的磷酸缓冲液浸提法，使藻蓝蛋白从螺旋藻细胞中渗出，在4～12℃，离心收集上清液，得到藻蓝蛋白粗提液；(2)向步骤(1)得到的藻蓝蛋白粗提液中加入水溶性壳聚糖，控制藻蓝蛋白溶液中壳聚糖质量浓度为0.1％～1％，搅拌均匀，调整溶液pH至6.5～7.5，继续搅拌3～15分钟后，在4～12℃，离心收集上清液；(3)向步骤(2)所得的上清液加入活性炭，搅拌3～10分钟，离心收集上清液，再次向所得上清液中加入活性炭，搅拌3～10分钟，离心收集上清液；两次所用活性炭加入量的质量之比为1∶0.5～1∶2，活性炭质量与处理溶液体积之比均为50g/L～100g/L；(4)将步骤(3)所得的藻蓝蛋白溶液，用质量浓度为30～60％硫酸铵沉淀，使藻蓝蛋白从溶液中沉淀下来，离心收集沉淀，再用pH6.5～7.5、5～50mM磷酸缓冲液溶解，并用10～50kDa超滤膜超滤，除去硫酸铵；(5)在8～20℃，避光条件下，将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液，用离子交换层析，并用含0.05～0.25M氯化钠的磷酸缓冲液梯度洗脱，获得高纯度的藻蓝蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(1)的磷酸缓冲液浸提法是指将螺旋藻粉用蒸馏水洗涤1 3次后，按固液质量 比为1 10 1 20加入0. 05 0. 5M的磷酸缓冲液，以6000 13000r/min磁力搅拌 2 6小时。
3.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(1)和步骤(2)的离心收集上清液是以6000 13000r/min离心6 20min，收集上清液。
4.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(1)和步骤(3)中调整溶液pH至6. 5 7. 5都是通过加入0. 1 0. 5M氢氧化钠 或0. 1 0. 5M盐酸调整。
5.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(3)所用的活性炭为木质粉状活性炭，规格为100 800目。
6.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(5)的离子交换层析是将步骤(4)制得的藻蓝蛋白溶液上DEAE Sephadex A-25 离子交换层析柱。
7.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述含0. 05 0. 25M氯化钠的磷酸缓冲液梯度洗脱是指用pH为6. 5 7. 5，含0. 05 0. 25M氯化钠的0. 01 0. 03M的磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度为0. 5 1. 2mL/min。
8.根据权利要求1所述的从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(1)、(4)和(5)中的磷酸缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种从螺旋藻中分离纯化高纯度藻蓝蛋白的方法，先将螺旋藻粉原料采用0.05～0.5M的磷酸缓冲液浸提法，使藻蓝蛋白从螺旋藻细胞中渗出，向藻蓝蛋白粗提液中加入水溶性壳聚糖，控制藻蓝蛋白溶液中壳聚糖质量浓度为0.1％～1％，离心收集上清液；向上清液加入活性炭，离心收集上清液，用质量浓度为30～60％硫酸铵沉淀，使藻蓝蛋白从溶液中沉淀下来，最后用离子交换层析，并用含氯化钠的磷酸缓冲液梯度洗脱，获得高纯度的藻蓝蛋白溶液。本方法具有成本低、耗时短、操作便捷、能耗低、易于大量制备等优点，是一种可大量制备高纯度高活性藻蓝蛋白的高效方法，有助于我国藻蓝蛋白的规模化开发利用。
文档编号C07K14/405GK101899102SQ201010224910
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者廖晓霞, 张学武 申请人:华南理工大学