专利名称：一种新型siRNA化学修饰单体及其制备方法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新型化学修饰单体的设计、合成；提供不同化学修饰siRNA的制 备以及使用化学修饰siRNA在抗肿瘤基因治疗中的应用。
背景技术：
近年来，新发展的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，是双链RNA (dsRNA)特 异性地诱发与其序列同源的mRNA分子降解，导致相应基因表达被抑制，是一种特殊的转录 后基因沉默现象。目前已证实，RNA干扰是生物界普遍存在的一种有效的基因沉默过程，被 广泛发现于植物、动物等真核生物细胞内，具有高特异性抑制靶基因表达、作用机制明确、 疗效显著、副作用轻微等特点。应用RNA干扰技术开发新型靶向药物，已成为药物研究领域 中重点发展的方向之一。但是，未经修饰的干扰RNA普遍存在生物稳定性差、半衰期短等问 题，限制了其实际应用。本发明的目的是，提供一种新型化学修饰单体及其制备方法，应用该修饰单体制 备化学修饰的siRNA，以保留或明显提高未修饰siRNA基因沉默作用，同时能克服未修饰 siRNA在体内稳定性差的缺陷。本发明所述应用化学修饰单体制备化学修饰的siRNA以提 高其在体内的稳定性及抗肿瘤活性的技术，迄今尚未见有相关报道。前期研究中，本实验室筛选获得一种高选择、高活性抑制Mdm2表达的siRNA序列。 Mdm2基因(murine double mimute 2)是从转化小鼠细胞系的双微染色体上克隆获得的癌 基因，在鼠和人的很多组织中都有表达(Cahilly, SL. et al. Somatic Cell and Molecular Genetics. 1987，13 (3) =235-244) 0 Mdm2的重要功能是抑制野生型p53的转录激活，促进 P53蛋白经泛素化途径降解，将p53的生长抑制活性限制在一种相对平衡的水平上，使细胞 能够继续增殖。此外，Mdm2还能抑制另一种重要的肿瘤抑制基因Rb的功能，甚至与p21发 生直接相互作用并抑制其功能。降低Mdm2基因的表达，可以解除Mdm2与p53的相互作用， 恢复野生型P53介导细胞周期阻滞和凋亡的功能，增强Rb、p21等对肿瘤的抑制功能，从而 抑制肿瘤的发生和发展。本实验室原使用的siRNA序列在中国已经申请专利，并于2005年 11月2日获得授权(专利号CN 1225286C)。体内外实验结果显示，Mdm2-siRNA具有显著 的抑制乳腺癌增殖作用，但是存在生物稳定性差、半衰期短以及非特异性脱靶效应等缺陷， 限制了其进一步的开发。本发明以Mdm2-siRNA为例，提供一种新型化学修饰单体，并应用 该修饰单体制备化学修饰的siRNA，以提高其在体内的稳定性和体内抗肿瘤活性。
发明内容
本发明提供了一种新型化学修饰单体；本发明提供了具有通式X结构化合物的制备方法；本发明提供了化学修饰siRNAs的制备方法；本发明还提供了化学修饰siRNAs在抗肿瘤基因治疗中的应用。本发明所述通式X化合物的结构如下所示
其中Rl选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基，单取代或双取代氨基；Rl可以是单取 代，也可以是多取代的基团；Rl优选自氢、氟、氯、甲基。本发明所述一种化学修饰Mdm2-siRNA，其核苷酸序列如下正义链5，-GCUUCGGAACAAGAGACCC-3，反义链3，-CGAAGCCUUGUUCUCUGGG-5，针对所述核苷酸序列3’末端的悬挂端2个碱基进行化学修饰。其修饰的特征在 于单独的正义链、反义链或者双链靠近3 ’末端1位、2位碱基或者1，2位碱基，均可由通式 X结构的新型修饰单体替代；3’末端两个碱基中，正义链、反义链或者两条链的一个碱基， 由通式X结构的新型修饰单体替代，另一个碱某采用目前常用的化学修饰单体替代，例如 2，-脱氧-2，-氟-β -D-阿拉伯糖核苷酸(2，-Deoxy-2，-fIuoro- β -D-arabino nucleic acid, FANA)讲行修饰将不同修饰的if义链和/i义链分另I丨讲行夺叉鉬合，制各不同化学修 饰的siRNA。本发明所述通式X化合物经以下步骤合成以苯酚化合物Ia Id和氯代环氧丙烷为原料，在碱性条件下通过醚化反应，二 甲基甲酰胺催化水解开环，可定量制备4a 4d ；选择吡啶为溶剂，化合物4的两个羟基 用4，4’ - 二甲氧基三苯甲基(DMTr)选择性保护，柱分离、纯化，制备5a 5d，收率50 70% ；在无水条件下，二异丙氨四氮唑盐为催化剂，按照常用的磷酰胺化反应，获得化学修 饰的单体Xl X4 ；最末端修饰单体的引入，可以采用RNA合成仪中常规的可控微孔玻璃珠 (controlled pore glass,CPG)作为固相载体，通过偶联反应，直接引入。反应合成路线如 下 本发明所述化学修饰SiRNA通过以下步骤制备将合成制备获得的修饰单体(X)，采用RNA合成中常规的亚磷酰胺化的合成方法， 利用 BLP-192 DNA/RNA High Throughput Synthesizer 仪制备获得不同化学修饰的 siRNA 单链寡核苷酸粗品。所合成的寡核苷酸通过Millipore, Nepean ON)去盐、纯化。将化学合成的等比例siRNA正义链和反义链的寡核苷酸加入IOmM磷酸钠 与IOOmM的氯化钠缓冲溶液中，加热90°C，保持15min，缓慢冷却至室温，4°C保存过夜，制备 获得双链的siRNA，_80°C冷冻保存备用。本发明所述化学修饰siRNA的生物学活性通过以下方式测定按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent产品说明书所描述的24孔及96孔板操作 规程，转染siRNA，转染后24h，倒掉培养液，加入Trizol试剂，提取总RNA，用无RNA酶水稀 释，于紫外分光光度计上测RNA的浓度。利用实时定量RT-PCR方法(InvitrogemCat.No. 18064-022，，014，071)，测定不同修饰Mdm2_siRNA的基因沉默作用。以 4ng RNase 处理 0. 25uL siRNAs,反应体系为 10uL，置 37°C，5% C02 培养箱培 养。在不同时间点加入RNA上样缓冲液，终止反应，-80°C冷冻保存备用。将不同时间点收 集的siRNAs和对照样品，进行20%聚丙酰胺凝胶电泳(80V，30mA, 120min)，SYBR Gold法 染色，采用灰度扫描法测定siRNAs的体外半衰期。取对数生长期的乳腺癌细胞(MCF-7)悬浮于含10%小牛血清(FBS)的培养液中， 以每孔9000细胞接种于96孔培养板中，参照Invitrogen公司LipofectamineTM 2000转 染试剂说明进行转染，48小时后通过SRB方法检测细胞生长抑制率。实验结果表明，化学修饰siRNAs对人乳腺癌MCF-7细胞的活性抑制和核酸酶稳定 性均有明显提高，其中siRNA6体外RNA水解酶的半衰期约为5. 5h，相对于未修饰siRNAl， 基因沉默作用、稳定性以及体外抗肿瘤活性，分别提高约2、2和3倍左右。siRNA6能显著降 低肿瘤细胞Mdm2的表达，同时也显示出非常明显的抑制肿瘤生长的活性。说明化学修饰的 siRNA6是通过提高未修饰siRNAl的特异性基因沉默作用，增强未修饰siRNAl抑制肿瘤细 胞生长的结果。
图1 :30nM，不同化学修饰siRNA对Mdm2表达的影响其中1-siRNAl；2_siRNA2 ；3_siRNA3 ；4_siRNA4 ；5_siRNA5 ；6_siRNA6图2 :50nM，不同化学修饰siRNA对Mdm2表达的影响Jt φ =I-SiRNAl ；6-siRNA6 ；7-siRNA7 ；8-siRNA8 ；9-siRNA9 ；10-siRNA10 ； 11-siRNAl1 ； 12-siRNA12 ； 13_siRNA13 ； 14_siRNA14 ； 15_siRNA15图3 不同化学修饰siRNA在RNase溶液中其中+1，siRNAl ；| 6，siRNA6 ；一 7，siRNA7 9，siRNA9 ；-^t- 11，siRNAll ； Δ 14, siRNA14 ；15，siRNA15图4 化学修饰siRNA和未修饰siRNA抑制肿瘤细胞生长作用的对比其中+1，siRNAl ； ▲ 6，siRNA具体实施例方式以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。《实施例1》2-羟基-3-(4，4’- 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚的制备取苯酚(90mmol)，150mL的丁酮，碳酸钾(180mmol)，加入500mL的三口反应瓶中， 45°C搅拌下，滴加环氧氯丙烷(630mmol)，约30min滴加完毕，反应液变浑浊，升温到80°C， 回流反应10h，冷却，过滤，减压蒸出大部分溶剂，加水IOOmL,二氯甲烷萃取(100mLX3)，有 机层用20% NaOH洗(10mLX3)次，有机层无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸出二氯甲烷。得到 黄色油状物2，3-环氧丙基苯醚。取2，3-环氧丙基苯醚粗品(90mmol)，水(90mmol)，DMF(9mmol)加入反应瓶中， 密闭，升温至110°c搅拌反应，反应8h，反应液由浑浊变澄清，结束反应，倒入水中，石油醚 洗一次，弃石油醚，水层用2-丁酮萃取三次，无水硫酸镁干燥，蒸出丁酮得到黄色油状物2，
3_ 二羟基丙基苯醚。加入2，3-二羟基丙基苯醚(90mmol)，70mL的吡啶，搅拌溶解，在45°C下，缓慢滴加 4，4’ - 二甲氧基三苯甲基氯(72mmol)与80mL的吡啶溶液，约2h加毕，室温搅拌反应12h， TLC跟踪(石油醚乙酸乙酯=2 1，Rf = 0.4)，反应完全，停止搅拌，加200mL水，乙酸 乙酯萃取(IOOmLX 3)，合并有机层，有机层用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，柱分离纯化(石 油醚乙酸乙酯=2 1)，得化合物2-羟基-3-(4，4，_ 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚， 淡黄色油状物，收率61.3%。IH NMR(DMS0-d6, 400ΜΗζ) δ 3. 09 (m, 2Η ； CH2) , 3. 72 (s , 6Η ； 20CH3), 3. 96-4. 04 (m, 3Η ；CH2CH) , 5. 14(d, J = 4. 8Hz, IH ；OH) , 6. 84-6. 93 (m, 7H ；ArH)， 7. 19-7. 21 (m, IH ；ArH)，7. 25-7. 29 (m, 8H ；ArH)，7. 40 (d, J = 8. OHz，2H ；ArH)。《实施例2》2-羟基-3-(4，4，-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯基醚的制 备采用4-氟苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率71. 0%。IH NMR (DMS0-d6，400MHz) δ 3. 09 (d, J = 4. 8Hz,2H, CH2) ,3. 73(s,6H ； 20CH3)，4. 04-4. 13 (m, 3H ；CH2CH)，5. 29 (d, J = 4. 8Hz, IH ；0H)，6. 89-6. 97 (m, 6H ；ArH)，7. 08-7. 54(m, IlH ；ArH)。《实施例3》2-羟基-3-(4，4，-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯基醚的 制备采用4-甲基苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率 55. 4%。IH NMR(DMS0-d6，400MHz) δ :2· 21 (s，3Η ;CH3)，3· 07 (m，2Η ;CH2)，3· 72 (s，6Η ； 20CH3), 3. 90-3. 99 (m, 3H ；CH2CH), 5. 11 (d, J = 4. 8Hz, IH ；OH) ,6. 77 (d, J = 8·4Ηζ，2Η; ArH)，6. 84-6. 86 (m, 4H ；ArH)，7. 05 (d, J = 8. 4Hz,2H ；ArH)，7. 19-7. 29 (m, 7H ；ArH)，7. 38 (d, J = 7. 6Hz，2H ；ArH)。《实施例4》2-羟基-3-(4，4，-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯基醚的制 备采用4-氯苯酚替代苯酚，操作方法参照实施例1，得淡黄色油状物，收率63.5%。IH NMR(DMS0-d6，400MHz) δ 3. 09 (d, J = 4. 8Hz, 2H ；CH2), 3. 71 (S, 6H ；20CH3),
3.97(m，2H ；CH2)，4· 03 (m, IH ；CH)，5· 16 (d, J = 5. 2Hz, IH ；OH)，6· 82-6. 93(m，6H ；ArH)， 7. 08-7. 30 (m, IlH ；ArH)。《实施例5》2-(3-(2氰基乙基-N，N-二异丙基磷酰胺氧基)_3_(4，4，-二甲氧基 三苯甲氧基)-丙基苯基醚的制备加入2-羟基_3-(4，4，- 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚(20mmol)，无水二异 丙氨四氮唑盐(5mmol)，50mL 二氯甲烷，室温搅拌溶解，通氮气保护条件下，冰浴，缓慢滴 加2-氰基乙基-N，N, N’，N’ -四异丙基磷酰胺(40mmol)与20mL的二氯甲烷溶液，温度 控制在0-5°C，搅拌反应24小时，TLC跟踪，反应完全，停止反应。盐水洗，有机层用无水 硫酸镁干燥后，过滤，减压浓缩至尽，快速制备柱分离纯化(正己烷乙酸乙酯三乙胺= 5:1: 0.1)，得化合物2-(3-(2氰基乙基-队^二异丙基磷酰胺氧基)-3-(4，4，-二甲 氧基三苯甲氧基)-丙基苯基醚(Xl)，白色膏状固体，收率82%。IH NMR(CDC13，400MHz) δ 1· 03 (m，3Η ;CH3)，1· 19 (m，9Η ;3CH3)，2· 45-2. 55 (m， 2Η ；CH2)，3. 37-3. 38 (m, 2H ；2CH)，3. 72-3. 79 (m, 4H ；2CH2) , 3. 83 (s, 6H ；2CH3)，
4.11-4. 14 (m, IH ；CH) ,4. 30(m，2H ；CH2)，6· 81-6. 82(m，4H ；ArH), 6. 85-6. 95(m，3H ；ArH)， 7. 20-7. 35 (m, 9H ；ArH)，7. 43-7. 46 (m, 2H ；ArH)。MS(ESI)m/z(M+H+) :671· 3。《实施例6》2-(3- (2-氰基乙基_N，N- 二异丙基磷酰氨氧基)_3_ (4，4，- 二甲氧基 三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯醚的制备采用2-羟基-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4_氟)苯基醚替代2_羟 基-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基 乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氟)苯醚 (X2)，白色膏状固体，收率92%。IH NMR(CDC13，400MHz) δ :0· 96 (m，3Η ;CH3)，1· 09 (m，9Η ;3CH3)，2· 37—2. 49 (m， 2H ；CH2)，3. 27-3. 29 (m, 2H ；2CH)，3. 45-3. 75 (m, 4H ；2CH2) , 3. 80 (s, 6H ；2CH3)， 3. 89-4. 05 (m, IH ；CH)，4. 15-4. 25 (m, 2H ；CH2)，6. 69-6. 77 (m, 6H ；ArH)，6. 86-6. 91 (m, 2H ； ArH)，7. 13-7. 25 (m, 7H ；ArH)，7. 34-7. 37 (m, 2H ；ArH)。
MS(ESI)m/z(M+H+) :689· 3。《实施例7》2-(3- (2-氰基乙基_N，N- 二异丙基磷酰氨氧基)_3_ (4，4，- 二甲氧基 三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯醚的制备采用2-羟基-3-(4，4，-二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯基醚替代2_羟 基-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基 乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4，- 二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-甲基)苯醚 (X3)，浅黄色油状物，收率75%。IH NMR(CDC13，400MHz) δ 1. 06 (m, 3Η ；CH3) , 1. 17(m,9H ； 3CH3) ,2. 28 (s, 3H ；3CH3) ,2. 45-2. 56 (m, 2H ；CH2) ,3. 21-3. 37 (m, 2H ；2CH) , 3. 52-3. 75 (m，4H ； 2CH2)， 3. 81 (s，6H, 2CH3)，3. 99-4. 08 (m, IH ；CH)，4. 21-4. 32 (m, 2H ；CH2)，6. 72-6. 81 (m, 6H ；ArH)， 7. 05-7. 10 (m, 2H ；ArH)，7. 19-7. 37 (m, 7H ；ArH)，7. 42-7. 47 (m, 2H ；ArH)。MS (ESI) m/z (Μ+Η+) :685· 1。《实施例8》2-(3- (2-氰基乙基_N，N- 二异丙基磷酰氨氧基)_3_ (4，4，- 二甲氧基 三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯醚的制备采用2-羟基-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4_氯)苯基醚替代2_羟 基-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基苯醚，操作方法参照实施例5，得2-(3-(2-氰基 乙基-N，N-二异丙基磷酰氨氧基)-3-(4，4’ - 二甲氧基三苯甲氧基)丙基(4-氯)苯醚 (X4)，白色泡状物，收率84%。IH NMR(CDC13，400MHz) δ :0· 96 (m，3Η ;CH3)，1· 08 (m，9Η ;3CH3)，2· 35—2. 49 (m， 2H ；CH2)，3. 27-3. 28 (m, 2H ；2CH)，3. 46-3. 75 (m, 4H ；2CH2) , 3. 80 (s, 6H ；2CH3)， 3. 90-4. 05 (m, IH ；CH)，4. 15-4. 25 (m, 2H ；CH2)，6. 69-6. 75 (m, 6H ；ArH)，7. 13-7. 25 (m, 9H ； ArH), 7. 34-7. 37 (m, 2H ；ArH)(见附录二，Fig. 31)。MS (ESI) m/z (Μ+Η+) :705· 3。《实施例9》化学修饰的寡核苷酸合成以可控微孔玻璃珠(controlled pore glass, CPG)作为固相载体，将0. OlM的化 学修饰单体X溶于无水乙腈中，加入等比例的5-乙硫基-IH-四氮唑(ETT)进行活化，形成 亚磷酰胺四唑活性中间体，与CPG所连羟基，或者CPG所连脱氧胸腺嘧啶(dT)的5'羟基， 或者CPG所连2'-脱氧-2'-氟-D-阿拉伯糖胸腺嘧啶(dTf)的5'羟基，偶联反应 15min,将化学修饰单体X连接到预设计的寡核苷酸序列中；向制备获得的寡核苷酸固相载 体中，加入新鲜的浓氨水，55°C反应12h，裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键，断裂 下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基，由此制备获得化学修饰的寡核苷酸粗品。所合成的寡 核苷酸通过Millipore, Nepean ON)去盐、纯化，制备获得不同修 饰的寡核苷酸(oligonucleotides，ONs)，寡核苷酸的序列见表1。表1不同化学修饰的寡核苷酸(oligonucleotides，ONs)序列表
《实施例10》化学修饰的寡核苷酸合成将等比例不同修饰的正义链和反义链寡核苷酸加入IOmM磷酸钠与IOOmM的氯化 钠缓冲溶液中，加热90°C，保持5min，缓慢冷却至室温，4°C保存过夜，制备获得化学修饰的 siRNA, _80°C冷冻保存备用，化学修饰siRNA的序列见表2。表2不同化学修饰siRNA的序列表 说明dT，脱氧核糖腺苷；dTf，FANA修饰的脱氧核糖腺苷；siRNAl为未修饰对照， 黑体字，含不同取代基团芳香结构的修饰单体Xn ；G、C、U、A为4种RNA的碱基；两条双链上 面的序列是正义链，下面的序列是反义链。《实施例11))Mdm2生物活性检测按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent产品说明书所描述的24孔及96孔板操作 规程，转染siRNA，转染后24h，倒掉培养液，收集细胞于玻璃离心管中，室温离心lOmin，用 真空泵吸尽上清，加入Trizol试剂，于15-30°C放置5min，裂解细胞。加0. 2mL氯仿/ (ImL Trizol试剂)，振摇均勻。2-8°C离心15min，离心后水相转移至另一个EP管中，向其中加 入0. 5mL异丙醇/(ImL Trizol)试剂。在15_30°C放lOmin，2_8°C离心lOmin，弃尽上清，洗 涤沉淀，短时间干燥RNA沉淀。用20 μ L双蒸水(RNase-free water)溶解RNA沉淀，提取 到的RNA用无RNA酶水稀释于紫外分光光度计上测浓度，其余-
RT-PCR 方法(Invitrogen, Cat. No. 18064-022，，014，071)测定 30nM 和 50nM 不同修饰的 Mdm2-siRNA的基因沉默作用。结果如图1和2所示，1、2、3、4、6号siRNA浓度为30nM时， 细胞 MDM2 表达率分别为 71. 53%,75. 61%,66. 89%,38. 24%,34. 39% ；1、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15 号 siRNA浓度为 50nM时，细胞MDM2表达率分别为 49. 09%,25. 41%,26. 31%, 27. 74%U9. 39%,21. 86%,36. 95%,40. 71%,46. 23%U5. 32%U6. 53%。《实施例12》siRNA稳定性检测用双蒸水将siRNA配制成40 μ M的溶液，RNase配制成2ng/ μ L的溶液。取0，30， 60，90，120，180，240min 作为检测点。每个时间点溶液配比如下siRNA 0.25 μ L双蒸水 5 μ LRNase 1 μ L混勻后，置37 °C、5 % C02计时，时间到时，每管加Loading buffer(5X)2y L, _80°C保存。电泳条件聚丙烯酰胺凝胶，上样量7 μ L，电压80V，电泳一小时后，用SYBR Gold(0.01%)染 色 IOmin0聚丙烯酰胺凝胶配比20% 丙烯酰胺 24mLTBE (5 X)6mLAP (10%)0. 2mLTEMED10 μ L实验结果如图3所示，siRNAl、6、7、9、ll、14、15的半衰期分别为100、330、100、 180、230、160、170min。《实施例13》SRB法检测siRNA对肿瘤细胞的增殖抑制作用根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的贴壁肿瘤细胞以200 μ L/孔接种于 96孔培养板，贴壁生长24h后转染，每个浓度设3个复孔，并设相应浓度的培养液对照。肿 瘤细胞在37°C、5% C02条件下培养48h。取出培养板，倒掉培养液，每孔加入200 μ L PBS 生理盐水，而后加入50 μ L 50% (m/v)TCA固定细胞，4°C放置lh。弃固定液，用去离子水洗 涤5次，空气中自然干燥。每孔加SRB溶液100 μ L，室温振荡lOmin。吸去上清液，用醋 酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150 μ L/孔的Tris溶液，振荡lOmin。在酶联免疫检测仪 (Model3550, Bio-Rad)测定OD值，用空白对照调零，所用波长为492nm。按以下公式计算肿瘤细胞生长的抑制率抑制率=[(0D492对照孔-0D492给药孔)/0D492对照孔]X 100 %结果如图4所示，siRNAl在10nM、30nM、100nM、300nM时对细胞的抑制率分别为 15. 98%,27. 42%,39. 57%,63. 01 %，IC5。值为 150. 6nM ；siRNA6在 10nM、30nM、100nM、300nM 时对细胞的抑制率分别为 22. 26%,35. 38%,61. 76%,88. 00%，IC50 值为 46. 5nM.。siRNA6 比未修饰siRNAl对细胞的抑制活性提高约3倍。
权利要求
一种新型化学修饰单体化合物，其结构如通式X所示其中R1选自氢、卤素、C1 C4烷基、C1 C4烷氧基，单取代或双取代氨基；R1可以是单取代，也可以是多取代的基团，多取代基团可以为邻位、间位或者对位。FSA00000158712600011.tif
2.如权利要求1所述单体化合物，其中Rl优选自氢、氟、氯、甲基。
3.一种化学修饰siRNA，其特征在于，用权利要求1所述单体化合物对siRNA正义链、 反义链核苷酸序列进行3'末端的悬挂端碱基化学修饰。
4.如权利要求3所述化学修饰siRNA，其特征在于，3'末端两个碱基，正义链、反义链 或者两条链靠近3'末端1位、2位碱基或者1，2位碱基均可由通式X结构的新型修饰单体 替代。
5.如权利要求3或4所述化学修饰siRNA，其特征在于，3'末端两个碱基中，正义链、 反义链或者两条链的一个碱基，由通式X结构的新型修饰单体替代，另一个碱基采用目前 常用的化学修饰单体替代。
6.如权利要求5所述化学修饰siRNA，其特征在于，常用的化学修饰单体优选2'-脱 氧-2'-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2 ‘ -Deoxy-2 ‘ -fIuoro-β-D-arabino nucleic acid, FANA)。
7.如权利要求3、4、5或6所述化学修饰siRNA，其特征是，将不同修饰的正义链和反义 链进行交叉组合，制备不同化学修饰的siRNA。
8.权利要求1所述化学修饰单体修饰的siRNA在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新型siRNA化学修饰单体，以及所述单体在制备肿瘤基因治疗药物中的应用；实验研究证明，化学修饰siRNAs对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制活性及核酸酶稳定性均有明显提高，有望开发成为临床有效的肿瘤基因治疗药物。
文档编号C07H21/02GK101921292SQ20101021004
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者任开环, 何红伟, 吴香玫, 李保卫, 李祎亮, 王玉成, 王菊仙, 白晓光, 许乐幸, 邵荣光 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所