专利名称：达托霉素的纯化方法
技术领域：
本发明涉及药物纯化领域，具体涉及一种达托霉素的纯化方法。
背景技术：
由革兰氏阳性耐药菌引起感染的趋势在不断上升。虽然万古霉素等糖肽类抗生素对这些耐药病原菌，如耐甲氧西林金葡球菌、表皮葡萄球和肠球菌耐药株等具有一定的治疗效果，但近几年来，随着临床上耐万古霉素革兰氏耐药菌的出现，使得这种趋势愈发增大，因此迫切需要寻找一类抗生素来对抗耐药菌。达托霉素是由玫瑰孢链霉菌产生的一种抗生素，如图1所示，由十三个氨基酸组成，其中十个氨基酸组成一个氨基酸肽环，另有三个氨基酸排列成线状，这三个氨基酸中末端的L-色氨酸接着一个十碳癸酸，是一种钙离子依赖型的抗生素。在钙离子存在的条件下，它将以非共价键的形式与细胞膜上达托霉素结合蛋白(DBPs)结合。达托霉素对于革兰氏阳性菌具有很好的杀菌作用，可开发成制剂用于包括但不限于耐甲氧西林金黄色葡萄糖菌和耐万古霉素肠球菌引起的感染。中国发明专利申请(申请号01805212. 6)和其分案申请(申请号200810087401. X)以及美国专利US6696412B1等公开了达托霉素的纯化方法。利用阴离子树脂FP-DA13从发酵液中富集达托霉素，接着利用反相树脂HP-20SS进一步纯化达托霉素，得到半纯化的达托霉素。然后将半纯化的达托霉素过Poros P150或Poros D50 (Applied Biosystem)纯化，得到纯度为98%的达托霉素。该方法提供了一种商业化可行的分离达托霉素的方法。 但是，在该方法中使用到了的Poros P150和Poros D50两种树脂，由Applied Biosystem 公司生产，其价格非常昂贵，而且虽然分离效果较好，但由于其颗粒很细，在分离纯化过程中需要很大压力才能达到一定的流速。
发明内容
本发明的目的在于对中国发明专利申请(申请号01805212. 6)和其分案申请(申请号200810087401. X)以及美国专利US6696412B1等公开的达托霉素的纯化方法作进一步的改进，以降低成本，利于工业化推广应用。为此，本发明提供了一种达托霉素的纯化方法，包括将半纯化的达托霉素进一步纯化的步骤，具体的，所述纯化是指将所述半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。本发明的达托霉素的纯化方法，所述凝胶型弱阴离子树脂为葡聚糖凝胶型弱阴离子树脂，所述葡聚糖凝胶型弱阴离子树脂为葡聚糖凝胶A25，所述葡聚糖凝胶A25在使用前采用含0-4mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液平衡，且所述缓冲液的pH为6 8。所述半纯化的达托霉素加载结合到葡聚糖凝胶A25后进行洗脱，使用体积为柱体积3倍的含0-4mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液洗涤后，采用体积为柱体积10倍的含 0. 1-0. 5mol/L氯化钠、0-4mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液进行洗脱，所述缓冲液的pH 为 6-8。本发明的达托霉素的纯化方法，所述凝胶型弱阴离子树脂为琼脂糖凝胶型弱阴离子树脂，所述琼脂糖凝胶型弱阴离子树脂为DEAE fast flow，所述DEAE fastflow在使用前采用含0-6mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液平衡，且所述缓冲液的pH为6 8。 所述半纯化的达托霉素加载结合到所述DEAE fast flow上进行分离纯化，使用体积为柱体积3倍的含0-6mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液洗涤后，采用含体积为柱体积5 10倍的含0. 015-0. 3mol/L氯化钠、0-6mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液进行洗脱， 所述缓冲液的PH为6-8。本发明的达托霉素的纯化方法，所述半纯化的达托霉素经步骤:A)、采用阴离子数脂从达托霉素发酵液中富集达托霉素粗溶液；B)、采用反向树脂纯化所述达托霉素粗溶液制得。本发明的纯化方法，使用的凝胶型树脂，原料易得、相对廉价、易于工业化推广应用。在缓冲液中添加尿素，破坏非共价键，有利于从树脂上洗脱达托霉素。本发明的纯化方法，得到的达托霉素的纯度高于98%。
图1为达托霉素结构图。图2为纯化后达托霉素的HPLC检测图谱。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。在本发明中，HPLC条件如下
流动相A相乙睛缓冲液(10 90)
B相乙睛缓冲液(45 55)
缓冲液0.5% (NH4)H2PO4
梯度(ISmin)
色谱柱Hypersil C18，4. 6*250mm，5 μ m
柱温:35°C
检测器DAD (HPllOO)检测器
检测波长:223nm
流速:1. 5ml/min
进样量:5μ 1
洗脱方式如表1所示。
表UHPLC洗脱方案
权利要求
1.一种达托霉素的纯化方法，包括将半纯化的达托霉素进一步纯化的步骤，其特征在于，所述纯化是指将所述半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述凝胶型弱阴离子树脂为葡聚糖凝胶型弱阴离子树脂。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶型弱阴离子树脂为葡聚糖凝胶A25。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶A25在使用前采用含 0-4mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液平衡，且所述缓冲液的pH为6 8。
5.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱是指使用体积为柱体积3 倍的含0-4mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液洗涤后，采用体积为柱体积10倍的含 0. 1-0. 5mol/L氯化钠、0-4mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液进行洗脱，所述缓冲液的 pH 为 6-8。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述凝胶型弱阴离子树脂为琼脂糖凝胶型弱阴离子树脂。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶型弱阴离子树脂为 DEAE fast flow。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述DEAEfast flow在使用前采用含0-6mol/L的尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液平衡，且所述缓冲液的pH为6 8。
9.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱是指使用体积为柱体积3倍的含0-6mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液洗涤后，采用含体积为柱体积5 10倍的含0. 015-0. 3mol/L氯化钠、0-6mol/L尿素的醋酸缓冲液或Tris缓冲液进行洗脱，所述缓冲液的PH为6-8。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述半纯化的达托霉素经以下步骤制得A)、采用阴离子数脂从达托霉素发酵液中富集达托霉素粗溶液；B)、采用反向树脂纯化所述达托霉素粗溶液。
全文摘要
本发明公开了一种达托霉素的纯化方法，将半纯化的达托霉素加载结合到凝胶型弱阴离子树脂后进行洗脱。本发明的纯化方法，得到的达托霉素纯度高于98％，且原料易得、相对廉价、易于工业化推广应用。
文档编号C07K1/18GK102276696SQ20101019624
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月9日 优先权日2010年6月9日
发明者夏兴, 孙新强, 戈梅, 李秋爽, 杨天, 杨志均, 罗敏玉, 苏永槐, 阮林高, 陈代杰 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂