专利名称：一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及植物抗病领域，具体涉及一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用。
背景技术：
茄子作为中国栽培的主要蔬菜之一，2006年全国播种面积70. 27万hm2，总产量 2247万t。但是在茄子的生产过程中常由于病害的发生给广大的菜农造成严重经济损失， 危害茄子的主要病害有黄萎病、青枯病、绵疫病、褐纹病等，例如茄子青枯病的发生一般会 减产20 30%，严重时损失达50 60%，已成为影响茄子高产的主要因素。而且这种病 很难根除，采取化学防治为主的综合防治措施也只能收到40 50%的防治效果，用轮作可 起到一定的防治作用，但实施比较困难。要防治这些病害的经济，有效的主要对策就是选育 抗病茄子品种，既能提高茄子产量，又能减少农药的使用，防止环境污染，而想选育出抗病 性强的品种必须有比较理想的育种材料。目前各国开展茄子育种的所用资源遗传基础比较 狭窄，是制约茄子抗病育种取得突破性进展的主要因素，野生的茄子材料由于存在生殖隔 离的问题，也难以将有利的抗病基因转移到栽培种中。因此要选育优良抗病品种，必须不断 地发掘和创新抗病材料，才是解决问题的根本途径。随着植物基因工程的深入研究，分离植 物抗病基因已成为现实，将抗病基因导入到受体植物后既可增强植物的抗病性又能保持优 良的经济性状，从而为开展植物抗病育种成找到一条新的途径。目前有关茄子抗青枯病基因工程研究比较落后，大多数主要集中在与抗青枯病性 状相连锁的分子标记筛选研究，还没有茄子抗青枯病基因分离的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有植物育种中存在的遗传基础狭窄、青枯病侵害问题严 重且农药的使用会对环境造成污染的问题，提供一种具有抗青枯病功能的基因。本发明另一目的在于提供上述抗植物青枯病基因的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述抗植物青枯病基因的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO :1所示，该基因编码的蛋白如 SEQ ID NO 2 所示。本发明抗植物青枯病基因是从半野生茄子E-31中扩增得到的。本发明抗植物青枯病基因的制备方法是通过cDNA-AFLP差异显示法及RACE法从 抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步骤如下(1)对E-31、E-32、Fl和F2茄子植株进行人工抗青枯病鉴定，得到抗病植株和感 病植株；(2)分别提取上述抗病植株和感病植株的总RNA，合成cDNA ；(3)利用cDNA-AFLP差异显示法进行筛选，用序列如SEQ ID NO :3 4所述引物
3扩增出与抗病基因连锁的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法扩增抗青枯病基因片段的全长序列根据步骤(3)所得抗病基因 片段设计引物，扩增5’端序列，如SEQ ID NO :6所示；所述引物序列如SEQ ID N0:7 8所 示；(5)根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增3’端序列，如SEQID NO 9所 示；所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根据扩增出的5’端序列和3’端序列进行连接，得到抗青枯病基因的全长序 列。本发明从半野生茄子E-31分离到一个茄子抗青枯病基因，通过转基因把该基因 导入到表现优良的感病品种中，可以提高茄子的抗病性，从而可以快速培育出新的茄子抗 病品种。具体方法如下将抗植物青枯病基因序列构建到克隆载体上，利用限制性内切酶进 行双酶切，获得目的基因片段，利用内切酶双酶切植物正义表达载体，把酶切获得的基因片 段和正义表达载体通过连接酶进行连接，将构建好的植物表达载体转化到农杆菌中，利用 农杆菌导入法进行转化，通过筛选，得到具有抗青枯病能力的转基因植株。其中，所述克隆 载体优选为PMD19-T;所述限制性内切酶优选为sma I和sac I。本发明抗青枯病基因还可用于其它抗青枯病资源比较缺乏的植物，如番茄的基因 工程育种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明从半野生茄子E-31中分离出抗青枯病基因，将该基因倒入到受体植物后 既可增强植物的抗病性又能保持优良的经济性状，改良了植物品种；通过本发明将基因导 入植物中以提高植物的抗青枯病能力，既能提高植物的产量，还可以减少农药的使用，防止 环境污染，适合在农业生产中进行推广。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1抗病基因的制备1.对所用的材料(E-31，E_32及其F1、F2代植株)用灌根法进行人工抗青枯病抗 性鉴定，确定抗病材料与感病材料。2.抗病材料E-31，感病材料E-32及它们F1、F2代抗病植株，感病植株的总RNA分 离提取，采用Trizol法。3. cDNA 的合成双链cDNA 合成方案参照 CL0NTECH 公司 SMART cDNA Library constructionkit Manual。 其中 Powerscript Reverse Transcriptase 购于 Invitrogen 公司，而 50 X advantage 2 polymerase Mix 购置于 CL0NTECH 公司。cDNA Synthesis (CDS)、SMART Π 引物及5' -PCR primer由上海生工合成，SMARTn序列如SEQ ID NO 12所示，CDS序列如 SEQ ID NO 13 所示，PCR Primer 序列如 SEQ ID NO 14 所示。第一链cDNA的合成(1)在一无菌的0. 5mL的微量离心管中加入下列试剂
应产物
RNA (0. 025 0. 5 μ g 的 poly A+RNA 或 0. 05 1 μ g 的 total RNA) 1 3 μ g cDNA Synthesis(CDS)Primer(IOyM)1 μ L
SMART Π Oligonucleotide(10 μ Μ)1 μ L
加入DEPC处理水至总体积为5yL
(2)混合样品，短暂离心；
(3)70°C保温2min ；
(4)短暂离心收集样品于管底，保持试管于室温；
(5)加入下列试剂于反应管中 5X First-Strand Buffer DTT(20mM) dNTP Mix(IOmM)
Powerscript Reverse Transcriptase
2μ L 1 μ L
1 μ L 1 μ L.
总体积为IOyL
(6)轻轻地涡旋且短暂离心试管；
(7)42°C温浴lh。如用PCR仪保温，样品上要加一滴矿物油；
⑶通过补充适合体积的TE缓冲液(IOmM Tris [pH7. 6]，ImM EDTA)稀释第一链反
若用总RNA作为开始材料，补充40 μ L的TE缓冲液； 若用多于0. 2 μ g poly A+RNA作为开始材料，补充450 μ L TE缓冲液； 若用少于0. 2 μ g poly A+RNA作为开始材料，补90 μ L TE缓冲液；
(9)加热试管72°C，7min;
(10)如不进行第二链的反应，第一链的cDNA存于-20°C可保存3个月
4. cDNA的LD-PCR扩增每个样品准备3个管。
(1)预热PCR仪到95°C；
(2)加入下列试剂于反应管中 IOXadvantage 2PCR buffer 5' -PCR primer(10 μ Μ) dNTP Mix(IOmM)
50 X advantage 2polymerase Mix 第一链cDNA
ddH20
5 μ L 2μ L 1 μ L 1 μ L 8μ L
33 μ L
总体积为50 μ L
(3)混合样品，短暂离心收集样品于管底；
(4)加两滴矿物油于反应液上，将反应管置于预热好的PCR仪上
(5)PCR反应程序如下
95 0C预变性Imin ；
95 "C15s65 °C15s68 °C6min循环次数全部先进行15个循环，加入1 μ L 0. 5Μ EDTA到各自的反应中，终止反 应，4°C保存；
5. cDNA酶切和连接酶切取合成好的cDNA酶切进行，先用Taq I进行酶切，酶切温度为65°C，时间 3h。酶切体系为cDNA (约 IOOng)8μ L Taq I(IOU) 1 μ L 10XNEB buffer 3 2μ L10XBSA 0. 2μ LddH90 9μ L总体积为 20μ l
Ase I酶切在上述酶切体系中加入下列成分
Taq I酶切体系20 μ LAse I(IOU)1 μ LIOXAse I buffer 31 μ LddH208 μ L_总体积为30 μ L温度为37°C，时间3h。双酶切结束后，取8 μ L体积的酶切产物进行1. 2%的琼脂 糖凝胶电泳检测。Taq I和Ase I接头的配制取25 μ g T1和22 μ g T2混合后水定容到100 μ L，此 为5pM Taq I的接头。另取2. 6 μ g A1和2 μ g A2混合后水定容到100 μ L，此为终浓度为 5pM Ase I的接头。
连接16°c恒温槽下进行，连接过夜。取5 μ L于1. 0%电泳，检测连接结果t双酶切后的产物22 μ LTaq I 接头IyLAse I 接头IyLT4Ligation buffer3 μ LT4DNA连接酶1 μ L补充ddH20总体积为30 μ L连接后产物稀释20倍最适宜用于模板的预扩增。 6.模板的预扩增和选择性扩增预扩增反应体系稀释的连接产物5 μ L，引物T3(K)Ong/ μ μ L，引物A3(K)Ong/μ L) IyL, IOX PCR Buffer (含 Mg2+ (25mM)) 2· 5 μ L，Mg2+25ml) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L, Taq酶(5U) 0. 4 μ L，补充ddH20至总体积为25 μ L。PCR反应条件为94°C预变性Imin ;94°C 30s，退火温度分别对56 °C 30s, 72 °C lmin,30个的循环次数，PCR产物取10μ L，在1. 5%琼脂糖胶上电泳比较。PCR产物稀释到 约Ing/ μ L (稀释20倍)，用于选择性扩增。选择性扩增体系13.8yL ddH20,2. 5μ L PCR buffer(含 Mg2+(25mM))， Mg2+(25mM) 1· 0 μ L，0· 5 μ L dNTP，1 μ L 弓丨物 T，1 μ L 弓丨物 A，5 μ L 预扩稀释产物，0· 2 μ L Tag 聚合酶，总体积25 μ L0 94°C, 5min ；94°C，30s，65°C，30s，72°C，Imin，以后每轮扩增温度递 减 0. 7°C，扩增 12 个循环后；940C，30s, 56°C，30s, 72°C，Imin,共 28 个循环；72°C延伸 7min。cDNA-AFLP的引物和接头由上海生工生物程技术服务有限公司合成，Taq I、Ase I接头和选扩的引物见表1。表1引物和接头序列表Table 1 Adaptor and primer sequence of Tag I and Ase I 7.变性选扩反应结束后，加入等体积的甲酰胺上样缓冲液，95°C变性5min后迅速放置冰 上2min，-2(TC贮藏备用。甲酰胺上样缓冲液的配制二甲苯青lmg，溴酚蓝lmg，0. 5M EDTA溶于去离子甲酰胺。8.测序胶电泳(1)洗板用洗衣粉洗净有机玻璃板和玻璃板的双面，再用ddH20冲洗干净，注意玻 璃板不要有划痕；(2)涂板洗净的玻璃板及有机玻璃板，晾干后用Eppendorf枪均勻的在板的上部 点洒ImL无水乙醇擦拭，注意擦拭朝同一方向进行，不要在板上来回划，重复擦3次，晾干； 玻璃板用ImL稀释的亲和硅烷(100 μ L亲和硅烷+900 μ L ddH20)均勻涂抹；有机玻璃板用 ImL的剥离硅烷均勻涂抹一遍。5min后各用无水乙醇均勻涂抹3次；(3)制板晾干后，将两块板组装，梳子斜向倒插，两边用夹紧，注意受力均勻；(4)凝胶配制尿素 21g，10XTBE 2. 5mL，40 % Arc :Bis 贮液 7. 5mL，重蒸水 26mL， 400 μ L 10%的过硫酸氨(Ammonium persulfate)，用磁力搅拌机搅拌溶解，加水定容至 50mL。灌胶前加入40 μ L TEMED ；10ΧΤΒΕ :108g Tris+55g 硼酸+3. 72gEDTA，定容 IL ；40%测序胶贮存液(40% Arc :Bis) :38g丙烯酰胺+2g N-甲叉双丙烯酰胺溶于 60mL水中，37°C助溶，定容至IOOmL;10%过硫酸氨，4°C可贮数周；(5)灌胶将固定好的板一方倾斜放置，将凝胶通过注射器从下至上快速注入，注意 排除气泡，保证胶面通过毛细作用左右方呈直线水平前进，当胶填满底部后，将斜向倒插的 梳子小心插入两夹板间，凝固3h以上；(6)电泳待胶凝固好后，拔出注射器，将胶板组装好，清洗板表面和上部点样孔附 近的胶，将梳子齿向下插入，稍微接触胶面，形成点样孔。首先在IXTBE中，50W预电泳 30min,使电泳槽温度达到45°C。取8 μ L变性的选扩PCR产物上样。45°C，50W恒功率电泳 90min，至二甲苯青指示带距底部约IOcm处。9.银染方法银染液按照下列配方配制固定/终止液(900mL ddH20+5mL冰醋酸+IOOmL无水 乙醇)；染色液(2g AgNO3+固定液)；显色液(20g NaOH+IOOOmL ddH20+5mL甲醛)；(1)固定在托盘A中加入固定/终止液，将在胶的短板放入托盘，轻摇20min或直 到指示剂颜色消失为止。也可在溶液中浸泡过夜(不摇动)。将溶液回收留用，清洗托盘；(2)洗胶在托盘B中用ddH20漂洗凝胶3次，每次2min，在将玻璃板取出时，让玻 板竖直滴干10 20s ；(3)染色在长盘A中加入IL染色液，将有胶的玻板放入托盘，轻摇30min ；(4)显色准备完全配制好显色液，将IL预冷的显色液置于托盘B中剩下产溶液仍 置于冰上，将胶从染色液中拿出放在一边；(5)洗胶将胶浸入装有ddH20的托盘中，拿出滴干水，立即将胶置于预冷的显色液 中。注意，从将胶置于水中到将其放入显色液中，时间不超过5 10s。如洗胶时间过长，重 复染色过程；(6)显色轻摇显色液，至胶上条带出现(或第一条条带出现)后，将胶移入剩余的 IL预冷显色液继续显色2 3min或直到所有条带都出现；(7)固定将IL固定液加入到显色液中，终止显色反应；
8
(8)洗涤用ddH20洗凝胶两次，每次2min ；(9)干胶室温下自然晾干。10.差异片断的回收和二次PCR扩增(1)差异条带的回收先用少量ddH20浸润差异表达的条带，然后用手术刀在酒精灯 上灭菌后沿条带边缘小心切下条带，溶解在50 μ L ddH20中，4°C冰箱浸泡过夜，100°C煮沸 15min，其间用枪头或牙签小心捣碎凝胶，12000rpm室温离心lOmin，取上清液可以用作二 次PCR反应的模板。(2)差异片段扩增的PCR反应体系及反应条件利用与回收条带相匹配的引物进 行 二 次 PCR, 25uL 扩增体系中含有10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L, Mg2+ (25mM) 1 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L，引物 A (50ng/ μ L) 1 μ L，引物 T (50ng/ μ L) 1 μ L, Taq 酶(5U) O. 2 μ L，回 收模板 5 μ L，力口 ddH20 M 25 μ L0 PCR 条件为94°C变性 2min ；94°C变性 30s, 56°C退火 30s， 72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸IOmin终止反应。(3)差异片段PCR扩增产物的纯化差异条带PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测 后，若只有一条亮带，则该产物可直接用于后续的连接反应，若有两条或更多的条带则需经 辨别后，从胶上回收目的条带(用于回收PCR反应体系增加到50 μ L)11.目的片段的测序经过差异筛选后，发现Τ3/Α8的引物组合得到与抗病材料紧密连锁的片段，经过 测序后得到序列如SEQ ID NO 5所示。12.利用RACE扩增出该基因片段的全长序列(1)所有锚定引物均由上海生工合成，用于3’和5’ RACE第一链cDNA合成的引物 序列如下3' -CDS(12yM)如 SEQ ID NO :13 所示，其中 N = A，C，G，or T ;V = A，G，or C5' -CDS (12 μ Μ) 5' -(T)25V Ν_3' (N = Α，C，G，or T ;V = Α，G，or C)，如 SEQ IDNO 37 所示；用于3’和5’ RACE PCR扩增的锚定引物序列如下IOXuniversal Primer A Mix(UPM)Long (0. 4 μ M)如 SEQ ID NO 38 所示；Short (2 μ Μ)如 SEQ ID NO 39 所示。Nested universal Primer A(NUP ； 10μΜ)女口 SEQ ID N0:40 所示。扩增5端序列所用的特异引物如SEQ ID NO :7 8所示；扩增3端序列所用的特异引物如SEQ ID NO 10 11所示。PCR反应的体系IyL cDNA 模板，2.5yL 10XPCR buffer(含 25mM Mg2+), Mg2+(25mM)0. 5 μ L，0. 5 μ L dNTP，1 μ L锚定引物，1 μ L 特异引物，0. 25 μ L Tag聚合酶(5U)， 加18. 25 μ L ddH20使总体积为25μ L。PCR反应程序:94°C预变性2min ；94°C 30s，退火温度 600C 30s, 72°C延伸2min，30个循环，72°C再延伸7min。套式PCR的退火温度提高到62°C。 PCR产物回收、连接和克隆等，送上海英骏生物技术有限公司测序。扩增3端的PCR反应为94°C预变性3min -MV 30s，退火温度52°C 50s，72°C延 伸2. 5min, 30个循环，72°C再延伸IOmin0把扩增出来的片段克隆到pMD19-T载体上，进行测序。
得至IJ 5端序列如SEQ ID NO 6所示，得到3端序列如SEQ ID NO 9所示。13RE_bw全长序列的连接与扩增根据5端序列与3端序列的测序结果，进行连接得到全长序列如SEQ IDNO 1所 示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。提取抗病材料“E-31”的总RNA，而后合成cDNA。根据抗病基因序列SEQ ID NO :1设计引物P3和P4，序列如SEQ IDNO :41 42所示；以“E-31 ”的cDNA为模板，按照以下PCR反应体系进行2. 5 μ 1 10XPCR buffer(Takara, Bio USA)，0· 5 μ 1 IOmmol I-IdNTPs(Takara, BioUSA)，0· 5 μ 1(20 μ Μ)引 物(Ρ1+Ρ2)，0· 25 μ 1 5U/ μ L Taq 酶(Takara, Bio USA)，20 μ 1 ddH20 and 1 μ 1 (20_50ng) 的cDNA模板，放置在PCR仪上，按照程序94°C下预变性5分钟，而后94°C 1分钟，55°C 1 分钟，72°C 2分钟，循环35次，72°C放置10分钟，在1. 2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在成像 系统(Bio-Rad, sub-celImodel 192，USA)下分离出目的基因片段。利用PCR产物回收纯化试剂盒(Takara，Bio USA)进行目的基因的回收，使用 Takara pMD-19 Ligation Kit进行即连接反应体系pMD19_T载体0. 5 μ L，回收纯化产物 4. 5yL, Solution I 5 μ L，总体积为10 μ L，16°C反应12h。即可以把抗病基因连接到克隆 载体PMD19-T上。将含有目的基因的克隆载体可以通过热激法转化到大肠杆菌DH5 α中，在液体LB 培养基中培养后，添加15 %的甘油，可在-80V长期保存。实施例2将基因导入植物中的方法将含有目的基因的PMD19-T用sma I和sac I双酶切，切下目的基因，而后同样用 sma I和sac I双酶切pBI121的⑶S基因，用T4连接酶把抗病基因与酶切后的pBI121进 行16°C连接12h，即可得到抗病基因的正义植物表达载体pBI121-RE-bw，用冻融法将构建 好的植物表达载体转化到农杆菌EHA105或LBA4404，即可进行遗传转化。以感病茄子自交系“E-32”为转化材料，介绍用农杆菌介导法具体的遗传转化方 法。具体的操作方法为培养茄子无菌幼苗，切下7d苗龄的上胚轴，浸泡于浓度为0D_0. 5 的农杆菌菌液中13分钟，用滤纸吸干上胚轴外植体，而后在培养基MS+6-BA(2. Omg. U1)+IAA(0. lmg. L"1)+ZT(2. Omg. L-1)+ 蔗糖(30g. L-1)+ 琼脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上预培 养 2d，转入筛选培养基[MS+6-BA (2. Omg. Γ1) +IAA (0. Img. Γ1) +ZT (2. Omg. Γ1) +Km (50mg. L-1) +Cb (500mg. L-1) + 蔗糖(30g. L-1) + 琼脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8上进行筛选，25 天后， 有抗性芽分化出现，对获得的抗性芽在培养基上[MS+6-BA (2. Omg. L-1) +IAA (0. Img. Ι^)+ΖΤ(2. Omg. L—1) + 蔗糖(30g. L—1) + 琼脂(6. 5g. L-1)，ρΗ5· 8进行 2-3 代的快繁，可以得到 大量的不定芽。对获得的抗性芽进行Southern杂交鉴定，有杂交信号的为转基因抗性 芽，没有杂交信号出现的为加阳性不定芽，对获得的转基因不定芽在生根培养基上 [1/2MS+NAA(0. lmg. L—1) +蔗糖(30g. L—1)+琼脂(6. 5g. L-1)进行生根，即可得到转基因植 株。实施例3所得到的转基因植株的抗病性评价转基因当代植株，定植于田间，发病率低于20%，发病植株的发病症状表现为1-2 级(即整个植株有1 3片枯萎)，而对照(为转化植株)发病率超过80%，发病植株的症状表现为4-5级(即整个植株叶片枯萎，甚至死亡)；转基因植株进行人工接种青枯病鉴 定，发病时间较对照植株推迟15天，而对照植株在接种7天后即表现感病症状。转基因植 株病情指数为8. 74，群体抗性表现为抗，而对照植株病情指数为76. 68，群体抗性表现为高感。
权利要求
一种抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO2所示。
2.根据权利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述基因是从半野生茄子 E-31中扩增得到的。
3.根据权利要求1所述的抗植物青枯病基因，其特征在于所述植物为茄子。
4.权利要求1或2或3所述的抗植物青枯病基因的制备方法，其特征在于通过 cDNA-AFLP差异显示法及RACE法从抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步骤如下(1)对E-31、E-32、Fl和F2茄子植株进行人工抗青枯病鉴定，得到抗病植株和感病植株；(2)分别提取上述抗病植株和感病植株的总RNA，合成cDNA；(3)利用cDNA-AFLP差异显示法进行筛选，用序列如SEQID NO :3 4所述引物扩增 出与抗病基因连锁的抗病基因片段，序列如SEQ ID N0:5所示；(4)利用RACE法扩增抗青枯病基因片段的全长序列根据步骤(3)所得抗病基因片段 设计引物，扩增5，端序列，如SEQ ID NO 6所示；所述引物序列如SEQ ID NO :7 8所示；(5)根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增3’端序列，如SEQIDNO 9所示； 所述引物序列如SEQ ID NO 10 11所示；(6)根据扩增出的5’端序列和3’端序列进行连接，得到抗青枯病基因的全长序列。
5.权利要求1或2所述的抗植物青枯病基因在制备抗青枯病转基因植株中的应用。
6.根据权利要求5所述的抗植物青枯病基因在制备抗青枯病转基因茄子中的应用。
7.根据权利要求5所述的抗植物青枯病基因的应用，其特征在于将抗植物青枯病基因 序列构建到克隆载体上，利用限制性内切酶进行双酶切，获得目的基因片段，利用内切酶双 酶切植物正义表达载体，把酶切获得的基因片段和正义表达载体通过连接酶进行连接，将 构建好的植物表达载体转化到农杆菌中，利用农杆菌导入法进行转化，通过筛选，得到具有 抗青枯病能力的转基因植株。
8.根据权利要求7所述的抗植物青枯病基因的应用，其特征在于所述克隆载体为 PMD19-T。
9.根据权利要求7所述的抗植物青枯病基因的应用，其特征在于所述限制性内切酶为 sma I 禾口 sac 10全文摘要
本发明公开了一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用。本发明抗植物青枯病基因是从半野生茄子E-31中得到的，其DNA序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO2所示。将本发明抗植物青枯病基因转入植株中，通过筛选可得到具有抗青枯病能力的转基因植株，增强了植株的抗病性，改良了植物品种，可广泛应用到农业生产中。
文档编号C07K14/415GK101880672SQ20101019150
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者曹必好, 曾国平, 柯剑, 王勇, 陈国菊, 陈清华, 雷建军 申请人:华南农业大学