专利名称：一种重组人血白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，特别是对重组的人血白蛋白的纯化。
背景技术：
人血白蛋白(HSA)，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40% -60%，它是血浆中很重要的载体，在体液PH7. 4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。许多水溶性差的物质可以通过与白蛋白的结合而被运输。这些物质包括胆红素、长链脂肪酸(每分子可以结合4-6个分子)、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子 (如Cu2+、Ni2+、Ca2+)药物(如阿司匹林、青霉素等)。另一个作用为维持渗透压。白蛋白的分子结构已于1975年阐明，为含585个氨基酸残基的球状蛋白质，分子量为66458Da，分子中含17个二硫键，不含有糖的组分。人血白蛋白基因位于4号染色体上有16961对碱基对，分为15个间隔区。经过RNA加工拼接后表达的m RNA可以编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。人血白蛋白有很大的应用及临床应用价值。例如作为药物可用于治疗因血清白蛋白合成障碍和创伤失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症；可以作为细胞培养基的添加成份，可以作为药物的辅剂，赋型剂；具有活性的激素或药物当与白蛋白结合时，可以不表现其活性，而视为其储存形式，由于这种结合的可逆性和处于动态平衡，因此在调节这些激素和药物的代谢上，具有重要意义。现在人类是从人血液中分离纯化人血白蛋白的。然而这一方法存在巨大的问题， 例如血源的短缺、受到乙肝病毒、AIDS病毒等病原微生物的污染，因此基于重组DNA的技术方法生产重组人血白蛋白(rHA)的多种方法获得研发。利用微生物体重组表达人血白蛋白的大规模生产和纯化方法可行。这种方法最近已经得到了开发。为数不少的重组方法可以使用，但从发酵液中提纯rHA仍是至关紧要的且随时有待提高的步骤。从人血液中分离纯化人血白蛋白，抗原性物质少，对提纯的技术要求相对较低。 与之相比，利用基因工程重组技术表达的白蛋白，外源性物质较多，而且由于人血白蛋白注射剂量较大，微量的抗原性物质都可能引起过敏反应，甚至危害患者的生命安全，因此对基因工程重组人血白蛋白的纯度要求更高，纯化技术难度更大。EP0612761公开了一种生产高纯度重组人血白蛋白的方法，其产品中不含自由的非抗原性杂质。这一方法在特定环境下运用了疏水层析色谱(HIC)，还有其它步骤如离子交换色谱，硼酸或硼酸盐处理，超滤及加热处理。然而，这一方法因步骤多而太复杂，从而难于满足大规模工业生产的要求。EP0570916公开了用基因操作技术生产rHA的方法，该方法包括超滤发酵上清液、加热处理、酸处理和再次超滤，随后使用阳离子交换、疏水层析和阴离子交换以及盐析等一系列纯化步骤。然而，因与EP0612761存在相似的问题，纯化过程太复杂、周期长、成本高而不能成为大规模生产的有效方法。EP0699687公开的rHA纯化方法为加热细胞培养液以灭活蛋白酶，再经阳离子交换微粒的流化床处理，洗脱液再经超滤、HIC和阴离子交换层析而得到纯rHA。然而，流化床对设备的要求与常规装填的层析设备不同，因而，仍需更经济有效的方法从发酵液中纯化 rHA。所以，开发一种稳定的、高效的、用于重组人血白蛋白及其融合蛋白的分离纯化方
法非常重要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种区别于目前常用的从人血浆中提纯人血白蛋白的方法，本发明是一种适合大规模操作的从发酵液或哺乳动物培养液中分离提纯重组人血白蛋白的方法。本发明可以通过以下层析步骤达到(1)将含重组人血白蛋白的发酵上清液进行固定化金属螯合亲和层析，(2)将步骤(1)的产物经过疏水层析，(3)将步骤O)的产物经过阴离子交换层析(疏水型阴离子交换层析)。1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-ChelatedAffinity Chromatography) ”的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA钠盐与金属离子如Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。后来的研究表明经固定的金属离子不仅与基质以螯合形式结合，还可以离子键、共价键形式结合，或分散在固体基质中以胶体状存在。1983年Poroth把凡是固定在基质上的金属(不管是否以离子状态存在)与溶质的亲和作用定义为“固定化金属亲和层析(IMAC) ”。目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。固定化金属螯合亲和层析的基本原理是过渡金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力比它们更强时，则蛋白质取代它们与金属离子形成复合物，从而使生物分子被吸附。用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来，如咪唑。IMAC填料的基质可以选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂及上述物质的衍生物和共聚物，此外还有大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石等无机材料。IMAC填料的基质上含有配基，常用的配基有亚氨基二乙酸(IDA)、三羟甲基乙二胺(TED)，还有次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基取代天冬氨酸(TEPA)及CMASP、CMDASA。已加好配基的IMAC填料有市售的，其中配基为三羟甲基乙二胺(TED)的填料商品名称为IMAC Sepharose 6Fast Flow，配基为亚氨基二乙酸(IDA)的填料商品名称为 Chelating Sepharose Fast Flow。与IMAC填料螯合的金属离子有Cu2+、Ni2+、Zn2\ Co2+等，以Cu2+为最好。本发明的步骤(1)按照下述工艺进行操作我们从GE公司购买IMAC填料(IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升)，来装填 XK50/30层析柱，然后，在IMAC填料上螯合金属离子。方法是使用0. 5倍层析柱体积的0. 2M金属离子溶液，优选为铜离子溶液，流过层析柱，铜离子会与配基结合，再用纯化水洗去未与配基结合的金属离子。然后用含10-200mmol/L磷酸盐、10-1500mmol/L氯化钠、pH6-8的缓冲液A平衡层析柱，优选含20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、pH7. 5的缓冲液A，直到流入层析柱的缓冲液与流出层析柱的缓冲液的电导值、PH值相同，可视为已经平衡好。然后将含有重组人血白蛋白的样品调整到与缓冲液A相同的条件，优选含 10-IOOmmol/L 磷酸盐、10-1500mmol/L 氯化钠、pH6_8。然后将调整好的含有重组人血白蛋白样品的液体通过层析柱，用缓冲溶液A洗去未被层析柱吸附的物质。然后用含10-200mmol/L 磷酸盐、10-1500mmol/L 氯化钠、0. 1-1. OM 咪唑，pH6_8 的缓冲液B来洗脱目标蛋白，优选为20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、0. 3M咪唑、pH7. 5的缓冲液B，收集缓冲溶液B的洗脱峰。其重组人血白蛋白的纯度可达65% -70%。在进入步骤(1)前，可以在稳定剂和还原剂存在的条件下，对发酵上清液进行热处理。其中稳定剂是辛酸钠，还原剂是半胱氨酸。本发明的步骤(1)使用了 IMAC柱层析，适用于各种盐浓度下的重组蛋白质的纯化，并允许含较高盐浓度的发酵上清液直接上样，甚至高达1. 5M盐浓度的样品也可以直接上样。这一优点可有效减少上样液总体积或省去超滤脱盐的步骤而降低成本。还可以在 PH6-8的条件下吸附重组白蛋白，避免了在低PH值条件下(pH3-5)重组白蛋白被蛋白酶降解。IMAC柱层析还适用于实验室、中试及工业化生产的重组人血白蛋白的有效分离和纯化工作。本发明的另一个目的是除去重组人血白蛋白中的蛋白降解产物及降低色素含量， 以便进一步提高终产品的纯度。将步骤(1)获得的目标蛋白进一步经过步骤O)的疏水层析，可以达到上述目的。疏水层析(HIC)是众所周知的色谱技术，其分离原理是基于蛋白表面疏水性的差异。许多被认为是亲水性的生物大分子，仍然有足够多的疏水基团暴露在外面，使其与连接于色谱基质的疏水基团相互作用。例如在专利EP0699687中，疏水层析早被建议用于重组人血白蛋白的纯化。本发明步骤O)的疏水层析可以除去重组人血白蛋白中的重组人血白蛋白的降解产物，这些降解产物分子量通常在10-50Kda。应用疏水层析吸附重组人血白蛋白的降解产物，而全长的重组人血白蛋白在未结合部分被洗脱。重组人血白蛋白的降解产物与介质疏水基团之间的疏水作用强度可以通过小幅度提高所使用的缓冲液的离子强度而得以加强。目前许多市售的疏水介质都是可以使用的，生产厂家有美国通用公司(GE公司) 和日本东曹达公司(T0S0H公司)等，本发明对疏水介质不限定任何特定的基质和/或基质上的配基。疏水介质的实例比如但不限于美国通用公司的Wienyl Sepharose 6FF high sub, Phenyl S印harose 6FF low sub, ButylS印harose FF ；日本 TOSOH 公司的 Butyl-650M、Pheny 1-650M、Ether-650S 等等。所用基质可为有机材料或无机材料。有机材料例如天然聚合物如琼脂糖、葡聚糖、 纤维素、淀粉等，或合成聚合物如二乙烯苯、苯乙烯。无机材料有大孔硅胶、多孔玻璃等，其中硅胶是众所周知的广泛使用的一种。基质上的配基可以是苯基、丁基、辛基、醚、异丙基等。步骤⑵的疏水介质与重组人血白蛋白之间可以有一个或多个作用位点。优选以琼脂糖为基质的介质，优选含有苯基、丁基如正丁基、辛基如正辛基等的配基。还优选以二乙烯苯为基质、以醚、异丙基或苯基为配基的介质，例如GE公司的Source 。步骤(2)最优为应用交联琼脂糖连结苯基配基的介质，商品名称为美国通用公司生产的 Phenyl S印harose 6FF high sub。步骤( 的疏水层析可以在pH4_8，优选pH6. 5-7,盐浓度0. 1-0. 5M之间进行。过程是先用含10-100讓01/1磷酸盐、10-500讓01/1氯化钠、？!16-8的缓冲液C来平衡疏水层析柱，优选含50mmol/L磷酸盐、0. 5M氯化钠、pH6. 5的缓冲液C ；然后将步骤(1)得到的样品调节到缓冲液C的条件；然后将样品流过疏水层析柱，并用缓冲液C洗脱未与层析柱吸附的部分；最后，收集流穿和未与层析柱吸附的部分。在步骤⑵之前，可以在稳定剂，还原剂和金属螯合剂存在下，对步骤⑴得到的产物进行热处理。其中稳定剂是辛酸钠，还原剂是半胱氨酸，金属螯合剂是EDTA。与疏水作用分离原理相似的反相色谱相比，疏水层析使用的配基浓度低得多。这一特点提高了其选择性，并且可使用温和的洗脱条件以助于保持目的蛋白的生物活性。本发明的另一个目的是有效地去除rHA聚体，同时去除内毒素。将步骤O)获得的目标蛋白进一步经过步骤(3)的阴离子交换层析，可以达到上述目的。阴离子交换层析介质可以使用GE公司的Q Sepharose Fast Flow、QSepharose high preformance>DEAE Sepahrose Fast Flow、Q Sepharose highpreformance 或Capto adhere ；或 T0S0H 公司的 T0Y0PEARL 树脂QAE、SuperQ、DEAE ；或 BIO-RAD 公司的 UN0SPHERE Q ；或 PALL 公司的 Q CeramicHyperD 20、Q Ceramic HyperF^DEAE Ceramic HyperD F 等填料。Q介质除了具有去除杂蛋白及色素的功能，还具有去除融合蛋白样品中聚合物和浓缩样品的功能。复合型填料Capto adhere具有阴离子交换和疏水作用的双重性质，它至少包含了与目的物作用的两个位点，一个提供电荷相互作用，一个提供基于氢键和/或疏水的相互作用。此介质能有效地去除核酸、宿主蛋白、二聚体、多聚体、病毒。在步骤C3)之前，可以将步骤( 得到的产物经过IOK的超滤膜脱盐，将溶液里的盐脱掉。在本发明的另一实施方案中，在步骤(3)阴离子交换层析之前，使用硼酸盐和氯化钙，在PH9.0条件下处理步骤( 得到的层析液0. 5-M小时，能有效地降低糖及宿主蛋白的残留量，同时能促使重组人血白蛋白的聚体向重组人血白蛋白单体转化。本发明提供了一种从发酵液或哺乳动物培养液中分离提纯重组人血白蛋白及其融合蛋白的方法。在本申请中，发酵上清液是通过克隆技术构建含人血白蛋白基困的毕赤酵母进行表达，得到发酵液，然后用日立大容量高速冷冻离心机(型号CR21G)在IOOOOg条件下，离心20分钟，取上清液体除菌过滤后得到。与以往方法相比，操作步骤少、操作稳定、 纯化方法简单、具有独特性。各步骤建立在等度洗脱的基础上，因此适于实验室、中试及工业化生产放大。特别是步骤(1)使用的IMAC柱层析，适用于各种盐浓度下的重组蛋白质的纯化，允许含较高盐浓度的发酵上清液直接上样。有效减少了上样液总体积，省去超滤脱盐的成本。还可以在PH6-8的条件下吸附重组白蛋白，避免了在低PH值条件下(ρΗ34)重组白蛋白被蛋白酶降解。
附图1、纯化前的发酵液样品分析图谱发酵液样品经TSK-SW3000分析，显示纯度12%设备Agilent1200 液相色谱仪，液相色谱柱 TSK-GEL G3000SffXL 7. 8 X 300mm 色谱条件流动相含1 %异丙醇的pH7. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲液(取0. 5mol/L磷酸二氢钠200ml,0. 5mol/L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15. 5ml及水914. 5ml，混勻)流速0. 6ml/ min，检测波长280nm，进样量20 μ 1，运行时间等度运行30分钟，柱温室温附图2、经过本专利工艺纯化后的样品分析图谱经过实施例1方法获得的样品纯化后样品经TSK-SW3000分析，显示纯度99%以上附图3、非还原电泳SDS-PAGE图谱其中分离胶浓度(12% )、上样量(8ug) 由左至右由左至右IMaker2参照的人血白蛋白样品3发酵液4金属螯合层析目的蛋白收集液5疏水层析样品6阴离子层析后样品7Capto adhere 层析后样品
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例公用于说明本发明而不限制于本发明的范围。实施例1 步骤(1)用固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来捕获样品填料IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升购自于GE公司，自己装填层析柱，XK50/30 柱子，柱直径5cm，填料高度15cm，用纯化水冲掉保存液(20%乙醇)。用0. 5倍柱体积的0. 2M硫酸铜溶液过柱，用纯化水冲掉未被吸附的铜离子。然后使用缓冲液A :20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、pH7. 5，平衡层析柱。把含人血白蛋白的发酵上清液加入磷酸盐、氯化钠、使之的达到20mmol/L磷酸盐、600mmol/L 氯化钠、pH7. 5。然后使用AKTATMPurify层析系统上样，流速50ml/min。上样后，用缓冲液A洗涤， 至吸收值达到基点。用缓冲液B :20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、0. 3M咪唑、PH7. 5来洗脱目标蛋白，收集缓冲溶液B的洗脱峰。
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步骤( 用疏水层析(HIC)进行纯化对步骤(1)收集的B缓冲溶液洗脱峰进行疏水层析纯化。用苯基疏水层析介质Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub) (GE 公司)来装填直径5cm的层析柱，柱高15cm。利用其它疏水性介质也具有相同的分离效果，但其疏水性与苯基介质的疏水性有所不同，试验者可根据所分离的目标蛋白的疏水性来选择。介质在使用前需用3倍柱体积的缓冲液C :50mmol/L磷酸盐、0. 5M氯化钠、PH6. 5平衡。向步骤(1)得到含目标蛋白的B缓冲溶液的洗脱液中加入去离子水，稀释至 0. 5MNaCl的浓度，用磷酸调pH值至6. 5。用AKTA Purify层析系统上样，流速50ml/min，上样结束后，用2倍柱体积的缓冲液C :50mmol/L磷酸盐、0. 5M氯化钠、PH6. 5继续洗脱。收集流穿峰和用缓冲液C的洗脱峰。 与疏水层析柱结合的部分，用2倍柱体积的去离子水洗脱，流出液丢弃。将疏水层析柱收集液，加入终浓度为0. IM的四硼酸钠和氯化钙溶液，调节pH至 9. 0，处理0. 5-24小时，然后IOOOOrpm离心20min，取上清液，用MIPP0RE公司的IOK超滤膜脱盐。步骤(3)使用阴离子交换层析精制样品装Q S印harose High Preformance ±真料于一根直径2. 6cm、高15cm的层析柱子中，填料体积80毫升。用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液E(50mM PB, pH7. 0)平衡。上样后使用2个柱体积的缓冲液E洗涤。然后用0-0. 5M NaCl经10倍柱体积梯度洗脱，收集主峰。实施例2:步骤(1)用金属螯合层析介质的层析柱来捕获样品填料Chelating购自于GE公司，自己装填层析柱，直径5cm，填料高度15cm，用纯化水冲掉保存液(20%乙醇)然后用0. 5倍柱体积的0. 2M硫酸铜溶液过柱，然后用纯化水冲掉未被吸附的铜离子。使用平衡液A :20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、pH7. 5平衡层析柱，然后把含目标蛋白的样品调整到缓冲液与A相同的条件，即20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、 PH7. 5。然后使用AKTA Purify层析系统上样，流速50ml/min。上样后，用平衡液A洗涤，至吸收值达到基点，流出液弃去。然后用缓冲液B :20mmol/L磷酸盐、600mmol/L氯化钠、0. 3M咪唑、PH7. 5的缓冲液来洗脱目标蛋白，收集缓冲溶液B的洗脱峰。步骤( 利用疏水层析填料(HIC)进行纯化用实施例(1)中收集的B缓冲溶液洗脱峰的纯化，来说明利用疏水性介质来纯化目标蛋白。用苯基(Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)GE公司)层析介质来装填直径5cm的层析柱，柱高15cm，用于疏水性分离。其它疏水性介质也具有相同的分离效果，但疏水性与苯基的疏水性有所不同，试验者可根据所分离的目标蛋白的疏水性来选择。
介质在使用前需用3倍柱体积的缓冲液C :50mmol/L磷酸盐缓冲液、0. 5M氯化钠、 PH6.5平衡，将实施例(1)步骤(1)中得到的含目标蛋白的溶液加入去离子水稀释至0.5M NaCl的浓度，用磷酸调pH值至6. 5。用AKTA Purify层析系统上样，流速50ml/min。上样结束后，用2倍柱体积的缓冲液-C :50mmol/L磷酸盐缓冲液、0. 5M氯化钠、PH6. 5继续洗脱。收集流穿峰和用缓冲液C 的洗脱峰。与疏水层析柱结合部分用2倍柱体积的去离子水洗脱，流出液弃去。将疏水层析柱收集液，加入终浓度为0. IM的四硼酸钠和氯化钙，调节pH至9. 0， 处理0. 5-24小时，然后IOOOOrpm离心20min，取上清液，用Millipore公司的IOK超滤膜脱盐。步骤(3)使用离子交换介质精制样品装 Q Sepharose High Preformance 介质于一根直径 2. 6cm 高 15cm 的层析柱子 (填料体积80毫升)中。用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液E (50mM PB，pH7. 0)平衡。上样后使用2个柱体积的缓冲液E洗涤。然后用0-0. 5MNaCl经10倍柱体积梯度洗脱，收集主峰。Q介质除了具有去除杂蛋白的功能，还具有去除融合蛋白样品中聚合物和浓缩样品的功能。
权利要求
1.一种纯化重组人血白蛋白的方法，该方法包括以下层析步骤(1)将含重组人血白蛋白的发酵上清液，进行固定化金属螯合亲和层析，(2)将步骤(1)的产物经过疏水层析，(3)将步骤O)的产物经过阴离子交换层析(疏水型阴离子交换层析)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中固定化金属螯合亲和层析填料的基质选自下列的一种或多种琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂、或上述物质的衍生物和共聚物、或大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石。
3.根据权利要求2所述的方法，所述基质材料是琼脂糖。
4.根据权利要求1所述的方法，固定化金属螯合亲和层析填料的基质上含有的配基选自亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺和次氨基三乙酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中配基选自三羟甲基乙二胺或亚氨基二乙酸。
6.根据权利要求1所述的方法，与固定化金属螯合亲和层析填料螯合的金属离子选自 Cu++、Ni++、Zn++ 或 Co++。
7.根据权利要求6所述的方法，所述金属离子为Cu++。
8.根据前面任一权利要求所述的方法，其中在进入步骤(1)前，在稳定剂和还原剂存在的条件下，对发酵上清液进行热处理。
9.根据前面任一权利要求所述的方法，其中在步骤( 之前，在稳定剂，还原剂和金属螯合剂存在下，对步骤(1)得到的产物进行热处理。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中稳定剂是辛酸钠，还原剂是半胱氨酸，金属螯合剂是EDTA。
11.根据前面任一权利要求所述的方法，其中步骤( 所使用疏水层析介质是含有苯基、脂肪族和/或杂环为配基的疏水层析介质。
12.根据前面任一权利要求所述的方法，其中在步骤(3)之前，将步骤(2)得到的产物经过超滤膜脱盐。
全文摘要
本发明区别于目前常用的从人血浆中提纯人血白蛋白的方法，提供了一种从发酵液或哺乳动物细胞培养液中分离提纯重组人血白蛋白的简单方法。本发明使用的固定化金属螯合亲和层析(IMAC)步骤，适用于各种盐浓度下的重组蛋白质的纯化，允许含较高盐浓度的发酵上清液直接上样，有效地减少了上样液总体积，降低成本。本发明方法稳定、高效，并适于实验室、中试及工业化生产放大。
文档编号C07K1/20GK102234332SQ20101015498
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月26日 优先权日2010年4月26日
发明者王欢, 白骅, 聂磊, 蔡秀云, 郭婷婷 申请人:浙江海正药业股份有限公司