专利名称：：靶向性抗胶质瘤蛋白质及其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及蛋白质氨基酸序列，具体是一种基于蝎氯通道毒素的靶向性抗胶质瘤蛋白质以及该蛋白质在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。
背景技术：
：从整体上看，现阶段人类对于恶性肿瘤的医治仍处于探索阶段。单抗药物和基因疗法尚难如人意，但随着人类基因组计划的完成和基因生物研究的发展，人类对肿瘤发病机理及相关特性的更多了解和把握，癌细胞更多、更稳定的特异性抗原的发现所带来的个体特异化的癌症治疗方法，将使单抗药物和基因疗法成为肿瘤治疗的主要趋势。2003年，美国Sonthrimer发现从以色列蝎毒素中分离的一种氯毒素Cltx能有效地抑制神经胶质瘤细胞生长，并对Cltx抗神经胶质瘤细胞的浸润及机制进行了探索，证实了在胶质瘤细胞膜表面表达、在肿瘤细胞扩散中起重要作用的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是Cltx的结合受体，Cltx可通过结合MMP-2来抑制肿瘤细胞的扩散。我国学者在研究东亚钳蝎毒素过程中，发现在东亚钳蝎中有一种神经毒素BmKCT，根据其与Cltx的高序列同源性推测其功能类似于Cltx。本课题组在查阅大量相关文献的基础上，开展了BmKCT蛋白抗神经胶质瘤的研究，取得了较好的进展。我们首先利用搭桥法人工合成了改良的BmKCT基因，实现了它在大肠杆菌中高效表达，并且该基因序列获批了国家发明专利(一种人工合成的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmKCTa,专利号=200410012544.6，2009年)。其次，用MTT法检测重组蝎毒素rBmKCTa对培养的人神经胶质瘤细胞SHG-44及正常鼠神经胶质细胞的影响，证实其对神经胶质瘤细胞有特异性作用。并且，利用全细胞膜片钳技术确证了rBmKCTa的电生理学特性，为氯通道抑制剂。最后，采用放射性131I标记该毒素，建立移殖有人的神经胶质瘤细胞的裸鼠动物模型，追踪了该毒素在动物模型内的动向，证实了rBmKCTa是一种分子量小、可穿过血脑及组织屏障，且可在体内与肿瘤组织的受体靶位特异结合的药物蛋白(东亚钳蝎氯离子通道毒素的生物活性研究，博士学位论文，殷丽天，2009年)。以上分析证明，Cltx和BmKCT可作为潜在的标记和治疗脑神经胶质瘤的有效药物来开发。但是作为小分子蛋白药物，这类氯毒素与受体(氯离子通道蛋白和MMP-2蛋白)分子作用机制的研究目前尚无报道，而只有当它们之间的相互作用的分子机理被阐明，才能有助于我们进一步利用和改造这类蛋白，加强其与靶细胞的特异性作用。本发明利用蛋白质结构数据库PDB、由瑞士生物信息学研究所开发的SwissModel服务器、由美国BOSTON大学研发的ZDOCK服务器、Accelrys公司的InsightII中Biopolymer和Discover3软件包等相关生物信息学资源，针对蛋白质结构与功能预测、蛋白质分子的相互作用和动态分子模拟这一实验瓶颈问题，开展了氯毒素与受体相互作用的分子计算模拟研究，构建该过程中重要分子事件的三维结构模型，通过优化部分氨基酸位点，构建了更具靶向性的有效药物分子模型及序列，对新型抗神经胶质瘤药物的研发具有重要的理论价值和应用前景。
发明内容本发明的目的在于提供一种基于蝎氯通道毒素的靶向性抗胶质瘤蛋白质以及该蛋白质在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。本发明提供的一种靶向性抗胶质瘤蛋白质，氨基酸序列为SEQIDNo.5。该靶向性抗胶质瘤蛋白质获得方法，包括如下步骤(1)以蛋白质Cltx(来源于以色列蝎(Leiurusquinquestriatus)，其氨基酸序列见SEQIDNo.1)和insecttoxin15A(PDB编号=ISIS)所提供的结构为基础，进行BmKCT蛋白质(来源于东亚钳蝎(ButhusmatensiiKarsch)，其氨基酸序列见SEQIDNo.2)原子结构的同源建模并做能量最小化和分子动力学优化；(2)利用De印ViewV.3.7软件，采用Coulomb计算模式，计算Cltx,BmKCT蛋白表面的静电势；(3)根据PDB库提供的受体蛋白的配体结合区的x-ray晶体结构解析结果，即氯通道蛋白C1C-2C端胞质区和MMP-2蛋白C端结构，以上述运算模式，计算其表面静电势，并分析可得，Cltx/BmKCT和其受体CLC-2C端和MMP-2C端分子之间极有可能存在静电吸引；(4)利用ZDOCK服务器进行Cltx/BmKCT与受体C1C-2C及MMP-2C复合物的原子结构模建，并对ZDOCK结果做能量最小化和分子动力学分析，最终每种对接复合体获得10个候选模型，获得每个模型的总能量；(5)统计Cltx、BmKCT与受体C1C_2、MMP_2结合模型中每个氨基酸与受体形成氢键的频率；(6)根据(5)的结果，分别设计针对C1C-2、MMP_2结合效率最高的新的4个蛋白质氨基酸序列CCLl(SEQIDNo.3)MCMPCFTTDHQMARKCRECCGGKGRCFGPQCLCRCCL2(SEQIDNo.4)MCMPCFTTDHQMARKCRECCGGKGRCYGPQCLCRCMMl(SEQIDNo.5)MCGPCFTTDHQMARKCRECCGGKGRCYGPQCLCRCMM2(SEQIDNo.6)MCGPCFTTDHNMARKCRECCGGKGRCYGPQCLCR(7)检测新的蛋白质序列与受体结合参数，从能量最小的复合物总能量、平均总能量、能量最小的复合物氢键数量、静电作用能4个指标签定和评价新设计的蛋白质序列；(8)根据复合体总能量越小越稳定、氢键结合数量越多越稳定、静电势能绝对值越大越稳定的原则，最终确定CMMl(SEQIDNo.5)为靶向性抗胶质瘤蛋白质序列。本发明提供的CMMl(SEQIDNo.5)靶向性抗胶质瘤蛋白质通过计算机模拟证实可以提高抑制神经胶质瘤细胞的增殖和扩散，可以在制备治疗神经胶质瘤药物中应用。图1:BmKCT蛋白空间原子结构图㈧和空间二级结构排列图(B)图2=Cltx,BmKCT蛋白表面的静电势图3氯通道蛋白C1C-2C端胞质区和MMP-2C端结构及其表面静电势图4=Cltx,BmKCT与受体C1C-2C、MMP-2C结合模型中每个氨基酸与受体形成氢键的频率图5设计的针对C1C-2C、MMP_2C结合效率最高的新的蛋白质氨基酸序列图6:Met3在CCL2三维结构中的位置㈧及Gly3在CMMl三维结构中的位置(B)具体实施例方式实施例11、蛋白质BmKCT原子结构的同源建模蝎毒素Cltx在蛋白结构数据库(PDB)中已有相应的通过NMR解析的溶液空间构象(PBD编号1CHL)，而BmKCT没有。因此，需要通过SwissModel的同源建模服务器，以同源蛋白Cltx和insecttoxin15A(PDB编号ISIS)所提供的结构为基础，将BmKCT蛋白与模板进行序列比对，运用原子力学的运算方法和能量最小化原理，以模板结构为基础构建BmKCT空间原子结构模型，并经InsightII中Discoverf软件包做能量最小化及分子动力学分析后获得BmKCT蛋白空间原子结构图(图1A)和空间二级结构排列图(图IB)。InsightII中Discoverf软件包做能量最小化的参数设置为10A的水盒、温度298K、最大步次(MaxStep)为3000次、最终收敛度(FinalConvergence)为0.001、共轭方法(Conjugate-Method)为Polak-Ribiere法；分子动力学分析参数设置为温度298K、步长(TimeStep)为lfs、运行时间(RunTime)为150ps。图IA中白色表示碳原子C、浅兰色为氢原子H、深兰色为氮原子N、红色为氧原子0，黄色表示氢键。2、利用瑞士生物信息协会(SwissInstituteofBioinformatics,SIB)提供的DeepViewV.3.7软件，采用Coulomb计算模式，以士1.8kT/e为标准，计算Cltx,BmKCT蛋白表面的静电势(见图2)。如图2A所示，Cltx由一个α-helix和两个反向平行的β-sheet构成，这与目前已知的短链蝎毒素的三级结构一致。表面静电势分析表明Cltx表面分布着大量正电势，暗示分子中的碱性氨基酸及产生的正电势对其与受体结合起决定作用。这一现象同样在BmKCT中(图2B)。3、根据PDB库提供的受体蛋白的配体结合区的X-ray晶体结构解析结果，即氯通道蛋白C1C-2C端胞质区和MMP-2C端结构，以上述运算模式，计算其表面静电势(见图3)，通过电场产生的静电作用力分析这两个受体与氯通道毒素发生相互作用的可能性。C1C-2的胞质区可分为两个结构域N端的类谷氧还蛋白结构域和C端的全部是α-helix的结构域(图3A)。位于C端的酸性的“footloop”区是人ClCs家族所特有的结构。从图3B看，由于有6个酸性残基的存在，footloop区为强的负电势；而位于N和C端中间的凹槽带正电势，表明这两个位点可能是与其配体相互作用的区域。MMP-2C端区域(MMP-2C，Thr458-Cys660)为一个由4个叶片状β螺旋浆样的蛋白组成的紧凑结构(图3C)，4个片层中间围成一个类似通道的孔，Ca2+和Na-Cr对可通过。表面静电势分析表明负电势主要分布在I、II、IV片层上(图3D)。如上所分析，Cltx/BmKCT和其受体C1C-2C端和MMP-2C端分子之间极有可能存在静电吸引。4、利用美国BOSTON大学的ZDOCK服务器进行Cltx/BmKCT与受体C1C-2C端及MMP-2C端复合物的原子结构模建。利用InsightII中Biopolymer和Discover3软件包对ZDOCK结果做能量最小化和分子动力学分析，用最陡下降法做最优化，在10A水盒中做300步共轭梯度能量最小化，在298K做了步长为lfs、共计5000fs的分子动力学分析(MD)，以上过程均在CVFF(consistent-valenceforcefield)力场函数下运行。最终每种对接复合体获得10个候选模型。表1中列出每种对接复合体的总能量。表1对接复合体的10个候选模型的总能量*<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(*总能量为动能与势能之和，单位为kcal/mol；——表示由于软件间的兼容问题导致无法计算出结果。)5、统计Cltx、BmKCT与受体C1C_2C、MMP_2C结合模型中每个氨基酸与受体形成氢键的频率(见图4)。6、根据图4的结果，分别设计针对C1C-2C、MMP-2C结合效率最高的新的4个蛋白质氨基酸序列(见图5)。7、检测新的蛋白质序列与受体结合参数利用ZDOCK服务器、InsightII软件包对新设计的蛋白质序列与C1C-2C、MMP-2C做对接、能量最小化和分子动力学分析，从能量最小的复合物总能量、平均总能量、能量最小的复合物氢键数量、静电作用能这些个指标签定和评价新设计的蛋白质序列(见表2、3、4)。表2列出了新设计蛋白质序列与受体对接复合体的10个候选模型的总能量；表3列出了序列优化前后Cltx/BmKCT与C1C-2C端结合平均总能量及能量最小的两个复合体中配、受体相互作用的氢键位置、数量及静电作用能的比较；表4列出了序列优化前后Cltx/BmKCT与MMP-2C端结合平均总能量及能量最小的两个复合体中配、受体相互作用的氢键位置、数量及静电作用能的比较。表2新设计蛋白质序列与受体对接复合体的10个候选模型的总能量*<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Γ总能量为动能与势能之和，单位为kcal/mol；——表示由于软件间的兼容问题导致无法计算出结果。)表3序列优化前后Cltx/BmKCT与C1C-2C结合平均总能量及能量最小的两个复合体中配、受体相互作用的氢键位置、数量及静电作用能的比较(其中能量单位均为kcal/mol)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4序列优化前后Cltx/BmKCT与MMP-2C结合平均总能量及能量最小的两个复合体中配、受体相互作用的氢键位置、数量及静电作用能的比较(其中能量单位均为kcal/mol)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>8、根据复合体总能量越小越稳定、氢键结合数量越多越稳定、静电势能绝对值越大越稳定的原则，筛选出如下2个序列为最优序列CCL2(SEQIDNo.4)MCMPCFTTDHQMARKCRECCGGKGRCYGPQCLCRCMMl(SEQIDNo.5)MCGPCFTTDHQMARKCRECCGGKGRCYGPQCLCR由序列可知，这两个序列的差异仅在于第三位氨基酸不同，从结构上看(见图6)，图6A的CCL2三维结构中方框所示为Met3，图6B的CMMl三维结构中方框所示为Gly3，这两个氨基酸残基均位于N端未形成二级结构的部位，对其三维结构的影响并不大，所以结合其它指标，从其在功能上能有效抑制神经胶质瘤细胞迁移上考虑，确定CMMl序列为最终的一种基于蝎氯通道毒素的靶向性抗胶质瘤蛋白质序列。本发明提供的一种基于蝎氯通道毒素的靶向性抗胶质瘤蛋白质序列通过计算机模拟证实可以提高抑制神经胶质瘤细胞的增殖和扩散。权利要求一种靶向性抗胶质瘤蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNo.5。2.如权利要求1所述的靶向性抗胶质瘤蛋白质在制备治疗神经胶质瘤药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种靶向性抗胶质瘤蛋白质，是以实验证实的蝎氯离子通道神经毒素(Cltx和BmKCT)在治疗脑神经胶质瘤中的途径(抑制氯通道ClC和MMP-2的活性)为基础，利用SWISS-MODEL服务器对BmKCT进行蛋白质原子结构的同源建模，并利用ZDOCK服务器进行氯通道毒素与受体复合物的原子结构模建，在候选模型中筛选结构稳定的模型并进行能量最小化和分子动力学分析，通过对Cltx和BmKCT的结合能量及氢键结合次数的分析，构建以氯通道毒素空间结构为骨架优化设计的新型具有对神经胶质瘤细胞高选择性和高特异性的蛋白分子序列和模型。本发明蛋白质可用于制备治疗神经胶质瘤的药物。文档编号C07K14/435GK101824084SQ20101014484公开日2010年9月8日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者付月君,安娜,张志云,杜军,杨仁佳,柴宝峰,梁爱华,王伟,申泉,黄瑞申请人:山西大学