专利名称：一种伐普肽的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及伐普肽的纯化方法。
背景技术：
伐普肽(vapreotide)是一种用于治疗前列腺癌、肢端肥大症等病症的多肽药物，其效果较好且副作用小，具有很好的市场前景。在已发表的文献和专利中，未有大规模生产、并且具有较高收率的纯化工艺报道。
发明内容
本发明提出了一条适于产业化纯化伐普肽的工艺方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。 为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤 1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3. 0-4. 5的醋酸盐缓冲溶液为A
相，乙腈为B相，梯度B% :20 % 40%，将粗肽溶液进行梯度洗脱； 所述"粗肽"是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的伐普肽粗肽或者纯度不能满足药用的伐普肽。A相醋酸盐缓冲溶液的pH值优选3. 5 ;"粗肽溶液"是指粗肽溶于纯净水所得到的溶液，纯净水符合注射用水标准，优选超纯水。优选"乙腈"的纯度级别优选色谱纯，即乙腈为色谱纯乙腈。步骤l)也称第一步纯化。
2)采用反相高效液相色谱法将其转成醋酸盐。 转成醋酸盐的方法优选，"反相高效液相色谱"的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，醋酸水溶液为A相，其中A相的醋酸水溶液浓度小于0.2X，优选浓度为0. 1X;乙腈为B相梯度BX :10% 40%，进行梯度洗脱。优选"乙腈"的纯度级别优选色谱纯，即乙腈为色谱纯乙腈。步骤1)也称转盐。 纯化规模包括以下规格色谱柱50mmX250mm(柱子直径X长度)、150mmX 250mm、300mmX250mm。 采用本发明提供的方法纯化伐普肽操作简单可行、纯度可达98%以上、收率好，达到产业化要求。
具体实施方式
实施例一 1.样品处理粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，
柱子直径和长度为50mmX250mm。流动相A相0. 2%醋酸溶液用氨水调pH至3. 0 ;B相乙腈，流速70-80ml/min。检测波长230nm。梯度B% :20% 40% (洗脱时间45min)。进样量为1.3-1.5g。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1. 3-1. 5g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32t:下减压旋蒸浓縮至约70 80mg/ml后备用。 3、转盐纯化条件色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mmX250mm。流动相A相0. 1 %醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速70-80ml/min。检测波长230nm。梯度B% : 10 % 40 % (洗脱时间30min)。进样量为1. 5-2. Og。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为150-200ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓縮至约5-8mg/ml，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98. 0%的伐普肽。纯化收率57%。 实施例二 1.样品处理粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，
柱子直径和长度为150mmX250mm。流动相A相0. 2%醋酸溶液用氨水调pH至3. 5 ;B相乙腈，流速450-550ml/min。检测波长230nm。梯度:B%:20% 40% (洗脱时间45min)。进样量为13-15g。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为13-15g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32。C下减压旋蒸浓縮至约70-80mg/ml后备用。
3、转盐纯化条件色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直
径和长度为150mmX250mm。流动相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速450-550ml/min。检测波长280nm。梯度B% :10% 40% (洗脱时间30min)。进样量为15-20g。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1200-1600ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓縮至约5-8mg/ml，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98. 0%的伐普肽，纯化收率65%。
实施例三 1.样品处理粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为300mmX250mm。流动相A相0. 2 %醋酸溶液用氨水调pH至4. 5 ;B相乙腈。流速1900-2200ml/min。检测波长230nm。梯度B% :20% 40% (洗脱时间60min)。进样量为55_75g。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55-75g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32t:下减压旋蒸浓縮至约70-80mg/ml后备用。 3、转盐纯化条件色谱柱以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为300mmX250mm。流动相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速1900-2200ml/min。检测波长230nm。梯度B% :10% 40% (洗脱时间45min)。进样量为55-75g。 纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1200-1600ml 样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓縮至约 5-8ml/g，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98. 0%的符合标准的伐 普肽，纯化收率62%。
权利要求
一种伐普肽的纯化方法，包括以下步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3.0-4.5的醋酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；2)采用反相高效液相色谱法将其转成醋酸盐。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤l)A相的醋酸盐缓冲溶液通过将醋酸溶液利用氨水调PH配制而成。
3. 根据权利要求l所述方法，其特征在于步骤l)A相的醋酸盐缓冲溶液pH应为 3. 5 4. 5。
4. 根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤1) A相的醋酸盐缓冲溶液pH应为 3. 5 4. 5。
5. 根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于步骤2)反相高效液相色谱的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，醋酸水溶液为A相，乙腈为B相梯度B % : 10 % 40 % ，进行梯度洗脱，其中A相的醋酸水溶液浓度小于0. 2%。
6. 根据权利要求3所述方法，其特征在于A相的醋酸水溶液浓度为0. 1%。
7. 根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于乙腈为色谱纯乙腈。
8. 根据权利要求5所述方法，其特征在于乙腈为色谱纯乙腈。
9. 根据权利要求6所述方法，其特征在于乙腈为色谱纯乙腈。
全文摘要
本发明提出了一种伐普肽的纯化方法，包括以下步骤1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3.0-4.5的醋酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度B％20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；2)采用反相高效液相色谱法将其转成醋酸盐。本发明的方法纯度高且收率好，达到产业化要求，为大量纯化制备伐普肽原料药提供了一种有效纯化工艺。
文档编号C07K1/20GK101787071SQ20101011637
公开日2010年7月28日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者袁建成, 覃亮政, 赵忠卫, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司