制备重组人白细胞介素11的方法

专利名称：制备重组人白细胞介素11的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种制备重组人白细胞介素11 的方法。
背景技术：
白细胞介素 11 (Interleukin-11，IL-11)首先由 Harvard MedicalSchool 的 D. A. Willianms等人于1986年发现。IL-Il是一种多功能的细胞因子，其最基本的功能在于 造血调控作用。它能刺激人的造血红细胞和巨核细胞前体的分化并诱导巨核细胞的生成和 成熟，最终导致血小板数量的增加。此外，它还具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪 细胞分化等多种生物活性(Du Χ. X. ,Williams D. Α.，Blood, 1997，89 (11)第 3897-3908)。 1990 年 Paul S. R.等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87 :7512-7516)克隆到该细胞因 子的cDNA，结果证明其cDNA序列与其它的细胞因子不同，命名为白细胞介素11。研究发现 白细胞介素11可以明显促进骨髓内造血细胞增殖，因而具有促血小扳生成的作用。白细胞介素-11由骨髓基质细胞产生，其分子量为23-MkDa，等电点(pi)为 11. 7，前体是含199个氨基酸的多肽，其中N端21个氨基酸是信号肽。成熟的IL-Il含有 178个氨基酸残基，没有二硫键和糖基化位点。IL-Il主要作用于B细胞、巨核细胞和浆细 胞瘤细胞，对于放/化疗患者、血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血、骨髓移植等造血功能 障碍的治疗具有显著疗效，故IL-Il具有广阔的应用前景。由于IL-Il的性能相当特殊，其基因编码区N端富含脯氨酸，不利于产物的正确 折叠，等电点极高，因此IL-Il较难实现在大肠杆菌中的非融合表达，常规的表达和复性都 很困难。目前通常都是采用融合表达方法。硫氧还蛋白(Thioredoxin，下文有时简称为 "Trx")是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白，该蛋白也是目前常用的表达 宿主(例如酵母菌或大肠杆菌)的内源蛋白。国内对重组人白细胞介素11的研制起步于九十年代中期。军事医学科学院基础 医学研究所苗继红等人(中国科学(B辑)，1995，25(6) =616-622)研究N末端缺失8个 氨基酸的IL-Il的表达活性。苏州医学院陈永珍等人(《中国免疫学杂志》，1997，13 (3) 165-166,169)报道了 IL-Il的活性测定的改良方法。与此同时，国内一些科研单位和制药 企业也展开了 IL-Il的研究工作。由于IL-Il的cDNA结构的特殊性，IL-Il不能在大肠杆菌 中直接表达。又由于IL-Il成熟蛋白前8个氨基酸中含有6个脯氨酸，内部脯氨酸含量也很 高，对其在大肠杆菌中的表达及后处理可能影响很大。为了获得IL-Il的有效表达，一种方 法是对IL-Il的N端氨基酸做缺失突变或增加氨基酸以避开G-C富含区，但这样可能影响 IL-Il的生物学活性及改变其免疫原性。另一方法是用融合蛋白的方法表达完整的IL-Il 的cDNA，然后再用专一切割剂将前导肽与IL-Il切割开。目前美国Genetics Institute使 用的是肠激酶，国内许多单位也采用这一切割剂。张颖等(《生物工程学报》，2000，16(3) :353-356)报道了中国人IL-Il的cDNA的 克隆与序列测定，并与国外报道序列(Palu et al,PNAS, 1990,87 :7512)进行了比较。结果表明，中国人胚胎来源的IL-Il的cDNA与文献报道序列高度同源，仅3个核苷酸有变化，氨 基酸序列没有变化。将IL-Il的cDNA插入到硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS中，在 大肠杆菌菌株G1724中进行表达。pTRXFUS含有PL启动子，IL-Il的cDNA插入到其trxA 基因的3'端。合成的融合蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式存在，并可正确折叠，表现 出全部生物学活性。黄岩山等(《生物工程学报》，2001，17(3) =250-253)报道了人白细胞介素11在 毕赤酵母中的表达与纯化的研究，作者依次采用SPkpharose FF, Phenyl Sepharose, Sephadex G25三种方法纯化，得到rhIL-11的纯度达98%。但是至今还没有人只利用镍离子螯合亲和层析与CM阳离子层析两种层析方法简 便地从Trx-rhIL-11融合蛋白来制备rhIL_l 1。

发明内容
本发明的目的是要提供一种制备重组人白细胞介素11的方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方 法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为硫氧还蛋白-(His)6-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(见8)6-硫 氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11 ；2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产 物包含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11 ；和3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白 和所述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得 重组人白细胞介素11。优选地，在所述步骤幻中使用洗脱液A、B和C进行所述梯度洗脱，其中所述洗脱 液 A 为 20 IOOmM Tris，pH7. 0 8. 5 ；所述洗脱液B 为 20 IOOmM Tris-HCl, 0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5 ；所述洗脱液 C 为 20 IOOmM Tris-HCl，10 50mM 咪唑，0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5。更优选地，所述洗脱液A为50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脱液B为50mM Tris-HCl， 0. 5M NaCl, pH8. 0 ；所述洗脱液 C 为 50mMTris_HCl，30mM 咪唑，0. 5M NaCl, pH8. 0。目前常规的纯化方法是使硫氧还蛋白吸附在层析柱上，同时将重组人白细胞介素 11和其他杂质洗脱下来，然后进行进一步的纯化。与现有技术相比，本发明的方法将硫氧还 蛋白和重组人白细胞介素11共同吸附在层析柱上，首先使杂质洗脱，然后利用两者与层析 柱的不同的结合性而将重组人白细胞介素11洗脱下来，从而方便快捷地达到纯化重组人 白细胞介素11的目的。在本发明中，所述重组人白细胞介素11优选具有如SEQ IDNO 1所示的氨基酸序 列。另外，在所述步骤1)和2、之间还使用镍离子螯合亲和柱层析法利用洗脱液D、E 和F对所述融合蛋白进行纯化，其中所述洗脱液D为50mM Tris,500mM NaCl，30mM咪唑， pH8. 0 ；所述洗脱液E为50mM Tris，pH8. 0 ；所述洗脱液F为IOOmM Tris，IOOmM咪唑(其pH优选为8. 0)。 为了在后续步骤中将IL-Il从融合蛋白上释放下来，优选在编码IL-Il的DNA 序列的5’端引入编码蛋白水解酶识别位点核苷酸序列。所述蛋白水解酶可以为凝血酶、 Kex2-600、脯氨酸内肽酶、肠激酶。肠激酶(EK酶)是优选的，因为该酶能够在识别位点的 C末端水解融合蛋白。因此，更优选在编码肠激酶识别位点的核苷酸序列的后面直接跟着 IL-Il的编码序列，这样肠激酶可以将最终所需的IL-Il完整、准确地释放出来。如果采用 人工合成编码IL-Il的DNA序列，为了便于克隆，在人工合成所述DNA序列时，还需要在该 序列的5’端和3’端引入适当的限制性酶切位点。为了便于日后的纯化，可在融合蛋白的 适当位置上插入便于纯化的序列，例如优选在所用Trx的N端或C端插入His-Tag。市售的 载体pET3h(+)中不但具有Trx的基因，而且在该基因的下游还具有His-Tag和肠激酶切 割识别位点。 优选地，所述酶切步骤包括a)配制反应液，其含有lmg/mL融合蛋白；20mM Tris-HCl, pH8. 0 ；1体积％ Tween 20 ；和b)按IU肠激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入肠激酶，在18°C、44rpm下反应 15h 至 18h。在所述步骤幻后还优选使用阳离子交换柱层析法对所述重组人白细胞介素11进 行纯化，其中所述阳离子交换介质为快流速CM琼脂糖凝胶，洗脱液为洗脱液G和H，所述洗 脱液 G 为 20mM NaCl，IOmM PB, pH7. 0 ；所述洗脱液 H 为 300mM NaCl，IOmM PB, pH7. 0。在本文中，术语“PB” (Phosphate Buffer)为磷酸盐缓冲液，其根据需要调节至合 适的PH。本领域技术人员可以理解，“PB”前面的浓度是指磷酸盐的浓度，例如IOmM PB是 指磷酸盐在缓冲液中的浓度为10mM。在本发明中，所述融合蛋白是将表达载体在宿主菌中表达而获得的，所述表达载 体含有编码硫氧还蛋白-(His)6-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)6H 氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11的核苷酸序列。优选地，所述宿主 菌为大肠杆菌BL21(DE3)。为了获得本发明的融合蛋白，优选先构建能够表达该融合蛋白的表达载体。该表 达载体可以通过将编码IL-Il的DNA序列插入到受启动子控制下的Trx基因的下游而构 建完成。如背景技术部分所述，Trx是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白， 该蛋白也是目前常用的IL-Il表达宿主例如酵母或大肠杆菌的内源蛋白。该蛋白可在细 胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，Trx能与许多蛋白发生相互作用，增强融合蛋白 的溶解性，从而减少了包涵体的形成(Thomas, J. G.等，Appl Biochem Biotechnol. 66 (3) 197-238)。在本发明中可以使用完整的Trx，也可以使用Trx的一部分或其突变体，所选取 的部分或突变体具有与Trx相同或相似的空间结构和功能。本发明的表达载体可以是酵母菌的表达载体，也可以是大肠杆菌的表达载体。所 述的IL-Il可以是完全人工合成的新DNA序列，也可以为已经公开的编码IL-Il的DNA序 列。为了将编码IL-Il的DNA序列插入Trx基因的下游，优选使用已经含有所述Trx基因 或其部分序列的克隆载体。这种载体也可通过购买得到。例如，pET32a(+)就是这样一种 载体。pET32a(+)可以高效表达的Trx-Tag的多肽，外源基因插入其多克隆位点后，产生的融合蛋白含有可剪切的Trx-Tag和S-Tag序列，便于检测和纯化。为了大量制备IL-11，需要将构建的重组表达载体转化适当宿主的感受态细胞，例 如酵母细胞或大肠杆菌细胞，并在适当的培养基中进行发酵，以收获融合蛋白。在本发明的 一个具体实施例中采用的宿主细胞是可市售得到的E. coli BL21(DE3)。该细胞的胞内和胞 间周质蛋白酶均已失活，这样当进行外源蛋白的可溶性表达时，不容易被宿主菌的蛋白酶 水解，因而可稳定存在。为了在发酵期间进行有效的控制，通常建议可诱导型的表达载体。pET系列载体就 是这样一类大肠杆菌表达载体。该载体是利用T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统构建的 E. coli表达载体，即在E. coliBL21(DE3)或JM109(DE3)的染色体上整合了 T7RNA聚合酶基 因，而且受Iac操纵子调控。所以，当用IPTG诱导时，导致T7RNA聚合酶的合成，从而诱导了 PET载体上的目的基因的表达。T7噬菌体RNA/启动子具有很强的启动活性，而且在载体多 克隆位点序列上游有强核蛋白体结合序列(rbs)，所以pET载体可以高效地表达外源蛋白。所述的发酵培养基根据宿主的不同而异。在选用大肠杆菌为宿主、以PET系列载 体为表达载体的情况下，发酵培养基可以为LB、TB、M9CA等，优选为TB培养基。发酵温度为 30-40°C，优选为37°C;pH6. 8-7. 2，优选为pH7. O ；溶氧DO彡30%，诱导用的IPTG终浓度为 0. 3-3. OmM，优选为1. OmM ；诱导时间为3_釙，优选为3. 5_4h。在上述适宜的条件下，可使发 酵液浓度达到60g细菌湿重/L发酵液以上，目的融合蛋白表达量在30%以上。临床前药效学试验、毒理学试验研究表明本发明制备的rhIL-11皮下注射对血 小板计数具有明显的升高作用，但对全红细胞计数、血红蛋白含量及红细胞压积、对白细胞 计数未见明显影响。其安全剂量为50yg/kg/天。因此，本发明制备的rhIL-11用于人体 治疗是安全有效的。本发明将rhIL-11与亲水性的Trx—段序列融合，该融合蛋白在胞内以可溶形式 表达，避免了工艺复杂且收率较低的包涵体复性步骤。融合蛋白含His-Tag，从而可以通过 镍离子螯合亲和层析法快速、简便、高效地纯化，大大提高了回收率。Trx与rhIL-11间存在 肠激酶切割位点，保证纯化的融合蛋白经肠激酶切割后可以释放完整的rhIL-11。采用肠激 酶将表达出的融合蛋白酶解，并利用一系列的柱层析法将目的蛋白rhIL-11纯化出来，纯 度可达到99%以上。


图1为重组表达质粒ρΕΤ-IL-ll的鉴定图谱。各泳道分别代表M为DNA分子量标 准(GeneRuler Ikb DNA Ladder Plus, fermentas) ； 1 为以含合成 DNA 片段的 pUC18 为模板 的PCR扩增产物；2为重组子ρΕΤ-IL-ll的PCR扩增产物；3为pET3h_Kpn I/EcoR I双酶 切产物；4为重组子ρΕΤ-IL-ll的Kpn I/EcoR I双酶切产物；5为重组子pET_IL_ll质粒； 6为pET32a质粒。图2为工程菌发酵表达的SDS-PAGE电泳分析，其中M为蛋白质分子量标准；1为 诱导前的工程菌；2为工程菌诱导表达后的发酵菌。图3为rhIL-11各步纯化样品的SDS-PAGE电泳分析，其中M为蛋白质分子量标 准；1为经镍离子螯合亲和层析得到的融合蛋白；2为融合蛋白经EK酶作用后的酶切产物； 3为酶切产物经镍离子螯合亲和层析后的目的蛋白；4为阳离子交换柱CM层析后得到的rhIL-llo图 4 为 rhIL-11 的 RP-HPLC 图谱。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本 发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要 不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1表达rhIL-11的DNA序列的设计本发明表达的人白细胞介素11的氨基酸序列与天然人白细胞介素11相比，缺失 了 N端的第一个氨基酸(即脯氨酸)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。编码该rhIL_ll 的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。根据SEQ ID NO 2中所列的IL-Il编码序列，在3，端引入终止密码TAA,并在5， 端引入肠激酶酶切识别位点的DNA编码序列GACGACGACGACAAG。将这样的DNA序列命名为序 列3(见SEQID NO :3)，采用全基因合成的方式委托上海生工生物工程技术服务有限公司人 工合成该序列。为便于以后的亚克隆，将合成基因克隆到PUC18 O^rmentas Life Science 公司)上，用于该合成的DNA序列保存和进一步克隆。重组质粒的构建如无特别说明，以下分子克隆技术操作方法均参照下列文献进行《分子克隆实验 指南》(第三版)(黄培堂等译，[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002)。DNA操作中所用 的DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。DNA连接试剂盒购自NEB公司。DNA Marker、克隆载体pUC18、限制性内切酶、PCR相关试剂等购自i^ermentas Life Science公 司。表达载体PET3M (+)、大肠杆菌T0P10及BL21 (DE3)均为Novagen公司产品，并且购自默 克化工技术(上海)有限公司。克隆用大肠杆菌宿主为Τ0Ρ10(基因型F-，mCrAA (mrr-hsd RMS-mcrBC) , φ 80，lacZAM15, Δ lacX74, recAl, araA 139Δ (ara-leu) 7697，galU, galK，rps，(Strr) endAl，nupG)，表达用大肠杆菌宿主为BL21 (DE3)(基因型为hsdS gal(A dts857 indlSam7 nin5 lacUV5_T7 genel)。BL21(DE3)带有 T7RNA 多聚酶基因， 在IPTG的诱导下T7RNA多聚酶大量产生，因而开启了外源基因的表达，可使外源基因高效 表达。LB培养基配方为蛋白胨，0.5%酵母粉，NaCl ；LB琼脂糖平板配方为蛋 白胨，0.5%酵母粉，NaCl，2%琼脂糖。其中蛋白胨和酵母粉购自英国Oxid公司。1.准备目的基因片段合成rhIL-11基因的PCR扩增引物。为了便于进一步克隆，在上游引物Pl中引入 Kpn I酶切位点GGTACC，在下游引物P2中引入EcoR I酶切位点GAATTC。引物序列如下上游弓丨物 Pl :5，ctgggtaccgacgacgacgacaaggggcc 3，下游弓丨物 P2 :5，tccgaattcttacagccgagtcttcagca 3，以含有rhIL-11编码序列的pUC18质粒DNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增， 在1 %的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用凝胶DNA回收试剂盒回收该片段。用Kpn I/EcoR I双酶切该回收片段，纯化备用。2.准备表达载体片段
用DNA抽提试剂盒提取pET3h(+)质粒DNA，用Kpn I/EcoRI双酶切，的琼脂糖 凝胶电泳分离大片段，切下含有大片段的凝胶，用凝胶DNA回收试剂盒回收大片段，电泳验 证后备用。3.构建重组质粒pET-IL-11将1、2准备好的DNA片段用T4DNA连接酶在16°C连接30min，连接产物转化大肠 杆菌T0P10感受态细胞，涂布于含有ΙΟΟμ g/mlAmp的LB琼脂糖平板，37°C培养过夜。4.重组子筛选在转化菌平板上挑取阳性菌落，在5ml含100 μ g/ml Amp的LB培养基中37°C培养 过夜，用DNA抽提试剂盒提取质粒DNA。分别用Kpn I, EcoR I对所提取的DNA酶切，然后 进行的琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子，阳性重组质粒命名为ρΕΤ-IL-ll。进一步以P1、P2 为引物，对ρΕΤ-IL-ll进行PCR验证。阳性重组质粒的鉴定结果见图1。5.质粒ρΕΤ-IL-ll的序列测定将质粒ρΕΤ-IL-ll进行测序验证，测序结果证明构建的阳性重组质粒pET_IL_ll 中的rhIL-11 DNA序列及其插入位置与理论设计完全一致。工程菌的诱导表达用重组质粒pET-IL-11 DNA转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到用于表达rhIL-11融合 蛋白的基因工程菌。挑取菌落，在5ml含ΙΟΟμ g/mlAmp的LB培养基中37°C培养过夜，以 1 %的体积转接于50ml含100 μ g/ml Amp的LB培养基中37°C培养，剩余菌液用15%甘油分 装冻存。当培养至OD6tltl达到0. 5时，加入IPTG到终浓度0. 5mM进行诱导表达，4小时后取 样进行SDS-PAGE电泳。与未诱导的对照相比，诱导后的重组子均有预期分子量36kDa左右 的表达带。取阳性菌株以进一步进行表达实验，表达及传代稳定后，选此菌株作为工程菌， 命名为BL21 (DE3) -IL-11，置甘油中保存。工程菌中融合蛋白的表达量占全菌蛋白的30 % 以上。工程菌BL21(DE3)-IL-Il 的发酵取表达Trx-rhIL-11融合蛋白的工程菌BL21(DE3)-IL-Il的甘油菌种(ImL/支)， 接种到500mL的LB液体培养基中，在37°C、250rpm下培养15hr。按7. 5%的接种量将此 种子液接入已灭菌的15L TB液体培养基中(30L B. Braim发酵罐)进行发酵，其中温度为 37°C、pH7. 0、DO2 >30%。补料根据溶氧及pH变化进行反馈控制，营养物质缺乏时，溶氧 上升，PH也上升，此时进行补料。培养至0D_ = 12时开始诱导表达，加入终浓度为ImM的 IPTG，诱导4h。在此条件下，最终菌体密度为31. 7g细菌湿重/L发酵液，目的融合蛋白表达 量32% (见图2)。表ITB培养基配方
权利要求
1.一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为硫氧还蛋白-(His)6-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)6-硫氧还 蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11 ；2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产物包 含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11 ；和3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白和所 述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得重组 人白细胞介素11。
2.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步 骤3)中使用洗脱液A、B和C进行所述梯度洗脱，其中所述洗脱液A为20 IOOmM Tris, pH7. 0 8. 5 ；所述洗脱液 B 为 20 IOOmM Tris-HCl,0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5 ；所 述洗脱液 C 为 20 IOOmM Tris-HCl，10 50mM 咪唑，0. 1 1. OM NaCl，pH7. 0 8. 5。
3.根据权利要求2所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述洗脱液 A 为 50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脱液 B 为 50mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，pH8. 0 ；所述洗脱液 C 为 50mM Tris-HCl，30mM 咪唑，0. 5M NaCl，pH8. 0。
4.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述重组人 白细胞介素11具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步骤 1)和2、之间还使用镍离子螯合亲和柱层析法利用洗脱液D、E和F对所述融合蛋白进行纯 化，其中所述洗脱液D为50mM Tris,500mM NaCl,30mM咪唑，pH8. 0 ；所述洗脱液E为50mM Tris, pH8. 0 ；所述洗脱液 F 为 IOOmM Tris, IOOmM 咪唑。
6.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述蛋白水 解酶识别位点为肠激酶识别位点。
7.根据权利要求6所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述酶切步 骤包括a)配制反应液，其含有lmg/mL的所述融合蛋白；20mMTris-HCl, ρΗ8· 0 ；1 体积％ Tween 20 ；和b)按IU所述肠激酶切割7mg所述融合蛋白的比例加入所述肠激酶，在18°C、44rpm下反应15h至18h。
8.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，在所述步骤 3)后还使用阳离子交换柱层析法对所述重组人白细胞介素11进行纯化，其中所述阳离子 交换介质为快流速CM琼脂糖凝胶，洗脱液为洗脱液G和H，所述洗脱液G为20mM NaCl, IOmM PB, pH7. 0 ；所述洗脱液 H 为 300mM NaCl, IOmM PB, pH7. 0。
9.根据权利要求1所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述融合蛋 白是将表达载体在宿主菌中表达而获得的，所述表达载体含有编码硫氧还蛋白-(His)6-蛋 白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)6-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位 点-重组人白细胞介素11的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的制备重组人白细胞介素11的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
全文摘要
本发明提供一种制备重组人白细胞介素11的方法，该方法包括1)提供融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次为硫氧还蛋白-(His)6-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11或(His)6-硫氧还蛋白-蛋白水解酶识别位点-重组人白细胞介素11；2)用所述蛋白水解酶对所述融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物，所述酶切产物包含硫氧还蛋白和重组人白细胞介素11；和3)使用镍离子螯合亲和柱层析法对所述酶切产物进行纯化，其中所述硫氧还蛋白和所述重组人白细胞介素11均被吸附到所述柱上，然后对所述柱进行梯度洗脱，从而获得rhIL-11。利用本发明的方法可快速、简便、高效地纯化rhIL-11，从而大大提高回收率。
文档编号C07K1/22GK102140487SQ201010107440
公开日2011年8月3日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者何凯, 叶学君, 张仁怀, 张风豪, 杨立明, 汪猜, 阳勇, 韩为跃 申请人:东莞太力生物工程有限公司