专利名称：一种抗肿瘤人源单链抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种人源抗体。具体地说是一种具有抗肿瘤活性的特异性识别CDK4 蛋白的人源单链抗体的基因获得及活性表征。
背景技术：
肿瘤是威胁人类生命健康的主要杀手，目前尚缺乏有效治疗手段。肿瘤细胞恶性增殖的主要原因之一是细胞周期失控。Evan GI等2001年在 Nature,2001,411 :342-348中提出细胞周期调控机制的核心是周期蛋白依赖性蛋白激酶 (cyclin-dependent kinases, CDKs)时相性激活。CDKs 是一类 kr/Thr 蛋白激酶，其活性 依赖于与周期蛋白(Cyclin)的结合。CDKs的异常活化将导致细胞周期失控，从而诱发肿 瘤的形成。Malumbers M 等 2005 年在 Trends in Biochemical Sciences, 2005, 30 (11) 630-641中总结提出，目前已发现11种同源的CDK分子，即CDKl 11。其中Matsushime等 1992年在Cell, 1992，71 (2) :323-334中最早分离得到CDK4基因，CDK4基因定位于染色体 12ql3 14，mRNA序列全长为2. 14kb，其cDNA开放读码框架为912bp，编码303个氨基酸 的蛋白质，分子量约为34kD，与⑶K2非常接近。⑶K4主要存在三个功能区在9 观个残 基之间，是ATP的结合部位和该酶的活性部位；在42 51个残基之间，是调节亚基的结合 部位；在177 208个残基之间，是pl3的结合部位。因为⑶K4分子中缺乏典型的PSTA^ 序列，故CyclinA、Cyclin B和Cyclin E均不能激活CDK4，只有Cyclin D家族成员对CDK4 具有活化功能。Sherr CJ and Roberts M 2004 年在Genes Dev,2004,18 :2699-2711 中指出 CDK4 作为细胞进入增殖周期第一个被激活的周期蛋白依赖性蛋白激酶，通过与CyclinDl结合 形成有活性的CyclinDl/CDK4激酶复合物，促进细胞GO — S期的转换，是细胞周期进程中 G1/S 期转换的限速因子。Deshpande A 等 2005 年在 Oncogene，2005，24 :2909-2915 中提 出在许多肿瘤细胞中存在CDK4过度表达和过度活化，与肿瘤的发生、发展有着密切关系。 Bonin S 等 2006 年在 Virchows Archiv, 2006,448 (5) :539-544 中发现 CDK4 与肿瘤的预后 密切相关。美国Reddy等人2005年在Cancer Res, 2005,65 (22) :10174-10178的研究结果 显示⑶K4的表达是导致一些乳腺癌发生的必要因子，并提出抑制⑶K4活性的治疗可能是 治疗乳腺癌高度特异性的途径。哈佛医学院的Yu等2006年在Cancer Cell, 2006,9 (1) 23-32中对CDK4基因敲除鼠模型的最新研究结果表明，乳腺癌的发生、发展需要CDK4激酶 的持续活化，因此，Malumbres M 和 Barbacid M 2006 年在 Cancer Cell, 2006,9 (1) :2_4 中 也提出抑制CDK4激酶活性将有利于乳腺癌治疗。这些结果都为CDK4作为肿瘤治疗的一个 有效靶点提供了实验依据。Dai Y禾口 Grant S 2004 年在 Curr Oncol Rep, 2004,6 (2) 123 中提出抑制 CDK4 催 化活性的小分子化合物能够阻滞肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制CDKs活性的研究将为 肿瘤治疗药物的设计提供新思路。桑建利等1999年在科学通报，1999,44(2) :184中利用反 义RNA抑制乳腺癌细胞中CDK4基因的表达，致使细胞的增殖速率和致瘤性明显降低，抑制肿瘤细胞增殖。Grillo M 等 2006 年在 Breast Cancer Res Treat, 2006,95 (2) :185-194 中 证实通过应用针对⑶K4的siRNA作用于肿瘤细胞时，肿瘤细胞的生长均得到了控制。这些 研究成果表明，抑制CDK4活性均能抑制肿瘤细胞增殖，CDK4是肿瘤治疗的一个有效靶点。但上述抑制CDK4活性的抗肿瘤治疗研究中存在如下问题和缺点首先，小分子抑 制剂的特异性和肿瘤细胞靶向性问题很难解决，这样就会产生明显的毒副作用；其次反义 技术及RNA干扰技术存在相对不稳定、作用范围较窄等问题。因而不能实现CDK4的靶向、 高效灭活。单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由弹性连接肽(一般为12-15 个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，其分子量 只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最 大程度的保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的最小片段。单链抗 体出现以后，人们在研究单链抗体的过程中，发现单链抗体具有一些无可比拟的优越性，所 以人们就利用现有技术对单链抗体进行了改造和修饰，以完善单链抗体的功能和发展新的 用途，其中胞内抗体(intracellular antibody or intrabody)技术是近年来，随着人们对 抗体工程和细胞内信号传导的深入研究，派生出一项全新的可阻断细胞内重要靶蛋白的抗 体技术。胞内抗体技术可以通过添加细胞核定位信号或内质网滞留信号等方法对抗体分子 进行适当修饰，使之定向分布于细胞核、细胞浆或某些细胞器中，从而特异性干扰或阻断分 布于该部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌过程，引起细胞的一系列生物过程发生 改变，从而达到结合和失活任一胞质结构的作用，实现重要靶分子的表型敲除。它是继反义 RNA、特异性核酶、显性负突变、自杀基因等技术之后又一新型基因治疗途径。并且与新发展 起来的RNAi技术相比，胞内抗体能够高特异性、高稳定性地作用于细胞内的蛋白质，在抗 肿瘤基因治疗中具有巨大潜力和应用前景。
发明内容
鉴于上述抑制⑶K4活性的小分子抑制剂存在的缺乏特异性和肿瘤细胞靶向性造 成的毒副作用及反义技术及RNA干扰技术存在的相对不稳定、作用范围较窄等问题，本发 明的目的是提供一种低毒、高效、特异、稳定的抑制CDK4的活性分子，即抗CDK4人源单链抗 体，并实现其在细胞内有效敲除CDK4的表型功能，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。为 了实现上述目的，本发明的技术方案是一种抗肿瘤人源单链抗体是特异性抗人CDK4人源单链抗体，其核苷酸序列如 Sequence NO. 1 所述。本发明的一种抗肿瘤人源单链抗体还包含核定位信号肽NLS、E_tag标签肽基因 编码序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。 一种抗肿瘤人源单链抗体，在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。本发明所述的抗肿瘤人源单链抗体的应用，所述的肿瘤为人乳腺癌和人宫颈癌。以重组人⑶K4蛋白为抗原，通过“吸附-洗脱-扩增”淘选过程从人源噬菌体抗 体库中筛选获得特异性抗人⑶K4蛋白的单链抗体基因ANK4，进一步通过原核表达、ELISA、 Western blot和免疫沉淀等技术，对ANK4蛋白进行活性表征，即获得特异性的抗人CDK4人 源性单链抗体。由于细胞核是CDK4的主要活化功能区，为了实现ANK4特异性干扰或阻断分布于细胞核的CDK4的活性，实现CDK4的表型敲除，从而发挥ANK4的抗肿瘤作用，进一步 以ANK4为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)克隆入细胞核定位信号，E-tag检测信号，添加 相应酶切位点，即获得抗CDK4人源胞内单链抗体基因NANK4，进而将其亚克隆到真核表达 载体pcDNA3. 1中，从而构建了重组细胞核定位型抗CDK4人源胞内单链抗体基因的真核表 达载体pNANK4。将构建的真核表达载体PNANK4转染人类乳腺癌MCF-7细胞株和人类宫颈 癌HeLa细胞株后，对重组细胞核定位型抗⑶K4人源胞内抗体基因的表达情况、定位情况以 及体外生物活性进行了系列研究，结果表明，抗CDK4人源单链抗体ANK4添加细胞核定位信 号后获得的细胞核定位型抗CDK4人源胞内单链抗体基因(NANK4)能够在肿瘤细胞中有效 表达并实现ANK4的目标定位。该基因的稳定表达能够显著抑制细胞生长和增殖，引起细胞 周期阻滞，并明显诱导细胞凋亡。本发明具有如下优点本发明中所获得的人源抗CDK4单链抗体ANK4是一种低毒、 高效、特异的抑制CDK4的活性的分子，由于该抗体为人源性抗体，避免了异源抗体用于人 体的毒副作用，该抗体是小分子的单链抗体，具有分子量小、免疫原性低等优点，克服了以 往单克隆抗体分子量大、免疫原性高的缺点，另外可以通过引入细胞核定位信号，进一步重 组到真核表达载体中，使该单链抗体在细胞内特定部位高效、稳定结合、灭活CDK4功能，为 肿瘤治疗开辟新途径。另外，还可以通过使用肿瘤特异性真核表达载体，进行该抗体的肿瘤 靶向治疗，实现该治疗基因的可控性，这样不仅能充分发挥抗体的抑瘤作用，而且具有肿瘤 特异性，确保治疗的安全有效。
图1.噬菌体抗体与⑶K4抗原结合能力测定。图2. ELISA法检测可溶性单链抗体与⑶K4蛋白的结合活性。图3. SDS-PAGE分析ANK4的可溶性表达及纯化。1.蛋白分子量标准；2为 ANK4/HB2151载体对照菌；3和4分别为ANK4/HB215IIPTG诱导前、后菌体沉淀；5. ANK4/ HB215IIPTG诱导上清；6.样本5经镍柱流出液；7. 40mM咪唑洗涤流出液；8. 500mM咪唑洗 脱液。图 4. Western blot 鉴定 ANK4。1. ANK4/HB2151 未经 IPTG 诱导上清；2. ANK4/ HB2151IPTG诱导上清；3.纯化的ANK4蛋白。图5. Westernblot检测纯化的ANK4与重组人CDK4结合活性。1. pET28a-CDK4/ BL21IPTG诱导前菌体沉淀；2.纯化的重组人CDK4蛋白。V5Ab 抗V5抗体。图6· ANK4的亲和力测定。图7.抗⑶K4多克隆抗体对ANK4的竞争性抑制。A.只加入抗⑶K4多克隆抗体； B.同时加入抗CDK4多克隆抗体和ANK4 ;C.只加入ANK4。*p < 0. 01 vs A or C。图8. Western blot检测纯化的ANK4与MCF-7细胞内源性表达的⑶K4结合活性。 A.阴性对照组，NC膜不与ANK4蛋白孵育，直接与抗V5抗体作用。B.实验组，NC膜首先与 ANK4蛋白孵育，然后与抗V5抗体反应。以β-actin作为细胞裂解液Wfestern blot蛋白加 样的内参对照。V5Ab 抗V5抗体。图9.免疫共沉淀分析ANK4与细胞内源性表达的⑶K4结合活性。V5Ab 抗V5抗 体；CDK4Ab 抗 CDK4 抗体。
图10. NANK4的PCR扩增及重组表达载体pNANK4构建。其中A. PCR扩增结果。 1. DL-2000Marker ；2. PCR产物；3.纯化的PCR产物；B.重组表达载体pNANK4的鉴定。1. Ikb DNA ladder marker ；2.pcDNA3. 1 ；3.ρ ΝΑΝΚ4 ；4.pcDNA3. 1/Hind III+EcoRI ；5. pNANK4/ Hind III+EcoR I ；6. NANK4/Hind III+EcoR I ；7. DL_2000Marker。图11. RT-PCR分析NANK4在稳定转染细胞中的表达。图12.免疫荧光检测NANK4在稳定转染细胞中的表达及定位。A.MCF-7细胞； B. HeLa细胞。Hoechst 33342与细胞核区域结合，发出蓝色荧光。抗Ε-Tag抗体和FITC标 记的二抗检测细胞内表达的NANK4，发出绿色荧光，Merge是将同一区域的蓝色荧光和绿色 荧光叠加。图 13. Western-blot 分析 NANK4 在稳定转染细胞中的表达。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。图14.免疫共沉淀实验检测NANK4与⑶K4在细胞内的结合。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5.HeLa/pcDNA3. 1 ；6. HeLa/pNANK4。图15A. MTT法测定NANK4对MCF-7细胞的体外增殖活性影响。图15B. MTT法测定NANK4对HeLa细胞的体外增殖活性影响。图16.流式细胞仪检测NANK4对细胞周期影响。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3. MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。*p < 0. 01 vs MCF-7orMCF-7/pcDNA3. Iat the same phase, η = 3 ；**ρ < 0. 01 vs HeLa or HeLa/ pcDNA3. 1 atthe same phase,η = 3。图17. Armexin-V检测NANK4对细胞凋亡的影响。其中A为各组代表性图片；B为统 计学分析结果。1. MCF-7 ；2. MCF-7/pcDNA3. 1 ；3. MCF_7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ； 6. HeLa/pNANK4。*ρ < 0. 01 vs MCF-7 or MCF_7/pcDNA3. 1，η = 3 ;**p < 0. 01 vs HeLa or HeLa/pcDNA3. 1，η = 3。
具体实施例方式实施例1特异性抗人CDK4人源单链抗体的制备，为了便于阅读，本专利“特异性抗 人CDK4人源单链抗体”以下简称“ANK4”一、实验材料1.质粒和菌株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α、HB2151和XLl-Blue购自北京鼎国生物技 术有限责任公司。PUC119质粒购自大连宝生物工程有限公司。辅助噬菌体VCSM13购自 Stratagene 公司。2.分子克隆主要相关试剂细菌培养用胰化蛋白胨(tryptone)，酵母提取物(yeast extract)，购自Oxid公 司。原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人⑶K4蛋白参照曹玉华等2008年在吉林 大学学报(理学版)，2008，46 (5) =992-996中的方法制备；HRP/Anti_M13单克隆抗体购自 Pharmacia公司，抗V5单克隆抗体为Invitrogen公司产品；anti_CDK4antibody购自Santa Cruz Biotechnology公司。铁蛋白(Fer)和卵清蛋白(OA)、0PD、考马斯亮蓝R-250、G_250、 PMSF、Tris、BSA、抗生素(Amp、Tet)购自 Sigma 公司。His TrapHP Kit、PD-10 脱盐柱购自Amersham Bioscience。脱脂奶粉购自Bio-Rad公司。硝酸纤维素(NC)膜购自Amersham Bioscience。ECL发光试剂盒购自iTransgen生物技术公司。蛋白Marker、HRP标记羊抗小 鼠IgG、Eppendorf管、移液器枪尖等塑料耗材购自北京鼎国生物技术有限责任公司。其他 试剂均为分析纯的国产生化试剂。质粒提取、纯化试剂盒，购自Promega公司。3.相关溶液的配制参照《分子克隆实验指南》。二、实验方法 1.抗⑶K4人源单链抗体基因ANK4的筛选噬菌体人源单链抗体库的获得具体参照文献Sblattero D等Nat Biotechnol, 2000，18 74-80 及 Sblattero D 等 1998 年在 Immunotechnology, 1998，3 :271-278 的方法 进行，通过滴度测定表明，最终获得库容为IXlO11的噬菌体人源单链抗体库。抗体库的筛选采用固相化抗原免疫吸附筛选法，将人CDK4蛋白用0. 05mol/L碳酸 盐缓冲液稀释至ΙΟΟμ g/ml，以Iml包被免疫管(NUNC公司)，参照李春英等在中国皮肤性 病学杂志，2005，19 =388-390中所述方法对抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选。每 一轮筛选均测定次级库滴度，并计算噬菌体投入/产出比(回收率)，作为特异性噬菌体抗 体富集的指标。从第4轮筛选的菌落培养盘中随机挑取100个克隆，接种在2 X YT中培养，用辅助 病毒VCSM13超感染诱导培养过夜后，收集上清为噬菌体抗体。以10 μ g/ml的人⑶K4为 抗原包被ELISA板，经1 % BSA封闭后加入待测噬菌体抗体上清，以HRP/Anti-M13单克隆 抗体为二抗，孵育、洗涤后OPD底物显色；显色阳性的克隆再以人铁蛋白(Fer)和卵清蛋白 (OA)与目的抗原⑶K4同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性，所用二抗为HRP/ Anti-M13单克隆抗体，加入OPD显色后，读取A49tl值。将A49tl值阳性的特异性结合目的抗原的噬菌体抗体上清感染对数生长期的 冊2151菌株，371孵育301^11后涂布2\￥11平板(5(^8/1111 Amp)。次日挑取单个菌落于 2XYT培养液中培养过夜后以1 100稀释转接，培养到对数生长期，加入IPTG至终浓度 为lmmol/L，30°C诱导培养过夜，离心收集上清即为可溶性单链抗体。以2 μ g/ml人⑶K4包 被ELISA板，封闭后加入待检测表达上清，37°C孵育lh，洗涤后加入适当稀释的Anti-V5单 克隆抗体，37°C孵育1小时，洗涤后加入适当稀释的HRP-羊抗小鼠IgGj^AOPD显色后， 读取A49tl值。选择结合活性最高的克隆的噬菌抗体上清感染对数生长期的XLl-Blue菌株， 37°C孵育30min后涂布2 X YT平板(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)。次日挑取单个菌落于 2 X YT培养液(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)中培养过夜后，保存菌种并按Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒操作说明提取质粒，由上海生工生物工程 有限公司进行测序。2.抗⑶K4单链抗体ANK4的可溶性表达与纯化将ANK4克隆接种于400ml含Amp+抗性的2 X YT培养基中，ImM的IPTG诱导过夜 后离心收集上清。上清中加入40% -60%的硫酸铵进行低温沉淀，12000rpm离心20min收 集沉淀的蛋白，沉淀的蛋白经PH7. 4的0. OlM PBS溶解，透析、除盐；由于表达的抗⑶K4单 链抗体的C末端含有His-Tag，所以沉淀的蛋白经除盐后可以用His Trap HPKit进行纯化。 纯化时，His Trap HP Kit柱先用含10mmol/L咪唑的Binding Buffer平衡，将经过过滤的 蛋白溶液上柱，然后依次用Binding Buffer和含有咪唑的洗涤Buffer分别上柱清涤杂蛋白，以500mmol/L咪唑作为洗脱液，收集各个流出组份并进行SDS-PAGE电泳，确定最佳洗涤 浓度。纯化的蛋白用Bradford比色法测定蛋白含量。3. Western blot 分析鉴定 ANK4 抗体将纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳后；半干式转移槽IOOmA转移池，将蛋白转 移到硝酸纤维素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗涤之后放入5%脱脂奶粉-PBST中室温封 闭Ih ；将NC膜取出放入抗V5单克隆抗体(1 5000稀释于5%脱脂奶粉-PBST中)中室 温孵育；取出，PBST振荡洗涤3次，每次IOmin ；再将NC膜放入HRP标记的羊抗小鼠IgG 中(1 5000稀释于5%脱脂奶粉-PBST中)室温孵育Ih ；PBST中洗涤3次，每次IOmin ； ECL发光试剂盒检测目的条带的出现。三、结果与分析1.抗⑶K4人源噬菌体抗体的筛选经过4轮筛选，噬菌体抗体回收率得到约70倍富集，从最后1轮挑取的100个克隆 制备噬菌体抗体，用ELISA方法进行初筛，结果发现有15个可与人CDK4抗原结合的克隆， 再用铁蛋白O^er)和卵清蛋白(OA)作为对照抗原进行噬菌体ELISA鉴定，仅9个克隆的噬 菌体抗体能与人CDK4特异性结合，与无关抗原不具备结合特性(附图1)。2.可溶性单链抗体的表达及结合活性为了检测获得的噬菌体抗体与人CDK4的结合活性，将9个阳性克隆的噬菌体抗体 上清感染无琥珀抑制的菌株HB2151，IPTG诱导可溶性单链抗体表达，以人⑶K4包被ELISA 板，以可溶性表达上清、Anti-V5单克隆抗体和HRP-羊抗小鼠IgG为抗体，进行ELISA检测， 结果显示只有4个克隆具有特异性结合活性(附图2)。经测序和后续分析结果显示，结合 活性最高的7号克隆的基因全长744bp (序列见kquence No. 1)，编码248个氨基酸。该抗 体的轻链为λ链，能够与CDK4特异性结合，因此我们将其确定为抗CDK4人源单链抗体，命 名为ΑΝΚ4，并进行了 一系列研究。3.抗⑶Κ4人源单链抗体ΑΝΚ4的可溶性表达、纯化及鉴定将ΑΝΚ4/ΗΒ2151的IPTG诱导上清进行硫酸铵沉淀，沉淀经过溶解和透析后进行亲 和纯化。由于细菌蛋白可能含多聚组氨酸，且存在非特异性结合，为了得到纯度较高的蛋 白，曾进行过多次纯化条件摸索。当以含IOmM咪唑的结合缓冲液、含40mM咪唑的洗涤缓冲 液、含500mM咪唑的洗脱缓冲液纯化效果较好。结果如附图3所示，经SDS-PAGE分析，500mM 咪唑洗脱下来的溶液在约30kD处出现一条明显的蛋白条带。经过BandScan扫描分析，蛋 白纯度约为96%。将纯化的抗⑶K4单链抗体经过SDS-PAGE电泳后，以抗V5Tag单克隆抗 体为一抗对其进行Astern blot分析。结果如附图4所示，IPTG诱导的ANK4/HB2151上 清和纯化后的抗CDK4单链抗体样品泳道在30kDa处有特异性目的条带出现，而在未经诱导 的ANK4/HB2151上清中未检测到目的条带。这些结果表明已成功实现了抗⑶K4单链抗体 的可溶性表达和纯化。纯化得到的ANK4蛋白保存于_80°C，用于活性表征。实施例2抗⑶K4人源单链抗体ANK4的活性表征一、实验材料pEI^8a-CDK4/BL21 (DE3)菌株参照曹玉华等2008年在吉林大学学报(理学版)， 2008,46(5) :992-996中的方法制备。人乳腺癌MCF-7细胞株为吉林大学免疫教研室提供。 细胞培养用DMEM、小牛血清购自Gibco公司。DTT、胰蛋白酶、Protein G on Sepharose 4Bfast flow购自Sigma公司，抗β -actin鼠单克隆抗体购自Sigma公司，兔抗⑶K4多克隆 抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，HRP标记的羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术 有限责任公司。细胞培养板、培养瓶、细胞刮购自Costar公司。其余试剂及材料参照实施 例1。 二、实验方法 1. Western blot分析纯化的抗⑶K4单链抗体ANK4与重组人⑶K4的结合活性重组人⑶K4蛋白经12%的SDS-PAGE电泳后；半干式转移槽IOOmA转移2h，将蛋 白转移到硝酸纤维素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗涤之后放入5%脱脂奶粉-PBST中室温 封闭Ih ；将NC膜取出放入ANK4 (20 μ g/ml稀释于5%脱脂奶粉-PBST中)中室温孵育池； 再以抗V5抗体(1 5000稀释于5%脱脂奶粉-PBST中)为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG 为二抗，ECL发光试剂盒检测目的条带的出现。2.抗CDK4单链抗体ANK4亲和力的测定首先用经过2η梯度稀释的⑶K4蛋白100 μ 1于4°C包被聚苯乙烯板过夜；次日 弃上清，用0. 05% BSA-PBST 200 μ 1封闭Ih ；再加入经过2η梯度稀释的抗⑶Κ4单链抗体 100 μ 1室温孵育2h;弃上清，加入抗V5鼠单克隆抗体(以0.05% BSA-PBST按1 5000稀 释)孵育2h ；弃上清，再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05% BSA-PBST按1 5000 稀释)；以OPD为底物避光显色，读取0D490的值。然后按照公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)计 算抗CDK4单链抗体的亲和常数，η为抗CDK4单链抗体的稀释倍数，Ab和Abl分别表示当抗 原浓度为Ag和Agl时，l/2Max0D490对应的抗CDK4单链抗体浓度。3. ELISA法检测抗⑶K4多克隆抗体与抗⑶K4单链抗体ANK4的竞争性结合以10 μ g/ml的重组人CDK4蛋白包被ELISA板并4 °C过夜；次日以0. 05 % BSA-PBST封闭2h ；然后每孔加入50 μ 1纯化的抗⑶Κ4单链抗体ΑΝΚ4 (10 μ g/ml)，加入等 体积的兔抗⑶K4多克隆抗体作为竞争性抑制剂(以0. 05% BSA-PBST按1 2000稀释) 共同孵育(所得A490的值即抑制后A值)，以不加竞争性抑制剂作为阳性对照(所得A490 的值即抑制前A值)，以不加抗CDK4单链抗体而只加兔抗CDK4多克隆抗体为阴性对照，孵 育2h后加入50μ1抗V5鼠单克隆抗体(以0. 5000稀释)孵育2h， 再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05 % BSA-PBST按1 5000稀释)，以OPD为底物 避光显色，读取A49tl的值。用以下公式计算抑制率抑制率=100% Χ(抑制前A值-抑制 后A值)/抑制前A值4.MCF-7细胞的培养MCF-7细胞培养于含10%小牛血清的DMEM完全培养基中，37°C饱和湿度、5% C02 孵箱中培养。细胞贴壁生长，每3-5天胰蛋白酶消化细胞，传代培养。5. Western blot 实验将收集的MCF-7细胞(每管约2 X IO6个)加入20 μ 1 SDS-PAGE上样缓冲液，混勻 后冰浴30min，沸水煮样3-5min后进行12% SDS-PAGE电泳；半干式转移槽IOOmA转移2h， 将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗涤之后放入5%脱脂奶粉-PBST中 室温封闭Ih ；将NC膜取出放入抗⑶K4单链抗体ANK4 (20 μ g/ml稀释于5%脱脂奶粉-PBST 中)中室温孵育；再以抗V5抗体(1 5000稀释于5%脱脂奶粉-PBST中)为一抗，HRP 标记的羊抗小鼠IgG为二抗，ECL发光试剂盒检测目的条带的出现。
6.免疫沉淀实验将培养在6孔板中对数生长的MCF-7细胞用含ImM PMSF的冷PBS洗涤两次，每孔 加入500 μ 1细胞裂解液，用细胞刮子将其刮出，放于1.5ml Eppendorf管中，冰浴40min， 20%的能量超声两次，每次IOs ； 15000rpm 4°C离心IOmin ；取上清，加入纯化的抗⑶K4单 链抗体ANK4 (20 μ g/ml)，于4°C缓慢颠倒浊；再加入2 μ 1抗V5鼠单克隆抗体，于4°C缓慢 颠倒 2h;再加入 20μ1 Protein G onSepharose 4Bfast flow 4°C缓慢颠倒过夜,8000rpm 4°C离心3min，弃上清；加500 μ 1细胞裂解液洗涤一次；弃上清，500 μ 1冷PBS洗涤两次，弃 上清；沉淀加入20 μ 1 SDS-PAGE上样缓冲液，电泳，做Wfestern blot分析。Western blot 以抗CDK4兔多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，ECL发光试剂盒检测目的条 带的出现。三、结果与分析1.纯化的抗⑶K4单链抗体ANK4具有与重组人⑶K4的结合活性为了进一步检测抗⑶K4单链抗体与重组人⑶K4蛋白结合活性，以未经IPTG诱 导的pEI^Sa-⑶K4/BL21 (DE3)菌体沉淀为阴性对照，将其和纯化的重组人⑶K4蛋白经 SDS-PAGE后，转移到NC膜上，首先与抗⑶K4单链抗体结合，进而与抗V5抗体和HRP标记 的羊抗小鼠IgG反应，ECL显影观察，纯化的重组人⑶K4蛋白样品在约34kD处出现一明显 特异性条带，而阴性对照组中未发现目的条带(附图幻，这一结果进一步验证了纯化的抗 ⑶K4单链抗体可以特异性结合人重组⑶K4蛋白。2.抗CDK4单链抗体ANK4亲和力的测定应用非竞争性ELISA法，以抗体的浓度为横坐标，以抗原抗体反应的0D490值 为纵坐标作标准曲线(附图6)，根据曲线及计算公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)来计算 抗CDK4单链抗体的亲和常数，η为抗CDK4单链抗体的稀释倍数，Ab和Abl分别表示当 抗原浓度为Ag和Agl时，l/2Max0D490的抗体浓度。通过计算得到亲和力的值分别为 (1. 79士0. 42) Xl(T8mol/L。3.抗CDK4多克隆抗体竞争性抑制抗CDK4单链抗体ANK4与抗原结合为了检测抗CDK4多克隆抗体与抗CDK4单链抗体竞争性结合CDK4的能力，进行了 竞争性ELISA实验。纯化的抗CDK4单链抗体中混入兔抗CDK4多克隆抗体作为竞争性抑制 剂(以0. BSA-PBST按1 2000稀释)为实验组即抑制后，以只加抗⑶K4单链抗体不 加兔抗CDK4多克隆抗体作为阳性对照即抑制前，检测兔抗CDK4多克隆抗体与抗CDK4单 链抗体竞争结合重组人⑶K4的能力，结果如附图7所示，根据公式(抑制率=(抑制前A 值-抑制后A值)/抑制前A值xlOO 可以计算出兔抗CDK4多克隆抗体对抗CDK4单链 抗体ANK4的竞争性抑制率为38. 67%。实验组与阳性对照有显著性差异(ρ < 0. 01)。从 竞争性抑制率可以看出，兔抗CDK4多克隆抗体能够竞争性抑制抗CDK4单链抗体ΑΝΚ4结合 重组人CDK4。4.抗⑶Κ4单链抗体ΑΝΚ4能与肿瘤细胞内⑶Κ4蛋白结合 由于本实验所用的抗CDK4单链抗体是以原核表达的重组人CDK4蛋白为抗原从人 源噬菌体抗体库中筛选得到的，因此须对其是否具有结合天然状态下的CDK4蛋白的能力 进行检测。为此，我们分别采用了 Western blot和免疫沉淀技术来检测纯化的抗CDK4单 链抗体与肿瘤细胞内表达的CDK4是否有相互作用。
4. 1 Western blot为了检测抗CDK4单链抗体与细胞内源的CDK4蛋白结合活性，将收集得到的MCF-7 细胞裂解液经SDS-PAGE电泳，转移到NC膜上，首先与抗CDK4单链抗体孵育，进而与抗V5 抗体和HRP标记的羊抗小鼠IgG反应，ECL发光试剂盒显影。结果附图8所示，在约34kD处 出现一明显特异性条带(附图8B)，而在阴性对照组(未与ANK4反应，只加入抗V5抗体) 中未发现目的条带(附图8A)，以β-actin作为细胞裂解液ffesternblot蛋白加样的内参 对照，各组样品中β-actin均检测出清晰的β-actin条带。4. 2免疫沉淀将收集得到的MCF-7细胞裂解后在上清中依次加入抗CDK4单链抗体，V5单克隆抗 体和Protein G onSepharose 4B fast flow孵育，孵育沉淀进行SDS-PAGE和Westernblot 分析。Western blot检测时以抗⑶K4兔多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二 抗，由于抗⑶K4单链抗体引入V5标签，其表达产物具有结合抗V5抗体的活性，抗V5抗体 属于 IgG 型抗体，能与 Protein G onSepharose 4B fast flow 中的 ProteinG 结合，如果 抗⑶K4单链抗体能与⑶K4结合，则形成的复合物通过抗V5抗体间接的结合到ftOtein G 上形成免疫沉淀复合物，免疫沉淀复合物进行Western blot分析，当以抗CDK4兔多克隆抗 体为一抗进行检测时，如能够检测到相应的条带出现，则可说明抗CDK4单链抗体确实能特 异性结合细胞内CDK4蛋白。实验结果如附图9所示，在34kD处出现了特异性条带，而在不 加抗CDK4单链抗体的阴性对照组中无条带出现，进一步证明了抗CDK4单链抗体和CDK4结 合的特异性。实施例3抗⑶K4人源胞内单链抗体基因的克隆及重组真核表达载体的构建。为 了便于阅读，本专利“抗CDK4人源胞内单链抗体基因”以下简称“NANK4”一、实验材料1.菌株和质粒pcDNA3. 1(+)质粒购自Invitrogen公司；大肠杆菌E. coli JM109购自北京鼎国 生物技术有限公司。2.分子克隆主要相关试剂限制性内切酶Hind III、EcoR I，T4DNA连接酶及其相应缓冲液，Taq DNA聚合酶 及其相应缓冲液，dNTP购自大连宝生物工程有限公司。质粒提取纯化试剂盒购自Promega 公司。DNA回收试剂盒、核酸分子量标准(11Λ Ladder和DL-2000DNAMarker)购自北京鼎国 生物技术有限公司。琼脂糖凝胶电泳所需琼脂糖、溴化乙锭、Tris等购自Sigma公司。其 余试剂及材料参照实施例1和2。2.引物设计本实验所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体如下以 Pl (FP) (5’ -CCCAAGCTTATGGATCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCAGTCTGTGC TGACGCAGCC-3，)为正向引物，以 P2 (RP) (5，-GGAATTCTTAACGCGGTTCCAGCGGATCCGGATACGGCA CCGGCGCACCTGAAGAGACAGTGACCGGGGTTCC-3 ’)为反向引物引入核定位序列、检测标签及相应 酶切位点构建胞内抗体NANK4。二、实验方法( 一 ) NANK4基因片段的获得
1.聚合酶链式反应(PCR)为了通过定向克隆的方法制备抗人CDK4胞内单链抗体基因NANK4，并能构建入真 核表达载体PCDNA3. 1中，我们设计了 P1/P2两条引物。引物设计根据抗CDK4人源单链抗 体基因序列及不同亚细胞区滞留型胞内抗体基因序列，并依据PCR引物设计原则引入符合 阅读框的起始密码子和终止密码子以及相应的酶切位点。具体序列见材料部分。以从人源噬菌体单链抗体库中筛选到的抗CDK4人源单链抗体基因ANK4序列为模 板，用PCR的方法扩增细胞核定位的抗人CDK4胞内单链抗体(NANK4)基因。PCR反应体系10 X Ex10 μ 1
Taq buffer8μ 1
dNTPs(2. 5mM each)2 μ 1 (respectively)
Pland P2(20 μ Μ)0. 5μ 1
Template(lOOng/μ 1)0. 5μ 1
ExTaq(5U/μ 1)77 μ 1
dd H2O
Total100 μ 1
操作程序(1) 94 "C，4min ； (2) 94 "C，45sec ； (3) 55 "C，45sec ； (4) 72 "C，45sec ；(5)72°C,10min.其中(2)-(4)进行 30 个循环。
2. PCR扩增产物的回收
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、按照DNA回收纯化试剂盒回收并检验。
(1)电泳结束后，在凝胶成像仪上用手术刀切取含目的片段的琼脂糖；( 放入预
先称量好的Eppendorf管中，称重，捣碎，按1 3 (重量/mg 体积/ μ 1)的比例加入溶液 A ； (3) 50°C金属浴lOmin，至胶完全溶解，在室温下，加入溶液B，充分混勻，溶液分别转移至 离心柱内静置2min，8500rpm离心Imin弃液体(溶液若一次加不完，可以分两次离心)；(4) 弃液体，加入500 μ 1溶液C，8500rpm离心Imin弃液体；重复一次；(5) 12000rpm离心Imin, 甩干剩余液体，除去残余酒精；(6)将离心柱置于新的离心管中室温敞盖8min，使乙醇挥发 尽；⑵加预热溶液D，15000rpm离心lOmin，管底即为目的DNA。取少量DNA进行琼脂 糖凝胶电泳，检验回收片段的纯度与浓度。3.目的片段的酶切与回收回收的PCR扩增片段产物的HindIII和EcoR I双酶切反应体系ddH2012 μ 1IOXM buffer4μ 1HindIII2μ 1EcoRI2μ 1回收的PCR扩增片段20μ1_40 μ 1 上述混合液于37°C金属浴消化1. 5_2h，产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约 870bp的目的片段(方法同上)，1%琼脂糖凝胶电泳检验其回收效果，-20°C保存备用。
( 二)pcDNA3. 1载体片段的获得将质粒pcDNA3. 1进行Hind III和EcoR I双酶切，37°C消化1. 5_浊，1 %琼脂糖凝 胶，98mA电泳30-40min分离约5. 4kb的目的片段。载体质粒pcDNA3. 1的酶切体系如下
0125]ddH2012 μ 1
0126]IOXM buffer4μ 1
0127]Hind III2μ 1
0128]EcoRI2μ 1
0129]pcDNA3. 120 μ 1
0130]_
0131]40 μ 1用DNA回收试剂盒回收载体片段pcDNA3. 1，方法同上。1 %琼脂糖凝胶电泳，检验 回收片段。(三)载体与目的基因的连接将目的基因片段和pcDNA3.1酶切大片段通过 T4DNA连接酶连接，获得重组质粒ρΝΑΝΚ4。构建过程见图1。连接体系如下
0134]dd H2O8. 5μ 10135]T41igase buffer2μ 10136]T41igase1 μ 10137]pcDNA3. 1 片段0. 5μ 10138]NANK4片段8μ 1_20 μ 1混勻，16°C金属浴连接12_16h。(四)JM109感受态细胞的制备(1)以无菌接种环刮取冻存于_80°C冰箱的JM109菌种，划线接种于不含氨苄青霉 素(Amp)的LB琼脂平板，37°C培养1 左右；( 挑取单一菌落接种到5ml液体LB培养基 中，37°C ISOrpm振摇培养至0D60。= 0. 4 ； (3)将细菌培养管取出，迅速置于冰浴中15min 以上，使培养物冷却到0°C ； (4)在无菌条件下将细菌培养液转移到无菌、冰预冷的1.5ml Eppendorf管中(以下操作均需无菌)，4°C、4000rpm离心lOmin，弃上清；(5)以500 μ 1冰 预冷的0. lmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min ； (6) 4°C、4000rpm离心lOmin，收集 菌体，经80 μ 1冰预冷的CaCl2重新悬浮菌体，将感受态细胞置于4°C冰箱冰浴中备用。(五)质粒转化(1)将每管80 μ 1感受态细胞加入到20 μ 1连接产物中，轻轻混勻，冰浴30min ； (2)将管放入42°C金属浴中，热休克anin;(3)快速转移到冰浴中，冷却aiiin ； (4)每管加 Λ 900 μ 1 37°C预热的 LB 液体培养基，37°C、150rpm 振荡培养 45min ;(5)4000rpm、4°C离心 5min ； (6)弃700-800 μ 1上清，用余下上清重悬细胞，涂布于含100 μ g/ml氨卞青霉素抗性 (Amp)的LB琼脂培养基中，静置IOmin ；37°C倒置培养12 16h，出现重组子菌落。转化菌 盘4°C保存备用。(六)表达质粒pNANK4的鉴定
1.表达质粒pNANK4的小量提取与纯化(参照《分子克隆实验指南》碱裂解法小量 提取质粒)(1)挑取转化细胞单个阳性克隆，接种于5ml含100 μ g/ml Amp+的LB液体培 养基中，37°C、180-200rpm振荡培养12 16h ;(2)菌液分装于1. 5ml Eppendorf管中， 15000rpm、4°C离心5min收菌体沉淀；(3)加入0. ImL冰预冷的溶液I，吹悬沉淀，静置5min ； ⑷加入现配的0. 2mL溶液II，颠倒混勻；(5)加入0. 15mL冰预冷溶液III，轻轻颠倒混勻； (6)冰浴15min，15000rpm 4°C离心5min ； (7)收集上清，加入2. 5倍体积的无水乙醇，室温 静置20min ； (8) 15000rpm 4°C离心15min ； (9)弃上清，加入2. 5倍体积预冷的70%乙醇洗 涤，15000rpm 4°C离心5min ； (10)弃上清，控干，真空旋转蒸发干燥；(11)沉淀溶于50 μ 1 TE中(含50 μ g/ml RNaseA)，37°C 30min, 1 %琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。2.重组质粒的酶切鉴定利用限制性内切酶消化法初步检验提取的重组质粒。将重组质粒进行Hind III 和EcoR I双酶切，37°C消化1. 5-浊，琼脂糖凝胶，98mA电泳30-40min，凝胶成像分析仪 上观测。pNANK4质粒的Hind III和EcoR I双酶切反应体系ddH206 μ 1IOXM buffer2μ 1Hind III1 μ 1EcoRI1 μ 1pNANK410 μ 1_20 μ 13.重组质粒的序列测定由上海生工生物工程有限公司进行测序。三、结果与分析为了获得定位于细胞核的抗CDK4人源胞内单链抗体基因，我们以抗CDK4人源单 链抗体ΑΝΚ4基因为模板，用含有细胞核定位信号、Hind III和EcoR I酶切位点序列以及 E-tag标签肽序列的引物，通过PCR的方法扩增细胞核定位型抗CDK4人源胞内单链抗体 NANK4基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后发现，在约860bp处有一明显的DNA条带(见 附图10A)；产物回收后克隆到真核表达质粒pcDNA3. 1的CMV启动子下游的限制性内切酶 Hind III和EcoRI之间；阳性重组质粒经限制性内切酶Hind III和EcoRI双酶切，琼脂糖 凝胶电泳发现，在^OObp和840bp处分别出现一条明显的DNA条带(见附图10B)。进一 步通过T7和BGH通用引物正反双向测通载体pNANK4上的目的片段，测序结果表明，插入序 列与实验设计一致，并且读码框完全正确，这说明通过PCR扩增成功地引入了细胞核定位 信号、E-tag检测标签等，NANK4基因全长834bp (序列见kquence No. 2),编码278个氨基 酸。这说明我们已成功获得了重组胞内抗体NANK4基因的真核表达载体PNANK4。实施例4抗CDK4单链抗体抗肿瘤活性分析一、实验材料1.分子生物学相关试剂及材料
去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；逆转录PCR(RT_PCI )试剂盒购自大连 宝生物工程有限公司；其余参照实施例1-3。2.细胞培养及转染及活性检测试剂及材料脂质体(Lipofectamine2000)、G418、Trizol 为 hvitrogen 公司产品；DMS0、MTT、 溴化丙啶(PI)、RNase A、Hoechst 33342购自Sigma公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技 术有限公司；抗E-tag抗体购自Wiamarcia公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉 金桥生物技术公司；Armexin V凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；其余同 实施例1-3。3. RT-PCR所需引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。(1) RT-PCR扩增胞内抗体弓丨物序列正向引物P3为5’ -CCCAAGCTTATGGGATGGAGCTGT-3，， 反向引物P4为5’ -GGTAC0GCT0GAGGATAACT-3‘，扩增产物为460bp ；⑵扩增细胞内β -actin合成 的引物序列正向引物 P5 为 5，-TGGMTCCTGTGGCATCCATGMAC-3，，反向引物 P6 为 5，-TAMA0GCAGCT CAGTMCAGTC0G-3，。4.相关溶液的配制参照《分子克隆实验指南》。二实验方法1.转染用质粒的准备(参照去内毒素质粒提取试剂盒说明书)1.1使用前准备工作将试剂盒中附带的RNaseA加入Solution I中，4°C保存；向DNA Washing Buffer 中加入60mL无水乙醇进行稀释，稀释后的DNA Washing Buffer室温保存。1. 2操作方案(所有步骤按照试剂盒说明书在室温下进行)(1)过夜培养的细菌培养液转移到一个干净的5mL离心管中，5000g室温离心 10!^11，弃上清、收集菌体沉淀；(幻加入50(^1^ Solution I，将菌体沉淀悬起，并将其转 移至1.5mL离心管中；(3)加入500 μ L Solutionll，上下颠倒四次，室温静置^iin ； (4) 加入250 μ L冰浴的Buffer N3,上下颠倒四次，直到出现白色絮状沉淀，12000g, 4°C，离心 IOmin ； (5)小心地将上清转移到一个1. 5mL离心管中，加入0. 1体积的ETR Solution，冰 浴lOmin，其间颠倒几次；(6)将裂解液42°C孵育5min, 12000g离心3min，ETR Solution会 在底部形成一蓝色条带；(7)将上清转移至1. 5mL离心管中，并加入0. 5体积的无水乙醇， 充分混勻，室温静置Hmin ；⑶将以上混合物700 μ L转移到一个套在2mL收集管中柱II 中，室温离心，10000g，lmin ；将流出液倒掉，按上述操作，将剩余溶液再转移到柱中并离心； (9)用500 μ L HB Buffer洗柱，室温离心，IOOOOg, Imin ； (10)倒掉流出液，用700 μ L含乙醇 的DNA Wash Buffer洗柱，室温离心，10000g，lmin，倒掉流出液，重复此操作一次；(11)倒 掉流出液，将空柱离心13000g，;3min，以干燥柱的介质，特别是将乙醇除去；(12)将柱置于 一个新的 1. 5mL 离心管中，加入 100 μ L 的 Endotoxin-Free Elution Buffer (70°C预热)， 室温静置2min，13000g,离心;3min以洗脱DNA ； (13)弃回收柱，洗脱DNA保存于_20°C备用。1.3DNA的产量与质量把抽提得到的DNA样品稀释100倍，分别测量其在260nm和280nm处的吸光度，得 到DNA浓度(μ g/mL)和A260与A280的比值。A260与A280的比值可显示核酸的纯度，本 实验要求的比值应该在1. 8-2. 0之间。2.细胞培养
MCF-7细胞和HeLa细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37°C饱和湿度、 5% C02孵箱中培养。细胞贴壁生长，每2-4天胰蛋白酶消化细胞，传代培养。3.稳定转染细胞株的建立将生长状态良好的24h前换液的MCF-7细胞按IX IO6Cells/孔的密度、HeLa细胞 按IXlO5ceIls/孔的密度分别接种至6孔板中，37°C、饱和湿度、5% C02孵箱中培养，当6 孔板内细胞生长达到90-95%汇合时即可转染。具体如下(1)配制溶液A 将4 μ g质粒DNA与不含抗生素的DMEM培养液轻轻混合至总体积 为 250 μ L ； (2)配制溶液 B 将 10 μ L LipofectAMINETM2000 与 240 μ L 不含抗生素的 DMEM 培养液混合，室温孵育5min ； (3)将溶液B加入到溶液A中，充分混合，室温孵育20min ； (4) 将6孔板中的细胞用无血清不含抗生素的DMEM培养液洗两遍，每孔加入2mL不含抗生素的 DMEM培养液；(5)加入上述混合物，37°C、饱和湿度，5% C02培养；(6)于转染后7 将转染 细胞消化，按照1 10传代培养，同时加入600 μ g/mLG 418进行抗性筛选，每3天换液一 次并保持G 418的浓度。约2周后，空对照组细胞全部死亡，出现阳性克隆，逐步降低G 418 浓度至200 μ g/mL维持筛选。扩大培养稳定转染细胞株，冻存，相关检测备用。4. ANAK4的稳定表达分析4. IRT-PCR 检测4. 1.1 总 RNA 的提取将筛选到的稳定转染的MCF-7细胞组、HeLa细胞组分别消化，冷PBS洗2次后，加 入0. 5ml Trizol提取液，室温放置5min ；加入0. Iml氯仿剧烈震荡15s，室温静置^iin ； 40C 12000g离心15min ；上层水相转入新的离心管内，加入0. 25ml异丙醇，混勻，室温放置 IOmin ；4°C 12000g 离心 IOmin ；沉淀用 Iml 75% 乙醇(DEPC 水配制)洗一次；4°C IOOOOg 离 心5min ；空气中干燥，加入适量DEPC水溶解(55_60°C水浴IOmin助溶)，存于_80°C备用。4. 1. 2RT-PCR以提取的mRNA为起始物，按照RT-PCR试剂盒说明，分别加入逆转录反应所需的各 种成分进行 RT 反应，其条件为30°C 10min，45°C 30min，99°C 5min，5°C 5min ；94°C 2min。 从反应混合液中各取5 μ 1放入新的PCR管中，依次加入IOOpmol的上下游引物Ρ3和Ρ4或 β -actin 的上下游引物 P5 和 P6，5 μ 1 PCR 缓冲液(IOX)，2. 5mmol/L 的 dNTP 和 U 的 DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最终体积为50 μ 1 ；放置PCR仪中进行PCR扩增，反应参数 为94°C 30S，50°C 30S，72°C lmin，30个循环；最后于72°C延伸lOmin。扩增后进行琼脂 糖凝胶电泳检验。5.间接免疫荧光实验将无菌处理的载玻片放到6孔培养板中，细胞按适当密度分别接种至6孔板中， 37°C饱和湿度、5% CO2孵箱中培养，细胞可自然贴附于载玻片上。当6孔板内细胞生长达 到80%以上汇合时将细胞爬片从6孔培养板中取出，370C D-Hanks洗涤2次，5min/次；将 D-Hanks液吸出，4%多聚甲醛固定30min ；dd H2O洗涤3次，分别为lOmin, lOmin, 5min ；风 机吹干，_20°C保存备用；_20°C取出片子室温水化20min ；PBST洗涤lOmin，PBS洗涤3次， 每次5min ；0. 01%胰酶消化40s，PBS洗涤3次，每次5min ；3% H2O2室温阻断20min，PBS洗 涤3次，每次5min ；3% BSA-PBST封闭20min，PBST洗涤3次，每次IOmin ；加入PBST稀释 (1 12 的抗E-tag鼠单克隆抗体，4°C过夜；PBST洗涤3次，每次IOmin ；加入PBST稀释(1 100)的FITC-山羊抗小鼠IgG，避光室温20min ；PBST洗涤3次，每次IOmin ；加入 2 μ g/mL的Hoechst 33342，室温避光20min ；PBST充分洗涤；甘油封片，上机观察。6. Western-blot 分析收集稳定转染的MCF-7细胞，冷PBS洗2次；加入约500 μ L的RIPA强裂解液(含 ImM PMSF)，冰上裂解40min-lh ；超声破碎，能量20%，10s，两次；15000rpm离心3_5min，收 获上清液；进行SDS-PAGE，用半干式电转仪将蛋白转移到硝酸纤维素膜上；转膜后，将膜置 于PBST中缓摇15min ；用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭Ih ；膜置于PBST中缓摇3次，每 次IOmin ；加入封闭液稀释的一抗，室温缓摇池；膜置于PBST中缓摇3次，每次IOmin ；加 入封闭液稀释(1 5000)的HRP标记的羊抗小鼠IgG，室温缓摇Ih;膜置于PBST中缓摇3 次，每次IOmin ；利用ECL试剂盒显影。注抗E_tag鼠单克隆抗体稀释比例(1 1000)，抗 β-actin鼠单克隆抗体稀释比例(1 5000)。7.免疫共沉淀实验将培养在6孔板中对数生长的细胞用含ImM PMSF的冷PBS洗涤两次，每孔加入 500 μ 1弱的RIPA裂解液(含ImM PMSF)，用细胞刮子将其刮出，放于1. 5ml Eppendorf 管中，冰浴40min，20%的能量超声两次，每次IOs ； 15000rpm 4°C离心5min ；取上清，向 各样品上清中加入4yL抗E-tag抗体，4°C，缓慢颠倒，Ih以上；加入20 μ L Protein Gon S印harose，4°C，缓慢颠倒，过夜；8000rpm，4°C，离心!3min，弃掉上清；用500 μ L弱的 RIPA裂解液洗涤沉淀一次，再用0.01Μ PBS洗涤两次，每次IOmin ；向沉淀中加入20 μ L 1 X SDS-PAGE上样缓冲液，进行SDS-PAGE，之后将蛋白转移到NC膜上，参照上述实验方法， 以抗⑶Κ4多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Wfestern-blot实验。8. MTT法检测细胞增殖活性(1)接种细胞用0. 25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%小牛血清的DMEM 培养液配成单个细胞悬液，MCF-7细胞按7X IO3ceIls/孔；HeLa细胞按5X IO3ceIls/孔的 密度接种至96孔培养板中，200 μ L/孔，每种设10个平行孔，同时以200 μ L/孔培养液作为 阴性对照。( 培养细胞将培养板移入CO2孵箱中，在371、5%0)2及饱和湿度条件下，分 别在培养4h、24h、幼h、7 、邪h、120h后取出培养板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μ L，放回 培养箱继续培养。( 继续培养4h后，小心吸弃孔内培养液。加入DMSO(150 μ L/孔)溶解 ΜΤΤ，振荡IOmin混勻，使结晶物充分溶解。(4)比色选择492nm波长，在酶联免疫检测仪 上调定各孔吸收值，记录结果。以培养液孔光吸收值作为阴性对照，计算每种细胞在492nm 波长处的平均光吸收值，以时间为横轴，492nm光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。9. FACS分析细胞周期收获细胞并用冷PBS洗涤2次，然后用70%冷乙醇4°C固定过夜，检测前用PBS洗 净乙醇，重悬于200 μ L含50 μ g/mL的PI染液的PBS中，加入RNase A至终浓度50 μ g/mL, 避光孵育30min，上流式细胞分析仪检测细胞周期的变化情况。10. Annexin V/PI双染流式细胞术检测分析(1)收集稳定转染的细胞，冷PBS洗涤细胞2次，收集5X IO5个细胞；(2)吸 取250μ L的2XBinding Buffer和250 μ L的灭菌去离子水混勻；(3)用上述500yL的 IXBinding Buffer 悬浮细胞；(4) WAlyL Annexin V-EGFP 混勻，加入 5 μ L ΡΙ，混勻； (5)避光反应IOmin ； (6)用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
三、结果与分析1. pNANK4在肿瘤细胞中的稳定表达为了检测NANK4的表达情况以及其体外生物学活性，以脂质体LipofectameTM 2000介导重组质粒PNANK4及空对照质粒pcDNA3. 1转染人乳腺癌细胞株MCF-7细胞和人子 宫颈癌细胞株HeLa细胞，经G 418抗性筛选，获得稳定转染的阳性细胞克隆，为了鉴定这些 克隆，扩大培养后进行如下实验。1. IRT-PCR 检测 NANK4 的表达为了检测NANK4在肿瘤细胞内的稳定表达，我们分别提取了稳定转染细胞总RNA， 以P3和P4为引物进行了 RT-PCR分析，并且在实验中以β-actin基因作为内参照。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后发现，在以特异性扩增β-actin的相应引物(P5，P6)进行 RT-PCR扩增时，所有样品均能扩增出350bp的β-actin片段，而且每组内各样品扩增出的 条带亮度基本一致(附图11)，而在以特异性扩增NANK4的相应引物进行RT-PCR扩增时，只 有稳定转染PNANK4的细胞，才能扩增出约460bp的产物，而以空载体转染的细胞或空细胞 的RNA为模板时均无该条带的出现(附图11)，这一结果在mRNA水平上证明了我们选择的 细胞克隆为稳定表达NANK4的细胞株，表明已初步获得稳定表达NANK4的细胞克隆MCF-7/ PNANK4细胞株和HeLa/pNANK4细胞株。1. 2间接免疫荧光实验分析以RT-PCR结果呈阳性的细胞为材料，经细胞爬片等一系列处理，以抗E-tag 的鼠单克隆抗体为一抗，FITC-山羊抗小鼠IgG为二抗，进行间接免疫荧光实验分析。 H0eChst33342与细胞核区域结合，发出蓝色荧光。荧光显微镜观察发现，PNANK4稳定转染 的MCF-7细胞和HeLa细胞的细胞核区域均发出明亮的黄绿色荧光，而pcDNA3. 1稳定转染 的MCF-7细胞和HeLa细胞以及空对照的MCF-7细胞和HeLa细胞的细胞核区域没有荧光 (附图12)，这表明NANK4基因在稳定转染的肿瘤细胞中得到有效表达，并且其表达产物定 位在细胞核，进一步验证了我们所获得的阳性细胞株。1. 3Western_blot 分析为了进一步检测NANK4在稳定转染细胞株中的表达，我们分别裂解稳定转染 PNANK4以及稳定转染pcDNA3. 1的MCF-7细胞和HeLa细胞，并以空细胞作对照，用抗E_tag 鼠单克隆抗体进行Western-blot检测，同时以各样品内β -actin的表达水平为内参照。结 果如附图13所示，各样品内β-actin基因均有表达，且表达量均一。而在所筛选到的稳定 转染pNANK4的MCF-7细胞和HeLa细胞的细胞裂解液中检测到NANK4基因的表达，即在大 约31kD的位置上检测到一目的条带。而稳定转染pcDNA3. 1以及空细胞的细胞裂解液中并 没有检测到相关目的条带的产生。此结果证明了在稳定转染PNANK4的MCF-7细胞和HeLa 细胞中得到了稳定的表达，同时也进一步验证了我们所获得的阳性细胞株。2.胞内抗体NANK4能够与肿瘤细胞内的⑶K4蛋白结合为了检测MCF-7细胞和HeLa细胞内胞内抗体NANK4的表达及其能否在细胞内 与CDK4结合，我们进行了免疫共沉淀实验。我们以稳定表达NANK4的MCF-7细胞和HeLa 细胞为材料，以转染了 pcDNA3. 1空载体的细胞及空细胞做对照，将细胞进行裂解后，加入 抗E-tag的鼠单克隆抗体，进行孵育，之后加入ftOtein G-Sepharose进行结合，然后以抗 ⑶K4多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行ffestern-blot实验，结果发现在约34kD的位置处可以出现一明显的条带，即为⑶K4与NANK4结合的⑶K4蛋白。结果如 附图14所示，这说明胞内抗体NANK4在MCF-7细胞及HeLa细胞内得到了表达，并且与抗原 CDK4结合。4.NANK4抑制肿瘤细胞生长我们采用MTT比色法测定活细胞线粒体内i^ormazan含量以检测肿瘤细胞群体增 殖能力。选用对数生长期的MCF-7细胞、HeLa细胞以5_7X IO3ceIls/孔的细胞量铺96孔 板，每种细胞分为3组(pNANK4转染、pcDNA3. 1转染，空细胞组)，共设置l_6d六个时相点， 每天测定的比色值取10个重复孔的平均数，绘制生长曲线，平行组间进行t检验。结果如 附图15所示，与pcDNA3. 1转染细胞组和空细胞组相比，pNANK4组细胞R)rmazan的生成量 随时间的延长明显的减少，显著差异(P < 0. 01)。这些结果说明，NANK4的表达对转染细胞 的生长起到显著的抑制作用。5. NANK4引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞为了检测NANK4基因的表达对肿瘤细胞细胞周期的影响，我们通过流式细胞仪测 定细胞中DNA含量，从而获得各细胞周期时相的百分比。首先将空细胞、筛选的含有空载 体pcDNA3. 1的阳性细胞株以及表达NANK4基因的阳性细胞株分别扩增培养，收获细胞经冷 PBS洗涤、70 %冷乙醇固定过夜、PI染色后，进行FACS分析。结果如图3. 10所示，表达NANK4 基因的阳性细胞株与对照组相比，GO-Gl期的细胞比例增加，S期细胞比例减少。在MCF-7细 胞中，GO-Gl期细胞由40. 01 士 1. 0%增加到64. 91 士2. 4%，而S期细胞由40. 12士 1. 3%减 至24. 37士3.2%，与对照组相比，差异显著(ρ <0. 01)(附图16)；在HeLa细胞中，GO-Gl期 细胞由 40. 70士2. 增加到 67. 10士3. 9%，S 期细胞由 42. 06士3. 2%减至 24. 58士3. 4%, 与对照组相比，差异显著(P < 0. 01)(附图16)。这一结果说明，NANK4基因的表达可以引 起肿瘤细胞Gl期阻滞，抑制肿瘤细胞由Gl期向S期过渡，从而抑制肿瘤细胞增殖。6.NANK4能够诱导肿瘤细胞凋亡样品经处理后，用流式细胞仪检测，以Armexin V为横坐标，PI为纵坐标作图发 现，MCF-7空细胞的自然凋亡率为4. 01 士0. 9%，表达NANK4基因的阳性细胞株的凋亡率为 26. 23士 1.4% (附图17A) ；HeLa空细胞的自然凋亡率为3. 98士0. 4%，表达NANK4基因的 阳性细胞株的凋亡率为25. 75士2.0% (附图17A)。经统计学分析，与对照组相比，差异显 著(P < 0. 01)(附图17B)。本结果说明NANK4基因的表达显著诱导肿瘤细胞凋亡。
权利要求
1.一种抗肿瘤人源单链抗体，其特征在于是特异性抗人CDK4人源单链抗体，其核苷 酸序列如kquence NO. 1所述。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤人源单链抗体，其特征在于还包含核定位信号肽 NLS、E-tag标签肽基因编码序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。
3.如权利要求1或2所述的抗肿瘤人源单链抗体在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的抗肿瘤人源单链抗体的应用，所述的肿瘤为人乳腺癌和人宫颈癌。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤人源单链抗体，属于一种人源抗体。是特异性抗人CDK4人源单链抗体，其核苷酸序列如Sequence NO.1所述；还包含核定位信号肽NLS、E-tag标签肽基因编码序列，其核苷酸序列如Sequence NO.2所述；所述的抗肿瘤人源单链抗体在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用；所述的肿瘤为人乳腺癌和人宫颈癌。本发明是一种低毒、高效、特异的抑制CDK4的活性的分子，具有分子量小、免疫原性低等优点，通过使用肿瘤特异性真核表达载体，进行该抗体的肿瘤靶向治疗，实现该治疗基因的可控性，具有肿瘤特异性，确保治疗的安全有效。
文档编号C07K16/40GK102140139SQ20101010460
公开日2011年8月3日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者冯晶, 李桂英, 王磊, 许晶晶 申请人:吉林大学