专利名称：一种戈舍瑞林的合成方法
技术领域：
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种纯液相片段法合成戈舍瑞林的新方法。
背景技术：
戈舍瑞林(goserelin)是一种长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)，近年来 日益广泛地运用于妇科领域。其化合物化学式为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(TBU)-Leu -Arg-Pro-AZGLY-NH2，结构式如下
HN—M丄, 戈舍瑞林的合成方法主要包括固相合成和液相合成两种。 固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这给企业的大规模生产带来了成本 的压力，不仅如此，在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除，将生成其他 杂质产物。 从现有的各种资料研究状况来看，液相合成布舍瑞林是现阶段各大公司和学校科 研机构的主要方法。例如 专利W097/48726中就报导了类似化合物的液相合成方法，采用了 2+4+3的片段合 成法。三个肽片段分别为二肽片段为Pyr-His-0H，四肽片段为Trp-Ser-Tyr-X-Oet (X为 D-Leu，D-Trp，D-Val)，三肽为Leu-Arg-Pro-NHEt。然后，通过制备二肽片段的H0NB活化酯 与四肽片段縮合，得到目标六肽化合物。通过将六肽造化得到游离羧基，之后再次制备六 肽片段的H0NB活化酯，然后和三肽縮合，得到目的九肽产品。但是由于在此过程中都采用 HONB活化酯，操作相对比较复杂，从而导致收率下降，不适合工业化生产。
专利EP1008656报导了另外一种液相合成此类化合物的方法，也是采用了片段縮 合法，但是采用的是3+2+4的片段法。三个多肽片段分别为三肽片段Pyr-His-Trp-OR，二 肽片段Z-Ser-Tyr-0R1，四肽片段为X-Leu-Arg-Pro-NHEt (D-Leu， D-Trp， D-Val)。然后通 过2+4合成Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NHEt (或者Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro_AZgly-NH2)，最 后，Pyr-His-Trp-OR与六肽片段縮合，在次縮合过程中的创新点在于使用了蛋白酶催化剂， 但是最大的问题也正是在于使用酶催化后产物不易提纯。 另夕卜，还有文献报导了利用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。在 文 献biochemical andbiophysical research communications 1978， Vol 81，N02， Page382-390中提到的4+3+2片段縮合法，就是采用了迭氮化合物法来片段 縮合的。步骤如下1、合成Z-Pro-X(X为Azgly-NH2， -NHEt)，然后合成二肽片段 Boc-Arg (N02)-Pro-X ;2、合成Z-Tyr (Bzl)-B-Leu-Ome (B为D-Phe， D-Ser(Tbu)) ;3、合成 Pyr-A-Trp-Ser-Ome (A为His, D-Phe)。然后，通过迭氮化合物法先将二肽和三肽縮合成 Z-Tyr (Bzl) -B-Leu-Arg (N02) -Pro-X，最后再次通过迭氮化合物法先将五肽和四肽縮合成P yr-A-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -B-Leu-Arg (N02) -Pro-X。虽然，采用迭氮化合物法能够有效的抑制 消旋，但是由于迭氮化合物法在縮合的时候，反应条件比较苛刻，反应十分危险，所以不利 于产业化生产。 在文献Journal of Medicinal Chemistry 1978， Vol21， NOIO， Pagel018 1024 中，报导了另外一种采用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。采用的是2+2+3+2的合成 策略，具体步骤如下l、合成二肽片段Pyr-His-Ome ;2、合成二肽片段Z-Trp-Ser-Ome ;3、合 成三肽片段Z-Tyr (Bzl) -A-Leu-Ome (其中A为Gly， Ser， D-Phe， D-Tyr (Ome) ， D-Ser (Tbu)); 4、合成Boc-Arg(N02)-Pro-C(其中C为-Azgly_NH2， -NHEt， -Gly);最后，将这些片段通过 迭氮化合物法串联縮合起来，形成Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-A-Leu-Arg-Pro-C，但是它也存在 着迭氮化合物合成法的通病，不适合产业化生产。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好 的戈舍瑞林合成方法，采用了 5+4的片段合成法。 —种戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D -Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段 D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在縮合剂的存在下縮合而成。其合成线路如图1所 示。 进一步地，所述的縮合剂优选为氯甲酸叔丁酯。 上述五肽片段中的OH可以用0Me、 0H、 OET、 OBzl或OTbu替代。进一步地，所述的五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步骤合成首先合成
Tyr(R5)-0Me，再与a氮端保护的R12-Ser (R4)反应，生成R12_Ser (R4)-Tyr (R5)-OMe，脱
保护，与a氮端保护的R13-Trp (R3)反应，生成R13_Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脱保
护，与a氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His (R2)-Trp (R3)-Ser (R4)-Tyr (R5)-0M
e，脱保护，与a氮端保护的Rl-Pyr反应，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5
)-OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成
线路如图2所示。 所述的五肽片段Pyr-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OH还可以由以下步骤合成首先 合成Rl-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His (R2)反应，生成Rl-Pyr-His (R2);合成 Rl-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp (R3)反应，生成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3); 合成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3)的活化酉旨，与羧基端保护Ser(R4)反应，生成 Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4);合成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4)的活化酯，与 羧基端保护Tyr (R5)反应，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，最后进 行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成线路如图3所
5不。 上述五肽片段的合成步骤中，Rl可以为B0C、 Z、 Fmoc或H ;R2可以为B0C、 Z、 Bzl、 Trt、 Tos、 Bom、 Dnp或H ;R3可以为B0C、 For、 H或Z ;R4可以为Bzl、 H、 Tbu、 Z、 Boc或Tos ; R5可以为Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-C1-Z ;Rll可以为无机盐或有机物；R12可 以为B0C、Z或Fmoc ;R13可以为B0C、 Z或Fmoc ;R14可以为B0C、 Z或Fmoc。
进 一 步地，所述的四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2由以下步 骤合成首先合成R8-Pro-AZgly-NH2，脱保护，然后与a氮端保护、侧链R7保护的 R9-Arg(R7)-0H反应，生成a氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2 ;脱保护，与a氮端 保护的R10-Leu-0H反应，生成a氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2 ;脱保护， 与R6-D-Ser (Tbu)-OH反应，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro_AZgly-NH2 ;最后脱保 护得四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2 。其合成线路如图4所示。
所述的四肽片段D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2还可以由以下步 骤合成首先合成R6-D-Ser (Tbu)的活化酯，然后与羧基端保护Leu反应，生成 R6-D-Ser (Tbu) -Leu ;合成R6-D-Ser (Tbu) -Leu的活化酯，与羧基端保护Arg (R7)反应， 生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7);合成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与 Pro-AZgly-NH2反应，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro_AZgly-NH2 ;最后脱保护得四 肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2 。其合成线路如图5所示。
上述四肽片段的合成步骤中，R6可以为B0C、 Z或Fmoc ;R7可以为B0C、 (B0C)2、 PBF、T0S、N02、H、PMC、HCL、AD0C或Mts ;R8可以为B0C、Z或Fmoc ;R9可以为B0C、Z或Fmoc ; R10可以为B0C、Z或Fmoc。 本发明方法适合于Pyr-A-Trp-Ser-Tyr-B-Leu-Arg-Pro-C此类化合物的合成， 其中A可以为His、 D-Phe ;B可以为Gly、 Ser、 D-Phe、 D-Tyr (Ome) 、 D-Ser (Tbu) ;C可以 为-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly。在合成过程中，各种氨基酸保护基的变化，也不影响此方法的 应用。 采用本发明方法5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH 和四肽片段D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在縮合剂的存在下縮合成Pyr-His-Trp -Ser-Tyr-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2。本方法不但縮短了合成周期、避免了传统 方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
图1是本发明一种实施方式的合成线路示意图；
其中R1-Pyr为氨基Rl保护的焦谷氨酸
His (R2)为侧链R2保护的组氨酸
Trp (R3)为侧链R3保护的色氨酸
Ser (R4)为侧链R4保护的丝氨酸
Tyr (R5)为侧链R5保护的酪氨酸 R6-D-Ser (Tbu)为D型-侧链(叔丁基)保护-氨基R6保护的丝氨酸
Leu 为亮氨酸
Pro 为脯氨酸 图2是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的一种合成线路示意图； 其中R1-Pyr为氨基Rl保护的焦谷氨酸； R14-His (R2)为a氮端R14保护、侧链R2保护的组氨酸； R13-Trp (R3)为a氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸； R12-Ser (R4)为a氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸； Tyr (R5) -R15为侧链R5保护的酪氨酸； X为对硝基酯、0SU、0NB或0BT。 图3是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的另一种合成线路示意图； 其中R1-Pyr为氨基Rl保护的焦谷氨酸； NH2-His (R2) -R16为羧基端R14保护、侧链R2保护的组氨酸； NH2-Trp (R3) -R17为a氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸； NH2-Ser (R4)-R18为a氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸； Tyr (R5) -R15为侧链R5保护的酪氨酸； X为对硝基酯、0SU、0NB或0BT。 图4是四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2的一种合成线路示意图； 其中R8-Pro为a氮端R8保护的脯氨酸； R9-Arg(R5)为a氮端R9保护、侧链R5保护的精氨酸； R10-Leu为a氮端R10保护的亮氨酸； R6-D-Ser (Tbu)为a氮端R6保护、D型-侧链(叔丁基)保护的丝氨酸； X为对硝基酯、0SU、0NB或0BT。 图5是四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2的另一种合成线路示意 图； 其中R8-Pro为a氮端R8保护的脯氨酸； R9-Arg (R5)为a氮端R9保护，侧链R5保护的精氨酸； R10-Leu为a氮端R10保护的亮氨酸； R6-D-Ser (Tbu)为a氮端R6保护，D型-侧链(叔丁基)保护的丝氨酸； X为对硝基酯、0SU、0NB或0BT。 图6是戈舍瑞林粗产品的HPLC谱图。 图7是纯化后戈舍瑞林产品的HPLC谱图。
具体实施例方式
称取Fmoc-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-0Me(20mmo1)置于50毫升的圆底 烧瓶中加入哌啶/DMF为25%的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大 量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-His (Boc )-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。 在50毫升的圆底烧瓶中加入Pyr-0H(20mmo1) ， NH2-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu )-Tyr-OMe (20mmo1) ， HOSU (22mmo1)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC (22mmo1)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮除去DMF，之 后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干 燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。
HPLC纯度大于92%，收率为81% MS = 975 (M+)。
5 、 Pyr-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OH的合成 称取Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圆底烧 瓶中加入2N的氢氧化钠溶液20ml和甲醇20ml，在室温下搅拌1小时，检测反应完全。加入 稀酸调节HI值为2 6之间，出现大量的白色沉淀，过滤，干燥，得到白色产品(Pyr-His (B oc)_Trp(Boc)_Ser(Tbu)-Tyr-OH)。 将Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OH溶于6N/L的HC1/THF溶液30毫
升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚
洗涤数次，干燥，得到白色产品(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH)。 HPLC纯度:大于93%，收率为90% MS = 705(M+1)。 实施例2合成四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2 1 、 Boc-Pro-AZgly-NH2的合成称取Boc-Pro-0H(20mmo1)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升DMF溶解，之后
加入H0SU(22mmo1)，冰水浴下加入DCC(22mmo1)的DMF溶液20毫升，室温下反应4小时，
滤除沉淀，将溶液浓縮至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完
成，滤除沉淀，将溶液除去，用乙酸乙酯溶解，用稀碱洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋
干溶剂，得到浅黄色固体(Boc-Pro-AZgly-NH2)。HPLC纯度大于92%，收率为81% MS = 273 (M+)。 2、Boc-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2的合成 称取Boc-Pro-AZgly-NH2 (20mmo1)置于100毫升的圆底烧瓶中加入6N/L的HC1/ THF溶 实施例1 :合成五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH
1 、 Fmoc-Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Ser(Tbu)-0H(20mmo1)， NH2-Tyr-0Me(20mmo1) ， H0SU(22mmo1)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无 水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
HPLC纯度:大于90%，收率为93% MS = 561(M+)。
2 、 Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成 称取Fmoc-Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF 为25 %的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉 淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色产品(NH2-Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Trp (Boc)-OH (20mmol)， NH2-Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol) ， HOSU (22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮
8除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无 水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe)。
HPLC纯度大于91%，收率为85% MS = 847 (M+)。
3 、 Fmoc-Hi s (Boc) —Trp (Boc) —Ser (Tbu) —Tyr—OMe的合成 称取Fmoc-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入 哌啶/DMF为25%的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析 出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色产品(NH2-Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Ty r_0Me)。 在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-His (Boc) -0H(20mmol) ， NH2_Trp (Boc) _S er (Tbu) -Tyr-OMe (20mmol) ， HOSU (22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无 水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe) 。 HPLC纯度大于89%，收率为86% MS = 1084 (M+)。 4、 Pyr-His (Boc) -Trp (Boc) -Ser (Tbu) -Tyr-OMe的合成液20毫升，在室温下反应 30分钟，检测反应完全，减压浓縮除去HC1/THF溶液，残留物中加入乙酸乙酯溶解，再减压 浓縮除去乙酸乙酯，如此重复数次，直到除尽HCl，得NH2-Pro-AZgly-NH2。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Boc-Arg(N02)-0H(20mmol)， NH2-Pro-AZgly-NH2(20mmol) ， H0SU(22mmo1)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入 DCC(22mmo1)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮 除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无 水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Boc-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度大于93%，收率为85% MS = 483 (M+)。
3、 Z_Leu_Arg (N02) _Pro_AZgly_NH2的合成 称取Boc-Arg (N02)-Pro-AZgly-NH2(20mmo1)置于100毫升的圆底烧瓶中加入6N/ L的HC1/THF溶液20毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，减压浓縮除去HC1/THF溶 液，残留物中加入乙酸乙酯溶解，再减压浓縮除去乙酸乙酯，如此重复数次，直到除尽HCl， 得NH2-Arg(N02)-Pro_AZgly-NH2。在50毫升的圆底烧瓶中加入Z-Leu-0H(20mmol) ，NH2-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2(
20mmol) ， HOSU (22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmo1)后，在室温
下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮除去DMF，之后用大量乙
酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸
乙酯，得到固体(Z-Leu-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2)。 HPLC纯度大于90%，收率为88% MS = 599 (M+Na)。4、 Z-Ser (Tbu) -Leu-Arg (N02) -Pro_AZgly-NH2的合成 称取Z-Leu-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入 38. 5%的HBr/AC0H溶液20毫升，在室温下反应15分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析 出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Leu-Arg(N02) -Pro-AZgly-NH2)。 在50毫升的圆底烧瓶中加入Z-Ser(Tbu)-0H(20mmol) ， NH2-Leu-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2 (20mmol) ， HOSU (22mmol)，用无水匿F40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC (22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHC03洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Z-Ser(Tbu)-Leu-Arg(N02)-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度大于92%，收率为79% MS = 765 (M+)。
5、 Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro_AZgly-NH2的合成称取Z-Ser (Tbu) -Leu-Arg (N02) -Pro_AZgly-NH2 (20mmol)置于250毫升的圆底烧瓶中加入10% Pd/C(lg)，甲醇100毫升，在室温下0. 3MP情况下，反应4天，检测反应完全，滤除Pd/C，旋干得到白色固体(Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度:大于95%，收率为97% MS = 584(M+1)。 实施例3 合成Pyr-His-Typ-Ser-Tyr-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2
在50毫升的圆底烧瓶中加入Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-0H(20mmo1)，用无水DMF40毫升溶解，在冰盐浴下加入氯甲酸叔丁酯(8ml)，反应5-20分钟，加入NH2-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2 (20mmol)的DMF溶液20毫升，在冰盐浴下反应30分钟，在室温下搅拌12小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓縮除去DMF，得到浅黄色粗产品(Pyr_His_Trp_Ser_Tyr_Ser(Tbu)_Leu_Arg_Pro_AZgly_NH2)。 HPLC纯度大于85X，收率为70XMS二 1269(M+)。戈舍瑞林粗产品HPLC谱图如图6所示。 实施例4产品纯化
此过程共分为4个步骤样品前处理、纯化、冻干、包装。
1、 样品前处理
PH调整使用稀TFA水溶液调整ra在1. 0-3. 5之间过滤使用直径=300咖、孔径=0. 45um微孔滤膜过滤
2、 纯化条件
2. 1制备柱15cm X 30cm柱Kromasil 10um C18反相色谱±真料颗粒2. 2流动相A :0. 1 % TFA水溶液 B :ACN
时间(分钟) 流动相BX 流速(ml/min)
05%250
1025%400
10050%400
2. 3上样
平衡用约2个柱体积5% B流动相，平衡柱子10分钟
上样量5g目的肽
上样流速250ml/min检测波长230nm同时监测压强2.4收样
执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集馏分，直到检测器吸光度小于0. 1AU时或
者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向HPLC监测各馏分纯度。本方法得到的产
品纯度达到98. 5%以上纯度。 2. 5浓縮 通过旋转蒸发仪浓縮馏分 3、冻干 冻干盘使用大铁盘(厚度< lcm)
预冻时间在冷阱中预冻7h以上
冷冻干燥机冻干
4、包装 冻干成干粉后，分装于洁净容器内。 纯化后戈舍瑞林产品的HPLC谱图如图7所示。
权利要求
一种戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合而成。
2. 如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的縮合剂为氯甲酸叔丁酯。
3. 如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的五肽片段 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步骤合成首先合成Tyr(R5)-0Me，再与a氮端保护的 R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser (R4)-Tyr (R5)-OMe，脱保护，与a氮端保护的R13_Trp (R3) 反应，生成R13-Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脱保护，与a氮端保护的R14-His (R2)反 应，生成R14-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，脱保护，与a氮端保护的Rl-Pyr反 应，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护 基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。
4. 如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的五肽片段 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步骤合成首先合成Rl_Pyr的活化酯，再与羧基端保 护His(R2)反应，生成Rl-Pyr-His (R2);合成Rl-Pyr-His (R2)的活化酯，与羧基端保 护Trp(R3)反应，生成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3);合成Rl-Pyr-His (R2)-Trp (R3)的 活化酯，与羧基端保护Ser (R4)反应，生成Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4);合成 Rl-Pyr-His (R2) -Trp (R3) -Ser (R4)的活化酯，与羧基端保护Tyr (R5)反应，生成Rl-Pyr-H is (R2) -Trp (R3) -Ser (R4) -Tyr (R5) -OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段 Pyr_His_Trp_Ser_Tyr_OH。
5. 如权利要求3或4所述的戈舍瑞林的合成方法，其特征在于Rl为BOC、Z、Fmoc或H ; R2为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H ;R3为B0C、For、H或Z ;R4为Bzl、 H、 Tbu、 Z、 Boc 或Tos ;R5为Bzl、 H、 Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、 Me、 Z或2-C1-Z ;Rll为无机盐或有机物;R12 为B0C、 Z或Fmoc R13为B0C、 Z或Fmoc ;R14为B0C、 Z或Fmoc。
6. 如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的四肽片段 D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2由以下步骤合成首先合成R8-Pro-AZgly-NH2， 脱保护，然后与a氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-0H反应，生成a氮端保护的 R9-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2 ;脱保护，与a氮端保护的R10-Leu-0H反应，生成a氮端保护 的Rl 0-Leu-Arg(R7) -Pro_AZgly-NH2 ;脱保护，与R6-D-Ser (Tbu) -OH反应，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro_AZgly-NH2 ;最后脱保护得四肽片段D-Ser (Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZ gly-NH2。
7. 如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的四肽片段 D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2由以下步骤合成首先合成R6-D-Ser (Tbu)的活 化酯，然后与羧基端保护Leu反应，生成R6-D-Ser (Tbu)-Leu ;合成R6-D-Ser (Tbu)-Leu 的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)反应，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7);合成 R6-D-Ser (Tbu) -Leu-Arg (R7)的活化酯，与Pro-AZgly-NH2反应，生成R6-D-Ser (Tbu) -Leu-Arg (R7) -Pro-AZgly-NH2 ;最后脱保护得四肽片段D-Ser (Tbu) -Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2。
8. 如权利要求6或7所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于R6为B0C、 Z或Fmoc ;R7 为BOC、 (BOC) 2、 PBF、 TOS、 N02、 H、 PMC、 HCL、 ADOC或Mts ;R8为B0C、 Z或Fmoc ;R9为B0C、 Z或Fmoc ;RIO为B0C、 Z或Fmoc'
全文摘要
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种纯液相片段法合成戈舍瑞林的新方法。一种戈舍瑞林的合成方法，所述的戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合而成。本发明采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合成戈舍瑞林。本方法不但缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
文档编号C07K7/00GK101759777SQ20101003954
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者徐峰, 杨东晖, 路杨, 邓德雄, 闫庆连 申请人:江苏诺泰制药技术有限公司