专利名称：一种提取棉花的线粒体dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取棉花的线粒体DNA的方法。
背景技术：
线粒体(mitochondria)是高等生物的最重要的细胞器，是细胞质遗传系统之一。 线粒体基因组DNA(mtDNA)相对独立细胞核外，能够自我复制，控制着众多的遗传性状。其 构型主要有开环、闭环、超螺旋、线状和多聚体。与高等动物比，高等植物的线粒体基因组大 而复杂。植物胞质雄性不育性是自然界较普遍存在的现象，研究植物胞质雄性不育是遗传 学理论研究的一个重要课题。大量的遗传学、分子生物学等领域研究表明，引起植物胞质雄 性不育的基因主要分布在线粒体的基因组中，即线粒体基因组直接影响植物胞质雄性不育 的育性。1976年，Levings和Pring在《Science》上发表了 mtDNA与植物胞质雄性不育性 (cytoplasmic male sterility, CMS)的研究结果，认为mtDNA和CMS有着密切的关系，这一 提出引起了研究者们对mtDNA研究的广泛兴趣，因此植物mtDNA的研究称为近代植物分子 生物学研究的热点之一。对植物线粒体基因组结构的进行深入的分子水平研究是揭示CMS 这一自然现象的重要途径。要想进行mtDNA结构和功能的分子水平研究，首先必须从植物 材料中提取高纯度的mtDNA，因此提取高质量的mtDNA是进行研究工作的基础。目前，已用于高等植物mtDNA提取的方法有Leving的CTAB、Dolferus的CsCl/ EB密度梯度离心法、差速离心法等，这些mtDNA提取的方法已经广泛使用。但是，这些方法 操作过程比较复杂、成本高且提取的mtDNA纯度不高，影响后续实验。在不同的植物mtDNA 的提取过程中，各种影响因素也异常复杂，难以把握，而且在基因工程后续试验中对提取 mtDNA的质量、纯度、完整性的要求也越来越高。由于棉花含有较多酚类和多糖类物质，在分 离和纯化mtDNA过程中容易氧化，给纯化mtDNA造成一定的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取棉花的线粒体DNA的方法。本发明提供的提取棉花的线粒体DNA的方法，包括线粒体的提取和线粒体DNA的 提取两个步骤；所述线粒体的提取包括如下步骤(1)至步骤(3)(1)将棉花样品在缓冲液A中进行勻浆，离心收集沉淀；所述缓冲液A的制备方 法如下将 0.05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6_10g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 2-5mmol β -疏基乙醇和0. 1-0. 8g BSA用水定容至1升，调pH值至7. 5-8. 5 ；(2)向步骤(1)的沉淀加入缓冲液B和DNase I，以去除核DNA，然后加入EDTA水 溶液(或EDTA-Na2水溶液)，离心得到沉淀；所述缓冲液B的制备方法如下将0. 05mol Tris-HCl,0. 1-0. 5mol 蔗糖、0. 01-0. 05mol MgCl2 和 l_5g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容 至1升，调pH值至7. 5-8.5 ；
(3)向步骤( 的沉淀加入缓冲液C和缓冲液D，离心得到线粒体；所述缓冲液C的 制备方法如下将0. 05mol Tris-HCl.O. 02mol EDTA-Na2和0. 1-0. 5mol蔗糖用水定容至1 升，调PH值至7. 5 ；所述缓冲液D的制备方法如下将0. 05molTris-HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和0. 2-1. Omol蔗糖用水定容至1升，调pH值至7. 5-8. 5 ；所述线粒体DNA的提取包括如下步骤(4)至步骤(8)(4)向步骤(3)的线粒体加入裂解液进行裂解，然后加入乙酸盐水溶液，离心收集 上清液，用等体积的溶液甲进行抽提，离心得到沉淀；所述溶液甲由氯仿和异戊醇组成，氯 仿和异戊醇的体积比为M 1 ；(5)向步骤的沉淀加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀，用 70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀；(6)用TE溶液或T50E10溶液溶解步骤(5)的沉淀；(7)然后加入RNaes，以去除RNA;然后加入蛋白酶K，以去除蛋白；然后用等体积 的溶液乙进行抽提，离心收集上清液；所述溶液乙由Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 24 1 ；(8)向步骤(7)的上清液加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀；用 70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到棉花的线粒体DNA。步骤中，所述乙酸盐可为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。步骤(5)中，所述乙酸盐可为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。步骤(8)中，所述乙酸盐可为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。步骤中所述裂解液可为CTAB裂解液；所述裂解液优选为如下方法制备得到 的溶液将 O.Olmol Tris-HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g 聚乙烯吡咯烧酮(PVP)禾口 1. 4mol NaCl用水定容至1升。步骤(6)中，所述TE溶液具体可为如下方法制备得到的溶液将1毫升lmol/ LpH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升0. 5mol/L pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫 升蒸馏水中。步骤(6)中，所述T50E10溶液具体可为如下方法制备得到的溶液将5毫升、 lmol/L、pH8. 0 的 Tris-Cl 水溶液和 2 毫升、0. 5mol/L、pH 8. 0 的 EDTA-Na2 水溶液加入到 93 毫升蒸馏水中。所述方法中，所述棉花样品、所述缓冲液A、所述缓冲液B、所述DNase I、步骤⑵ 的所述EDTA水溶液(或EDTA-Na2水溶液)、所述缓冲液C、所述缓冲液D、所述裂解液、步 骤(4)的所述乙酸盐水溶液、步骤(5)的所述乙酸盐水溶液、所述TE溶液、所述RNase、所 述蛋白酶K和步骤(8)的所述乙酸盐水溶液的配比可为30-100g棉花样品200-800毫升 缓冲液 A 5-40 毫升缓冲液 B :10-40UDNase I :100-400 μ L 0. 5mol/L ρΗ7· 5-8. 5 的 EDTA 水溶液(或EDTA-Na2水溶液):5_40毫升缓冲液C 5-40毫升缓冲液D 1-10毫升裂解液 200-450微升2mol/L乙酸盐水溶液400-900微升lmol/L乙酸盐水溶液100-600微升TE 溶液l-10URNaes =I-IOU蛋白酶K 20-60微升2_5mol/L乙酸盐水溶液。步骤⑵具体可为向步骤⑴的沉淀加入所述缓冲液B和DNase I后，4°C 反应30-60分钟，然后加入所述EDTA水溶液。步骤O)中，所述离心的参数具体可为 10000-17000g、5-40 分钟。步骤(3)中，所述离心的参数具体可为10000-17000g、5-20分钟。
步骤(4)具体可为所述向步骤(3)的线粒体加入所述裂解液，65°C裂解15-60分 钟，然后加入所述乙酸盐水溶液。步骤(7)具体可为在步骤(6)的溶液中加入所述RNaes，37°C水浴30_60分钟； 然后加入所述蛋白酶K，37°C水浴30-60分钟。所述棉花样品具体可为棉花黄化苗。所述棉花的品种具体可为徐棉M4。本发明提供了分离棉花线粒体DNA的方法，是分子生物学的基本步骤之一，属于 植物基因工程技术领域。本发明针对目前提取线粒体DNA过程中存在的不足，有针对性的 在传统的CTAB方法上进行改进，调整离心的时间、适当增加离心次数、更改试剂、增加抽提 洗涤次数等，优化其提取条件。本发明在提取过程中确保对线粒体机械损伤程度最小的基 础上，有效的除去线粒体以外的核DNA以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体DNA 的纯度和质量，可以满足棉花线粒体基因工程后续实验。
图1为实施例1提取的线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；1-4为提取得到的线粒 体 DNA。图2为实施例2提取的线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；1_4为提取得到的线粒 体 DNA。图3为实施例3提取的线粒体DNA的琼脂糖凝胶电泳图；1_4为提取得到的线粒 体 DNA。图4为实施例1至3提取的线粒体DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；1 D15000plus DNA ladder ；2、3 实施例1提取得到的线粒体DNA的酶切产物；4、5 实施例2 提取得到的线粒体DNA的酶切产物；6、7 实施例3提取得到的线粒体DNA的酶切产物。图5为CTAB法提取的线粒体DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；1_5 =CTAB法提 取的线粒体DNA的酶切产物；6 :D2000DNA ladder。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。徐棉又名苏棉20号)购自江苏徐农种业科技有限公司；由徐州市农业科学 院培育，2002年通过江苏省农作物品种审定委员会审定，编号为苏审棉200202。实施例1、棉花线粒体DNA的提取一、溶液配制缓冲液A 的制备方法如下将 0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、8g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、4mmol β -疏基乙醇和0. 5g牛血清蛋白(BSA)用水定容至1升，调pH 值至8.0。缓冲液B 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 3mol 蔗糖、0. 03mol MgCl2 和 3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，调pH值至8.0。
缓冲液C 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 3mol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至7. 5.缓冲液D 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 6mol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至8. 0。裂解液的制备方法如下将0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制备方法如下将1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸馏水中。T50E10溶液的制备方法如下将5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸馏水中。溶液甲的制备方法如下由氯仿和异戊醇组成，氯仿和异戊醇的体积比为M 1。溶液乙的制备方法如下Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris饱和酚、氯仿和异 戊醇的体积比为25 24 1。二、线粒体DNA的提取(1)将50g徐棉244黄化苗与400毫升缓冲液A混勻进行勻浆，离心收集沉淀。(2)向步骤(1)的沉淀依次加入20毫升缓冲液B和20U DNase I 4°C反应30min， 然后加入200微升、0. 5mol/L、pH7. 5的EDTA-Na2水溶液，IOOOOXg离心5min得到沉淀。(3)向步骤O)的沉淀加入20毫升缓冲液C，然后用注射器向底部轻轻注入20毫 升缓冲液D，冰浴30min，IOOOOXg离心5min得纯净完整的线粒体。(4)向步骤(3)的线粒体加入5毫升裂解液65°C裂解15min (裂解完全)，然后加 入300微升、2mol/L的乙酸钾水溶液冰浴30min，离心收集上清液，用等体积的溶液甲进行 抽提，离心得到沉淀。(5)向步骤(4)的沉淀加入450微升、lmol/L的乙酸钠水溶液，再加入无水乙醇， 离心得到线粒体沉淀物，通过70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤线粒体沉淀物。(6)干燥步骤(5)的线粒体沉淀物，加入400微升T50E10溶液过夜充分溶解。(7)在步骤(6)的溶解液中加入5U RNaSe，37°C水浴中30min ；然后加入5U蛋白 酶K，37°C水浴中30min，之后，用等体积的溶液乙进行抽提，离心收集上清液。(8)在步骤(7)的上清液中加入40微升、3mol/L的乙酸钠水溶液和二倍体积的无 水乙醇，离心收集沉淀；用70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到线粒体DNA。 干燥沉淀，加入TE充分溶解。将线粒体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，见图1。实施例2、棉花线粒体DNA的提取一、溶液配制缓冲液A 的制备方法如下将 0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、2謹Ol β-疏基乙醇禾口 0. Ig BSA用水定容至1升，调pH值至7.5。缓冲液B 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. Imol 蔗糖、0. Olmol MgCl2 和 Ig聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，调PH值至7. 5。缓冲液C 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. Imol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至7. 5.
缓冲液D 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 2mol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至7. 5。裂解液的制备方法如下将0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制备方法如下将1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸馏水中。T50E10溶液的制备方法如下将5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸馏水中。溶液甲的制备方法如下由氯仿和异戊醇组成，氯仿和异戊醇的体积比为M 1。溶液乙的制备方法如下Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris饱和酚、氯仿和异 戊醇的体积比为25 24 1。二、线粒体DNA的提取(1)将30g徐棉244黄化苗与200毫升缓冲液A混勻进行勻浆，离心收集沉淀。(2)向步骤(1)的沉淀依次加入5毫升缓冲液B和IOU DNase I 4°C反应45min， 然后加入100微升、0. 5mol/L、pH8. 0的EDTA水溶液，15000Xg离心20min得到沉淀。(3)向步骤( 的沉淀依次加入5毫升缓冲液C和5毫升缓冲液D，15000Xg离心 IOmin得纯净完整的线粒体。(4)向步骤(3)的线粒体加入1毫升裂解液65°C裂解40min (裂解完全)，然后加 入200微升、2mol/L的乙酸胺水溶液，离心收集上清液，用等体积的溶液甲进行抽提，离心 得到沉淀。(5)向步骤的沉淀加入400微升、lmol/L的乙酸钠水溶液，再加入无水乙醇， 离心得到线粒体沉淀物，通过70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤线粒体沉淀物。(6)干燥步骤(5)的线粒体沉淀物，加入100微升T50E10溶液过夜充分溶解。(7)在步骤(6)的溶解液中加入IU RNaSe，37°C水浴中45min ；然后加入IU蛋白 酶K，37°C水浴中45min，之后，用等体积的溶液乙进行抽提，离心收集上清液。(8)在步骤(7)的上清液中加入20微升、2mol/L的乙酸钠水溶液和无水乙醇，离 心收集沉淀；用70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到线粒体DNA。干燥沉淀， 加入TE充分溶解。将线粒体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，见图2。实施例3、棉花线粒体DNA的提取一、溶液配制缓冲液A 的制备方法如下将 0. 05mol Tris-HCl、1. 2mol NaCl、2mmol EDTAUOg 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5mmoli3-疏基乙醇和0. 8g BSA用水定容至1升，调pH值至8. 5。缓冲液B 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 5mol 蔗糖、0. 05mol MgCl2 和 5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，调pH值至8.5。缓冲液C 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 5mol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至7. 5.缓冲液D 的制备方法如下将 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 1. Omol 蔗 糖用水定容至1升，调PH值至8. 5。
裂解液的制备方法如下将0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制备方法如下将1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸馏水中。T50E10溶液的制备方法如下将5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸馏水中。溶液甲的制备方法如下由氯仿和异戊醇组成，氯仿和异戊醇的体积比为M 1。溶液乙的制备方法如下Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris饱和酚、氯仿和异 戊醇的体积比为25 24 1。二、线粒体DNA的提取(1)将IOOg徐棉244黄化苗与800毫升缓冲液A混勻进行勻浆，离心收集沉淀。(2)向步骤(1)的沉淀依次加入40毫升缓冲液B和40U DNase I 4°C反应60min， 然后加入400微升、0. 5mol/L、pH8. 5的EDTA水溶液，17000Xg离心40min得到沉淀。(3)向步骤( 的沉淀依次加入40毫升缓冲液C和40毫升缓冲液D，17000Xg离 心20min得纯净完整的线粒体。(4)向步骤(3)的线粒体加入10毫升裂解液65°C裂解60min (裂解完全)，然后加 入450微升、2mol/L的乙酸钠水溶液，离心收集上清液，用等体积的溶液甲进行抽提，离心 得到沉淀。(5)向步骤(4)的沉淀加入900微升、lmol/L的乙酸胺水溶液，再加入无水乙醇， 离心得到线粒体沉淀物，通过70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤线粒体沉淀物。(6)干燥步骤(5)的线粒体沉淀物，加入600微升TE溶液过夜充分溶解。(7)在步骤(6)的溶解液中加入IOU RNase，37°C水浴中60min ；然后加入IOU蛋 白酶K，37°C水浴中60min，之后，用等体积的溶液乙进行抽提，离心收集上清液。(8)在步骤(7)的上清液中加入60微升、5mol/L的乙酸钠水溶液和无水乙醇，离 心收集沉淀；用70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到线粒体DNA。干燥沉淀， 加入TE充分溶解。将线粒体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，见图3。实施例4、提取效果验证分别将实施例1至实施例3中提取的线粒体DNA用Not I酶切12小时，然后进行 琼脂糖凝胶电泳，以验证提取效果。见图4。采用CTAB法提取棉花黄化苗的线粒体DNA，用Not I酶切12小时，然后进行琼脂 糖凝胶电泳，见图5。结果表明常规CTAB提取线粒体DNA，杂质较多，一般内切酶切不开，而且弥散较 严重；而本发明提供的方法，提取的DNA较纯净，质量较高，能满足继续的相关分子试验。
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权利要求
1.一种提取棉花的线粒体DNA的方法，包括线粒体的提取和线粒体DNA的提取两个步骤；所述线粒体的提取包括如下步骤(1)至步骤(3)(1)将棉花样品在缓冲液A中进行勻浆，离心收集沉淀；所述缓冲液A的制备方法如 下将0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6_10g聚乙烯吡咯烷酮、2_5_ο1 β-疏 基乙醇和0. 1-0. 8g BSA用水定容至1升，调pH值至7. 5-8. 5 ；(2)向步骤(1)的沉淀加入缓冲液B和DNaseI，以去除核DNA，然后加入EDTA水溶液 或EDTA-Na2水溶液，离心得到沉淀；所述缓冲液B的制备方法如下将0. 05mol Tris-HCl、 0. 1-0. 5mol蔗糖、0· 01-0. 05mol MgCl2和l_5g聚乙烯吡咯烷酮用水定容至1升，调pH值 至 7. 5-8. 5 ；(3)向步骤O)的沉淀加入缓冲液C和缓冲液D，离心得到线粒体；所述缓冲液C的制 备方法如下将0. 05mol Tris-HCl.O. 02mol EDTA-Nei2和0. 1-0. 5mol蔗糖用水定容至1升， 调PH值至7. 5 ；所述缓冲液D的制备方法如下将0. 05mol Tris-HCl、0· 02mol EDTA-Na2 ^P 0. 2-1. Omol蔗糖用水定容至1升，调pH值至7. 5-8. 5 ；所述线粒体DNA的提取包括如下步骤(4)至步骤(8)(4)向步骤(3)的线粒体加入裂解液进行裂解，然后加入乙酸盐水溶液，离心收集上清 液，用等体积的溶液甲进行抽提，离心得到沉淀；所述溶液甲由氯仿和异戊醇组成，氯仿和 异戊醇的体积比为M 1 ；(5)向步骤的沉淀加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀，用70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀；(6)用TE溶液或T50E10溶液溶解步骤(5)的沉淀；(7)然后加入RNaes，以去除RNA;然后加入蛋白酶K，以去除蛋白；然后用等体积的溶 液乙进行抽提，离心收集上清液；所述溶液乙由Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris饱和 酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 24 1 ；(8)向步骤(7)的上清液加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀；用70% (体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到棉花的线粒体DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺 和乙酸钠中的至少一种；步骤(5)中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一 种；步骤(8)中，所述乙酸盐为乙酸钾、乙酸胺和乙酸钠中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，所述裂解液为CTAB裂解液；步骤中，所述裂解液优选为如下方法制备得到的溶液将0. Olmol Tris-HCl, 0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚乙烯吡咯烷酮和1. 4mol NaCl用水定容至1升。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于步骤(6)中，所述TE溶液为如 下方法制备得到的溶液将1毫升lmol/L pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升0. 5mol/L PH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升水中；步骤(6)中，所述T50E10溶液的制备方 法如下将5毫升lmol/L pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫升0. 5mol/L pH 8. 0的EDTA-Na2 水溶液加入到93毫升水中。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述棉花样品、所述缓冲液A、所述缓冲液B、所述DNase I、步骤O)的所述EDTA水溶液或EDTA-Nii2水溶 液、所述缓冲液C、所述缓冲液D、所述裂解液、步骤(4)的所述乙酸盐水溶液、步骤(5)的 所述乙酸盐水溶液、所述TE溶液、所述RNase、所述蛋白酶K和步骤(8)的所述乙酸盐水溶 液的配比为30-100g棉花样品200-800毫升缓冲液A 5_40毫升缓冲液B 10-40U DNase I 100-400 μ L 0. 5mol/L ρΗ7· 5_8· 5 的 EDTA 水溶液或 EDTA-Nei2 水溶液5-40 毫 升缓冲液C 5-40毫升缓冲液D 1-10毫升裂解液200-450微升2mol/L乙酸盐水溶 液400-900 微升 lmol/L 乙酸盐水溶液100-600 微升 TE 溶液1-10U RNaes 1-10U 蛋白酶K 20-60微升2-5mol/L乙酸盐水溶液。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于步骤O)中，向步骤(1)的沉淀 加入所述缓冲液B和DNase I后，4°C反应30-60分钟，然后加入所述EDTA水溶液；步骤⑵ 中，所述离心的参数为10000-17000g、5-40分钟。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述离心的参数为 10000-17000g、5-20 分钟。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于步骤(4)中，所述向步骤(3)的 线粒体加入所述裂解液，65°C裂解15-60分钟，然后加入所述乙酸盐水溶液。
9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于步骤(7)中，在步骤(6)的溶液 中加入所述RNaes，37°C水浴30-60分钟；然后加入所述蛋白酶K，37°C水浴30-60分钟。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述棉花样品为棉花黄化苗； 所述棉花的品种为徐棉对4。
全文摘要
本发明公开了一种提取棉花的线粒体DNA的方法。本发明的方法包括如下步骤(1)棉花匀浆，离心收集沉淀；(2)去除核DNA，加EDTA溶液，离心得沉淀；(3)加缓冲液，离心得线粒体；(4)加裂解液，再加乙酸盐溶液，离心收集上清，用氯仿-异戊醇抽提；(5)加乙酸盐溶液，再加无水乙醇，离心得沉淀，用乙醇洗涤；(6)用TE溶解；(7)去除RNA和蛋白，用Tris饱和酚-氯仿-异戊醇抽提，离心收集上清；(8)加乙酸盐溶液，再加乙醇，离心得沉淀；用乙醇洗涤，得线粒体DNA。本发明针对目前提取线粒体DNA中存在的不足，改进传统的CTAB法，调整离心的时间和次数、更改试剂、增加抽提洗涤次数等，优化提取条件。本发明确保对线粒体机械损伤程度最小的基础上，有效的除去线粒体以外的核DNA以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体DNA的纯度和质量，可以满足棉花线粒体基因工程后续实验。
文档编号C07H1/08GK102121000SQ20101003394
公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月7日 优先权日2010年1月7日
发明者华金平, 张曦, 李双双, 熊敏, 王玉美, 苏爱国, 薛龙飞 申请人:中国农业大学