专利名称：硫化剂及其用于寡核苷酸合成的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及硫代磷酸酯寡核苷酸、其使用新硫化剂的制备、所述硫化剂及其制备。
背景技术：
寡核苷酸属于一类生物药剂，具有非常大的治疗不同疾病的潜力，这些疾病列举几个包括癌症、病毒感染、以及炎性疾病。推动寡核苷酸作为疗法的一个重要途径涉及对该寡聚物主链的修饰以提供除其他之外的代谢抗性、化学稳定性并且以改进至作用部位的体内运输。修饰的主链化学物的例子包括肽核酸类(PNA)(参见Nielsen，Methods Mol. Biol.，208 :3- ，2002)，锁核酸类(LNA)(参见 Petersen & Wengel，Trends Biotechnol.， 21(2) :74-81，2003)，硫代磷酸酯类(参见Eckstein，Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10(2) :117-21,2000),甲基膦酸酯类(参见 Thiviyanathan 等人，Biochemistry,41 (3) 827-38,2002)，氨基磷酸酯类(参见 Gryaznov，Biochem. Biophys. Acta, 1489 (1) 131-40， 1999 ;Pruzan 等人，Nucleic Acids Res. ,30(2) :559_68，2002)，硫代氨基磷酸酯类(参见 Gryaznov 等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,20(4-7) :401-10,2001 ； Herbert等人，Oncogene, 21 (4) =638-42, 2002) 0硫代磷酸酯的形成属于最有用的修饰，因为用P = S部分取代P = O使得寡核苷酸耐受核酸裂解降解而同时在大多数情况下保持了天然寡聚物的生物特性。硫代磷酸酯可以通过氧化硫化作用而形成(Oligonucleotide synthesis, methods and applications,P. Herdewij η Methods in Molecular Biology,volume 288, Chapter 4,51-63).主要存在两种制造硫代磷酸酯的方法，取决于对于这个反应所使用的磷酯(phosphorous esters)的性质以及所预期的产物。其中之一涉及将未取代的硫原子引入到磷中，例如通过元素硫、二苯酰基四硫化物、3-Η-1，2-苯并二硫-3-酮-1，1- 二氧化物(还称为 Beaucage 试剂，(Iyer 等人，J. Org. Chem. 55，4693-4699 (1990))，二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、二硫化二甲基秋兰姆(DTD)、苯乙炔二硫化物(PADS)以及双(0，0-二异丙氧基硫膦基)二硫化物(称为Stec’ s试剂)。这些反应主要用于通过亚磷酰胺法在固体载体上的寡核苷酸的自动合成中并且包括在寡聚物的延长反应过程中所形成的磷三酯的氧化硫化作用。制造寡聚硫代磷酸酯的第二种方法是与H-膦酸酯法一起使用的并且涉及H-膦酸酯二酯与硫转移试剂之间的反应，其中带有脂肪族或芳香族取代基的硫原子被转移到磷上。在硫上的辅助取代基在该合成操作中起到了保护基团的作用并且通常在寡核苷酸制备的最后阶段被切除。这种方法特别适合于在溶液中合成寡核苷酸。相比对于将未取代的硫原子引入到磷酯中可得的试剂的大量选择，允许H-膦酸酯与受保护的硫进行硫化作用的基团的范围是有限的(例如，Dreef等人，Synlett,481-483,1990, US 6，506，894)。在实施中，仅氰基乙基硫化物基团在寡核苷酸的溶液合成过程中被广泛地用在这种反应中，其中在每一步骤都进行色谱纯化。寡核苷酸溶液合成的一个关键问题涉及在每个合成步骤中获得高的底物转化率与优异特异性的必要性从而给出高纯度的、处于有助于简单纯化之形式的产品，特别是避免了色谱法。鉴于缺少用于允许经济的溶液相合成的方法，这种溶液相技术目前似乎并未被用于商业规模的寡核苷酸合成。现在本发明披露了新的硫化剂，用于制造它们的方法以及它们在硫代磷酸酯寡核苷酸的经济并且合适的合成以及纯化中(特别是在溶液中)的用途。
发明内容
本发明具体地涉及在所附的权利要求中所描述的发明。本发明还涉及在本发明的说明书、特别是在实施例中实质性描述的方法以及试剂。本发明具有许多超过P-S连键(linkage)形成的现有方法的优点，特别是在所进行的寡核苷酸的合成中，优选地通过H-膦酸酯法。例如，使用这种新试剂转移到例如寡核苷酸上的残基R可以有助于寡核苷酸的结晶或沉淀，从而允许使用最小量的或不使用色谱法而简单地纯化这些产品。已经发现使用这种方法制造的、具有从两个到至少十六个核苷酸单元的寡核苷酸直到对所要求的寡核苷酸进行最终脱保护之后才有必要通过色谱法进行纯化。中间体寡聚物可以足够纯地获得以用于任选地在5’ -和3’ -位置上的脱保护作用以及(若希望的话)这些粗制脱保护材料与更高级的寡核苷酸的连接。在另一个优点中，所披露的方法提供了使用多种硫化剂的途径，这些硫化剂在使简单的、无色谱法的纯化的效率最大化的方面可以被用来修饰所形成的寡核苷酸的特性。根据本发明方法的又一个优点在于例如硫保护的酰氧基亚甲基RC(O)-OCH2的简单切除可以在温和的条件下，例如使用伯胺或仲胺或受阻胺(例如正丙胺或叔丁胺)容易地完成。当使用胺任选地处理时， 发生了自发切除，包括硫-亚甲基键，由此允许P = S键的干净的形成。这些切除产物可以很容易地通过溶剂或水的洗涤而去除。例如酰氧基亚甲基基团的稳定性特征(例如在碱性的非亲核条件下)允许沿着合成路径的选择性脱保护反应并且由此允许合成方案的更大的灵活性，例如通过阻止核碱基保护基团的切除。开发一种用于合成寡核苷酸(尤其是在溶液中)的经济方法的重要因素是在寡核苷酸链延长过程的每个步骤的转化产物的纯度。尽管根据本发明的方法确保了高的产物产率以及纯度，每个延长周期总体上包括三个步骤并且有利的是除去即使少量的杂质，否则这些杂质将会沿着路径而累积。由于有众多的步骤，因此在每个步骤中使用色谱法在实际的大规模寡核苷酸合成中可能不是经济上可行的。因此，我们还披露了用于纯化链延长过程中所形成的寡核苷酸的无色谱法的方法。本发明的一个第一具体目的是提供寡核苷酸，这些寡核苷酸包括至少一个包含 P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)
权利要求
1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中R选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基碳酸酯基团以及亚甲基氨基甲酸酯基团。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合化学式-CH2-O-C(O)-Rtl, 其中Rtl是C1-C20的、饱和的、不饱和的、杂环的或芳香族的烃残基。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合具有化学式-CH2-O-C(O)-NRxRy的亚甲基氨基甲酸酯基团，其中民和Ry独立地选自烷基或(杂)芳基，优选地Rx和Ry是烷基或者民和Ry —起形成3至8元环，任选地包含选自0、N和S的附加的环杂原子。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合具有化学式-CH2-O-C(O) ORx的亚甲基碳酸酯基团，其中民选自任选取代的烷基、环烷基以及(杂)芳基基团。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的寡核苷酸，其中民选自低级烷基或环烷基 (C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，该寡核苷酸包括2至30个核苷酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自以下各项的核苷核糖核苷、2’ -脱氧核糖核苷、2’ -取代的核糖核苷、2’ _4’ -锁-核糖核苷、3’ -氨基-核糖核苷、3’ -氨基_2’ -脱氧核糖核苷。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸，作为药物前体。
10.一种用于生产具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸的方法，该方法包括 (a)提供根据权利要求1至8中任一项所述的第一寡核苷酸并且(b)从所述第一寡核苷酸切除至少一个R基团以生产所述具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该R基团是通过使该第一寡核苷酸与碱在溶液中进行反应而切除的，该碱优选地选自烷基、环烷基以及芳香胺，更优选地选自伯或仲烷基胺，最优选地选自正丙基以及叔丁基胺。
12.根据权利要求10所述的方法，其中该碱是受阻的伯胺。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中该切除是在空间受阻的碱以及激活剂的存在下进行的，该激活剂总体上是N-杂芳香族的碱。
14.根据权利要求M所述的方法，其中该第一碱是烷基伯胺，其中烷基基团具有选自 Cl至C20直链或支链烷基的多个相同或不同的取代基。根据权利要求M所述的方法，其中该第一碱是芳基伯胺，其中芳基基团在2和/或6位上包括直链或支链的烷基或芳基基团。
15.根据权利要求M或25所述的方法，其中该激活剂是1，2，4_三唑或其他三唑以及四唑衍生物。
16.一种用于将根据权利要求对至沈中任一项所述的寡核苷酸进行脱保护的方法，其中该空间受阻的碱是叔丁基胺。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，进一步包括将所述具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸进行纯化。
18.根据权利要求17所述的方法，该方法包括至少使该第二寡核苷酸进行沉淀。
19.根据权利要求17或18所述的方法，进一步包括将该第二寡核苷酸用溶剂进行萃取。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的方法，该方法包括将该第二寡核苷酸溶解在极性有机溶剂中，该溶剂优先选自二氯甲烷、氯仿、乙腈、丙酮以及吡啶。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所使用的溶剂体积的范围是约0.5(n+l)mL至约 2. 0(n+l)mL，优选为约1. 0(n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中将该第二寡核苷酸的溶液使用非极性有机溶剂进行处理直至该溶液变浑浊，该溶剂优先选自烃类、醚溶剂以及它们的混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所使用的溶剂体积的范围是约l(n+l)mL至约 4(n+l)mL，优选为约2. 0 (n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中将该浑浊的溶液使用沉淀助剂进行处理。
25.根据权利要求23所述的方法，其中该沉淀助剂是选自多种惰性多孔固体，这些固体优先选自硅藻土、木炭、木纤维素、以及色谱固定相例如硅胶或氧化铝。
26.根据权利要求M或25所述的方法，其中该沉淀助剂所使用的量值范围是约 0. 25 (n+1) g至约1. 5 (n+1) g，优选为约0. 75 (n+1) g，其中η是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，加入该沉淀助剂之后，将该混合物使用第二部分的非极性有机溶剂进行处理，其中所述部分的体积的范围总体上是约l(n+l)mL至约 4(n+l)mL，优选为约2. 0 (n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
28.根据权利要求对至27中任一项所述的方法，其中将在该沉淀步骤中获得的固体材料过滤掉并且洗涤。
29.根据权利要求18至观中任一项所述的方法，其中使用溶剂从含寡核苷酸的所述沉淀中萃取该寡核苷酸。
30.根据权利要求四所述的方法，其中该溶剂包括极性有机溶剂与水性介质的混合物，该极性有机溶剂优先选自乙腈、丙酮、THF、DMF、DMS0以及吡啶，该水性介质优选为水，并且其中极性有机溶剂/水性介质的体积比优选是约0. 5至约1. 5，更优选约0. 7。
31.根据权利要求10所述的方法，其中该R基团在人体或动物体内被切除，该R基团优先选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基氨基甲酸酯基团或亚甲基碳酸酯基团。
32.—种具有化学式R”-S-R的硫化剂，其中R符合以下化学式(I)
33.根据权利要求32所述的硫化剂，其中R是选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基氨基甲 酸酯基团、或亚甲基碳酸酯基团，并且R”是离去基团。
34.根据权利要求32或33中任一项所述的硫化剂，其中R是如权利要求1至6中任一 项中所描述的。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(II)
36.根据权利要求32至35中任一项所述的硫化剂，其中R”是磺酰胺基团，优选N-取 代的N烷基磺酰基。
37.根据权利要求36所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(III)
38.根据权利要求32至35中任一项所述的硫化剂，其中R”是二羧基酰胺。
39.根据权利要求38所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(IV)
40.一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用根据权利要求32至39中任一项所 述的硫化剂来硫化所述寡核苷酸的前体的至少一个磷核苷酸间连键。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该磷核苷酸间连键是H-膦酸酯二酯键。
42.根据权利要求41所述的方法，该方法进一步包括通过将H-膦酸酯单酯盐与具有游 离羟基的受保护的核苷或寡核苷酸相偶联以形成该H-膦酸酯二酯键。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中该偶联是在溶液相中进行的。
44.一种用于合成根据权利要求32至37中任一项所述的硫化剂的方法，该方法包括 (a)使磺酰卤素，优选磺酰氯，与具有化学式R-S-C(O)-I的硫缩醛进行反应，其中R是如在 权利要求1至6中所述的，并且&是有机残基，该有机残基优先选自C1-C20的、任选地不饱 和的或芳香族的烃残基，以产生具有化学式R-S-W的中间产物，其中W是卤素，优选Cl ；并 且(b)使所述中间产物与N-磺酰化合物或N-酰基化合物进行反应。
45.根据权利要求44所述的方法，其中该硫缩醛具有化学式 R1-C (0) -O-CH2-S-C (0) -R2，其中队和&独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，并且使所述硫缩醛与磺酰氯进行反应以产生具有化学式R1-C(O)-O-CH2-S-Cl的中间产物，其中R1独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中在步骤(b)中使该中间产物与具有化学式 R3-S (0) 2-NH-R4的N-磺酰基化合物进行反应，其中民和R4独立地是有机残基，优选C1-C20 的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。
47.根据权利要求44或45所述的方法，其中在步骤(b)中使该中间产物与具有化学式…'}的N-酰基化合物进行反应，其中Z是选自下组的基团，该组为-CH2-CH-、-CH =CH-、-CH2-O-CH2-,^jf^j 优选地 Z 是基团。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中R1是选自低级烷基或环烷基 (C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团，更优选乙基基团。
49.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中&、民和R4是选自低级烷基或环烷基(C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团，更优选甲基基团。
全文摘要
一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合化学式(I)，其中A是成对取代的亚烷基基团，优选CH2，X和Y独立地选自S和O，并且R0是选自下组，该组由以下各项组成任选地取代的、碳键合的有机残基，例如特别是任选地取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和/或Ry是选自H以及有机残基并且至少Rx是一个非H的取代基。本发明的另一个目的是可用于寡核苷酸制造的硫化剂及其制造。
文档编号C07D207/48GK102307889SQ200980155288
公开日2012年1月4日 申请日期2009年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者何义刚, 维克托·索罗金, 维斯瓦夫·亚当·马祖尔 申请人:集润德斯股份公司