专利名称：抗人流感病毒人型抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及对人流感A型病毒的H3N2亚型具有中和活性、与人流感A型病毒的 H3N2亚型的血凝素HAl区域结合，或对人流感B型病毒具有中和活性的抗人流感病毒人型抗体。本申请要求通过参照而援引于此的日本申请特愿2008-330425号和特愿 2009-146832号优先权。
背景技术：
流感病毒属于正黏液病毒科，分为A型、B型和C型三个属，分别称为流感A型病毒、流感B型病毒、流感C型病毒。通常，流感病毒多数是指A型和B型。A型、B型和C型的不同是基于构成病毒粒子的蛋白质中、Ml蛋白质和NP蛋白质的抗原性的不同。另外，即使相同的A型或B型，也由于作为包膜表面上的分子的红细胞凝集素(血凝素，以下也简称为“HA”)和神经氨酸酶(NA)的抗原性的不同而分别分类为多个亚型和株，例如流感A型病毒分类为Hmi、H2N2、H3N2等各亚型。因为人流感A型病毒的HA和NA周期性地变异，所以即使接受对应于从前的亚型的疫苗接种，很多时候也不能期待其效果。流感A型病毒的HA，由称为球状部区域(head region)和干区域(stem region) 结构的不同区域构成，球状部区域含有病毒与靶细胞结合的受体结合部位、与HA的红细胞凝集活性相关，干区域含有对病毒的包膜与细胞的核内体膜间的膜融合必需的融合肽、与融合活性相关(非专利文献1)。识别流感A型病毒的H1N1、H2N2各亚型的抗HA抗体大部分是识别HA的球状部区域。但是，该区域是最容易发生抗原变异的部位，这些抗体无法通用地与人流感A型病毒的亚型反应，伴随着病毒的HA的抗原变化，很多时候失去了识别性。在专利文献1和非专利文献2中公开有利用流感A型病毒H3N2亚型的1种HA的干区域的氨基酸序列合成多肽、获得了与该多肽对应的抗体，但这些抗体的病毒中和活性弱(专利文献1)，另外用作抗原的多肽本身也不显示与用H3N2亚型免疫而得到的兔抗病毒血清发生反应，在抗原性这方面存在问题(非专利文献2)。如果能够得到对流感病毒的亚型通用地识别在HA分子或NA分子等中很难发生抗原变异的抗原部位、对流感病毒具有中和活性的抗体，则可以用于因病毒感染而导致的发病的诊断、预防以及治疗，并且该抗原部位本身也可用作疫苗。公开有对流感A型病毒的Hmi亚型和H2N2亚型具有病毒中和活性、对H3N2亚型不显示中和活性的抗体(专利文献2、3)。另外，公开有识别流感A型病毒的H3N2亚型的干区域的特定多肽序列、但不识别 HlNl亚型和H2N2亚型的抗体(专利文献4)。另外，公开有中和流感A型病毒的H3N2亚型的人Fab抗体(专利文献5、非专利文献3)。引起世界性流行、导致很多死者的流感是A型的人流感(专利文献2 4)。流感 A型病毒的H3N2亚型是过去引起世界性流行的亚型，近年来已报道即使对于金刚烷胺等具有抗流感病毒作用的药物，耐药性株也增多了(New York Times, January 15,2006)。但是， 对于流感A型病毒的H3N2亚型、流感B型病毒，没有报道针对近20年高度保守的区域有效地显示中和活性的抗体。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特表昭59-501714号公报专利文献2 日本特开平6-100594号公报专利文献3 日本特开平7465077号公报专利文献4 日本特开平7-304799号公报专利文献5 日本特开2006-2M777号公报非专利文献非专利文献1 :Rev. Biochem.，56，365-394 (1987)非专利文献2 =Cell, 28,477-487 (1982)非专利文献3 =Microbiol. Immunol. ,52,162-170(2008)
发明内容
本发明的课题是提供对人流感病毒具有中和活性的人型抗体。更详细而言，课题是提供对人流感A型病毒的H3N2亚型或人流感B型病毒识别高度保守的区域、具有中和活性的人型抗体。本发明人等为了解决上述课题进行了认真研究，结果发现可以使用从流感疫苗接种后的健康人获得的末梢血单核细胞和能够高效地与来自人的淋巴细胞进行细胞融合的细胞来制造杂交瘤细胞，筛选出与来自流感病毒的蛋白质具有结合活性的抗体产生细胞， 由此生产抗人流感病毒人型抗体。在得到的抗体中，筛选出尤其对于人流感A型病毒的 H3N2亚型或人流感B型病毒可识别高度保守的区域、具有中和活性的人型抗体，由此得到本发明的抗体。S卩，本发明如下所述。1. 一种抗人流感病毒人型抗体，对人流感A型病毒H3N2亚型具有中和活性、与人流感A型病毒H3N2亚型的血凝素HAl区域结合，或对人流感B型病毒具有中和活性。2.如前项1所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗人流感病毒人型抗体对人流感A型病毒Hl亚型和人流感A型病毒H2亚型没有中和活性。3.如前项1所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，其是抗流感人型抗体，对人流感 A型病毒H3N2亚型具有中和活性的抗体至少对A/Hiroshima/52/05株具有中和活性，对人流感B型病毒具有中和活性的抗体至少对B/Malaysia/2506/04株具有中和活性。4.如前项1 3中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，在构成人流感A型病毒H3N2亚型的血凝素HAl的氨基酸序列中，抗体识别的抗原决定部位是从N末端计数包含第173-181氨基酸序列的区域和/或包含第227-239氨基酸序列的区域。5.如前项4所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗原决定部位包括含有以下序列号1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在这些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或导入1 2个氨基酸的任一种氨基酸序列，dnfdklyiwg (序列号 ι)；2) kfdklyiffg (序列号 2)。
6.如前项4所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗原决定部位包括含有以下序列号3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在这些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或导入1 2个氨基酸的任一种氨基酸序列，1) SSRISIYWTIVKP (序列号 3)；2)PSRISIYWTIVKP(序列号 4)。7. 一种抗人流感病毒人型抗体，编码抗体可变区域的DNA碱基序列包括选自以下序列号5 12表示的任一种碱基序列中的碱基序列；或者在这些碱基序列中，取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的任一种碱基序列，1)GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGTGGGTC TCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGGGACAA TTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCG ACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (序列号5)；2)GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACT TGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCCTCA TCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTCTC ACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列号 6)；3)CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCA AGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG GGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTCGACAC CTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG GAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (序列号7)；4)CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTG GCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACG CTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGACGCTGC CCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGATTGGG TTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列号 8)；5)CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCACCTGCG TTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCCTGGAG TGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCAGTAGA GACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAG AGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACC GTCTCCTCA (序列号钔；6)GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCTTC GGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列号 10)；7)CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG AGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGT GGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCAGAGACA ATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCGAGAGAG TTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTCA (序列号 11)；8)CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCTCTTGTT CTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGACTCCTC ATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCT GGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTCGTCCGG TGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列号 12)。8.如前项7所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗人流感病毒人型抗体的抗原是人流感病毒的 A/Hiroshima/52/05 株或 B/Malaysia/2506/04 株。9.如前项7所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，在编码抗体可变区域的DNA中， 具有序列号5 8表示的可变区域的抗体是对人流感A型病毒的H3N2亚型具有中和活性的抗体；具有序列号9 12表示的可变区域的抗体是对人流感B型病毒具有中和活性的抗体。10.如前项8所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，在编码抗体可变区域的DNA中， 序列号5、7、9和11所示的DNA是编码重链可变区域的DNA ；序列号6、8、10和12所示的DNA 是编码轻链可变区域的DNA。11.如前项1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗体是全 (intact)抗体。12. 一种含有多核苷酸的DNA，是编码权利要求1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体的可变区域的DNA，该多核苷酸由下述碱基序列构成选自以下序列号5 12 所示的任一种碱基序列的碱基序列；或者在这些碱基序列中，取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的任一种碱基序列，1)GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGTGGGTC TCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGGGACAA TTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCCG ACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (序列号5)；2)GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACT TGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCCTCA TCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTCTC ACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列号 6)；
3)CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCA AGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG GGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTCGACAC CTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG GAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (序列号7)；4)CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTG GCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACG CTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGACGCTGC CCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGATTGGG TTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列号 8)；5)CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCACCTGCG TTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCCTGGAG TGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCAGTAGA GACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAG AGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACC GTCTCCTCA (序列号钔； 6)GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCT CACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCTTC GGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列号 10)；7)CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG AGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGT GGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCAGAGACA ATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCGAGAGAG TTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTCA (序列号 11)；8)CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCTCTTGTT CTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGACTCCTC ATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCT GGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTCGTCCGG TGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列号 12)。13. 一种组合物，含有前项1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体。本发明的抗人流感病毒人型抗体对人流感A型病毒H3N2亚型或人流感B型病毒各自的高度保守的区域具有中和活性。具体而言，在本发明的抗体中，针对人流感A型病毒H3N2亚型的抗体至少对A/ Hiroshima/52/05株(2005年分离)的病毒株具有中和活性，针对人流感B型病毒的抗体至少对B/Malaysia/2506/04株(2004年分离)病毒株具有中和活性。另外，对各年代的流感病毒疫苗株例如A/Aichi/2/68株(1968年分离)、A/Guizhou/54/89株(1989年分离)、A/ffyoming/3/03 株(2003 年分离)、A/New York/55/04 株(2004 年分离)和 A/ Hiroshima/52/05株(2005年分离)等人流感A型病毒H3N2亚型的各病毒也具有中和活性，或者对 B/Victoria/2/87 株(1987 年分离)、B/Malaysia/2506/04 株(2004 年分离)、 B/Mie/1/93株(1993年分离)、B/Shanghai/261/02株(2002年分离)等人流感B型病毒的各病毒也具有中和活性。另外，本发明的针对人流感A型病毒H3N2亚型的抗体，在体内预防性或治疗性给药时，至少对于流感病毒A/Guizhou/54/89xA/PR/8/34 (H3N2)株感染而言，在生存率和体重减少方面显示出效果。S卩，本发明的针对人流感A型病毒H3N2亚型的抗体对保守近20年的区域具有活性、对保守40年以上的区域具有活性。另外，针对人流感B型病毒的抗体对保守20年以上的区域具有活性。另一方面，本发明的抗体的HI (hemagglutination inhibition、红细胞凝集抑制)活性在检测限以下。
[图1]是表示用蛋白免疫印迹试验确认产生八-1、八-2、8-1、8-2、8_3、(-1、0-1、 D-2、E-I或E-2单克隆抗体的各杂交瘤细胞的培养上清液对各流感病毒HA的反应性的结果的图。(实验例1-2)[图2]是表示确认杂交瘤细胞的培养上清液对各年代的流感病毒疫苗株的中和活性的结果的图。(实验例1-4)[图3]是表示B-I单克隆抗体的重链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图4]是表示B-I单克隆抗体的轻链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图5]是表示D-I单克隆抗体的重链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图6]是表示D-I单克隆抗体的轻链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图7]是表示E-2单克隆抗体的重链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图8]是表示E-2单克隆抗体的轻链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图9]是表示B-3单克隆抗体的重链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图10]是表示B-3单克隆抗体的轻链可变区域的序列的图。(实验例1-5)[图11]是表示确认产生A-2、B-1、B-2、D_1各单克隆抗体的杂交瘤细胞上清液对流感病毒疫苗株感染细胞的染色图像的结果的图。(实验例1-6)[图12]是表示确认产生B-3和E-2单克隆抗体的各单克隆抗体的杂交瘤细胞上清液对流感病毒疫苗株感染细胞的染色图像的结果的图。(实验例1-7)[图13]是表示B-I和D-I各单克隆抗体对于人流感A型病毒H3H2亚型的各流感病毒疫苗株的血凝素HAl区域进行识别的肽链(抗原决定部位)的序列的图。(实验例 1-8)[图14]是表示B-I和D-I各单克隆抗体所识别的肽链在人流感A型病毒H3H2亚型的血凝素HAl区域的立体结构上的配置的图。(实验例1-8)[图15]是表示B-I和D-I各单克隆抗体所识别的肽链与数据库上的抗原决定部位的对比的图。(实施例1-8)
[图16]是表示将B-I和D-I各单克隆抗体对各5只鼠进行预防性给药时的生存率的图。(实验例2-1)[图17]是表示将B-I或D-I各单克隆抗体对各5只鼠进行预防性给药时的体重变化的图。曲线表示各个体的体重变化。(实验例2-1)[图18]是表示将B-I或D-I各单克隆抗体对各5只鼠进行治疗性给药时的生存率的图。(实验例2-2)
[图19]是表示将B-I或D-I各单克隆抗体对各5只鼠进行治疗性给药时的体重变化的图。曲线表示各个体的体重变化。(实验例2-2)
具体实施例方式本发明涉及具有下述特性(a) (C)的抗人流感病毒人型抗体。(a)对人流感A型病毒H3N2亚型的A/Hiroshima/52/05株(2005年分离)的病毒株具有中和活性，或对人流感B型病毒的B/Malaysia/2506/04株(2004年分离)病毒株具有中和活性。(b)HI (hemagglutination inhibition，红细胞凝集抑制)在检测限以下。(c)另外，本发明的各抗体对人流感A型病毒Hmi亚型和人流感A型病毒H2N2亚型没有中和活性。针对人流感A型病毒H3N2亚型的本发明的抗体至少对A/Hiroshima/52/05株 (2005年分离)具有中和活性，还对各年代的流感病毒疫苗株如A/Aichi/2/68株(1968年分离)、A/Guizhou/54/89 株(1989 年分离)、A/Wyoming/3/03 株(2003 年分离)和 A/New York/55/04株(2004年分离)等人流感A型病毒H3N2亚型的各病毒具有中和活性。另外， 针对人流感B型病毒的本发明的抗体至少对B/Malaysia/2506/04株(2004年分离)具有中和活性，还对各年代的流感病毒疫苗株、B/Victoria/2/87株(1987年分离)、B/Mie/l/93 株(1993年分离)、B/Shanghai/261/02株(2002年分离)等人流感B型病毒的各病毒具有中和活性。在具有上述特性的本发明的抗体中，针对人流感A型病毒H3N2亚型的抗体识别从构成上述人流感A型病毒的血凝素HAl的氨基酸序列的N末端计数包含第173-181氨基酸序列的区域和/或包含第227-239氨基酸序列的区域。其中，关于构成人流感A型病毒 H3N2 亚型的氨基酸序列，A/Hiroshima/52/05 株公开在 GenBank Accession No. EU501660, A/Guizhou/54/89 株公开在 GenBank Accession No. D49963, A/ffyoming/3/03 株公开 ^t GenBank Accession No. AY531033, A/New York/55/04 W7^Jf ^ GenBank Accession No.EU501486。在构成上述人流感A型病毒的血凝素HAl的氨基酸序列中，从N末端计数第227 位氨基酸是S(丝氨酸)或P(脯氨酸)，但这种不同对中和活性没有影响。即使在文献上 (Karoline et al Virology J. 2008，5，40)，相同位置也是S或P。该第173位的变异是 N(天冬酰胺)或K(赖氨酸)，除1968年的A/Aichi以外为K，文献上是K或E(谷氨酸)。 另外，对于第229和第230位，在文献上(Underwood, Mol. Immunol.，1987，21，7)，分别是 R(精氨酸)或G(甘氨酸)、1(异亮氨酸)或V(缬氨酸)的不同，对于第238和239位，也是在GenBank的登记序列中分别是K或N、P或R的不同氨基酸。
鉴于上述情况，包含第173-181氨基酸序列的区域的肽链(抗原决定部位)具体包括含有序列号1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；另外在这些序列中，可取代、缺失、添加、导入1 2个氨基酸的氨基酸序列。包含第227-239氨基酸序列的区域的肽链 (抗原决定部位)具体包括含有序列号3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或在这些序列中，可取代、缺失、添加、导入1 2个氨基酸的氨基酸序列。1) NFDKLYIffG (序列号 1) 2) KFDKLYIffG (序列号 2)3) SSRISIYWTIVKP (序列号 3)4)PSRISIYWTIVKP(序列号 4)编码具有上述特性的本发明抗体的可变区域的DNA碱基序列具体如下所示。A-1.针对人流感A型病毒H3N2亚型的人型抗体(B_l)重链可变区域序列GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAG GGGCTGGAGTGGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCAC CATCTCCAGGGACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATT ACTGTGCGAAATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATG GTCACCGTCTCTTCA(序列号 5)。轻链可变区域序列GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACA GAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCC CCTAGGCTCCTCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACA GACTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCT TCTCAGTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(序列号 6)。A-2.针对人流感A型病毒H3N2亚型的人型抗体(D_l)重链可变区域序列CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA GGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGT CTTCTCCTTCGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATT ACTGTGCGAGAGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCA(序列号 7)。轻链可变区域序列CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAG TCACACTCACTTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGC CAGGCTCCACGCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCT TGGGAGCGACGCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGC CTAGTGGCGATTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT(序列号 8)。B-1.针对人流感B型病毒的人型抗体(E-2)重链可变区域序列CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCC TGTCCCTCACCTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCA GAGAGGGGCCTGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAAC TACCATCTCAGTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAG GGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCA(序列号 9)。轻链可变区域序列GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC AGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGC CCCCCACCTTCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA(序列号 10)。B-2.针对人流感B型病毒的人型抗体(B-3) 重链可变区域序列CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAG GGGCTTGAGTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCAC CGTGTCCAGAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATT ACTGTGCGAGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC GTCGCCTCA(序列号 11)。轻链可变区域序列CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGG TCATCATCTCTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCG GCCCCGAGACTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGG CACCTCTGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACA GCCTGACTCGTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT(序列号 12)。本发明的抗体只要是具有上述特性的抗体即可，没有特别限定。例如，针对人流感 A型病毒H3N2亚型的人型抗体的可变区域的碱基序列不限定于上述序列号5 8中任一项所示的碱基序列，只要是对人流感A型病毒H3N2亚型具有中和能力的碱基序列，则可以是在上述序列中取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的碱基序列。作为取代1 多个核苷酸的例子，例如可以通过密码子的简并等从而具有中和能力但碱基序列不同。优选对A 型病毒H3N2亚型具有中和能力的抗体可以是进一步识别上述各肽链(抗原决定部位)中任一种的抗体。另外，针对人流感B型病毒的人型抗体的可变区域的碱基序列也同样地不限定于上述序列号9 12中任一项所示的碱基序列。只要是对人流感B型病毒具有中和能力的碱基序列，则可以是在上述序列中取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的碱基序列。作为取代1 多个核苷酸的例子，例如可以通过密码子的简并等从而具有中和能力但碱基序列不同。使用细胞融合法得到的单克隆抗体通常是来自免疫动物、例如来自鼠，但是因为当把鼠型抗体给予人时作为异物而被代谢，所以鼠型抗体在人体中的半衰期较短、不能充分地发挥期待的效果。另外，对给予的鼠型抗体而产生的人抗鼠抗体(HAMA)会引起血清病或其它过敏反应等，对患者来说是不利的且引起危险的免疫应答。因此，其它动物型的单克隆抗体用于人的医学疗法的价值受到限制。因而，在将单克隆抗体作为医药品等给药人时， 强烈希望是人型抗体。人型抗体的制造方法可以采用本身公知的方法或今后开发的所有方法，但不存在能普遍适用于人型抗体中任意抗体的统一的方法，为了制造对特定抗原显示充分的结合活性、中和活性的人型抗体，需要各种努力。例如可以参照Sato，K. et al, Cancer Res.，53，851-856，1993、日本特开2008-161198号公报。作为人型抗体的类型，没有特别限定，可以是Fab型也可以是Intact型。为了有效地发挥抗体活性，优选Intact型的抗体。Intact 型的抗体，没有特别限定，例如可以形成如下抗体抗体的互补决定区(complementarity determinig region ⑶R)来自原来的动物类，恒定区(C区域)来自适当的人。嵌合抗体是通常将含有免疫动物类抗体的CDR的可变区域连结到人抗体的恒定区而形成的抗体，可以通过基因重组技术而容易地构建。另外，也可以是将免疫动物类抗体的CDR移植到人型抗体的可变区域的基于CDR接枝的人型化抗体。因为CDR区域频繁发生氨基酸取代，所以从抗原性的观点出发，可以具有含有来自人的CDR的人型抗体和来自免疫动物类的CDR。具有上述特性(a) (C)的本发明的抗人流感病毒人型抗体，具体而言可通过以下的方法制造。流感疫苗接种后，从2 4周后的健康人采取IOmL血液中的末梢血单核细胞，使用与来自人的淋巴细胞能高效进行细胞融合的来自人的配偶体细胞(partner cell)、例如SPYMEG细胞(MBL公司制)和聚乙二醇法等方法来进行细胞融合从而简便且有效率地制造杂交瘤细胞，通过利用使HA等来自流感 病毒的纯化蛋白质固相化的ELISA法、 或以流感病毒感染细胞作为抗原的染色法来筛选出与来自流感病毒的蛋白质具有结合活性的抗体产生细胞，由此可以产生抗人流感病毒人型抗体。作为其它制造方法，例如构建在大肠杆菌噬菌体的表面呈现人型抗体片段的、所谓人组合抗体文库，利用生物淘选筛选抗体，从而可以得到期望的人型抗体。此时，可以在不经由对动物进行免疫操作的情况下筛选期望的抗体。本发明还涉及含有本发明的抗体的组合物。另外，在将本发明的组合物用于医药用途时，可以有效量含有本发明的抗人流感病毒人型抗体中的1种或多种，进一步可以含有药学上容许的载体。在本发明中，作为药学上容许的盐，可举出以下。作为碱性添加盐，可举出例如钠盐、钾盐等碱金属盐；例如钙盐、镁盐等碱土类金属盐；例如铵盐；例如三甲胺盐、三乙胺盐，二环己基胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐等脂肪族胺盐；例如N，N- 二苄基乙二胺等芳香胺盐；例如吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等杂环芳香族胺盐；例如四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等季铵盐；精氨酸盐、 赖氨酸盐等碱性氨基酸盐等。作为酸添加盐，可举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、过氯酸盐等无机酸盐；例如乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐等有机酸盐；例如甲磺酸盐、羟乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；例如天冬胺酸盐、谷氨酸盐等酸性氨基酸等。该组合物作为医药组合物可以口服或非口服给药。口服给药时，本发明的抗人流感病毒人型抗体可以以通常的制剂例如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等固形剂，水剂、油性悬浮剂、糖浆剂或酏剂等液剂中任一种剂型来使用。非口服给药时，本发明的抗人流感病毒人型抗体可以以水性或油性悬浮注射剂、点鼻液来使用。在其制备时，可任意使用惯用的赋形剂、粘合剂、润滑剂、水性溶剂、油性溶剂、乳化剂、悬浮化剂、保存剂、稳定剂等。实施例为了帮助理解本发明，以下例示实施例和实验例来具体说明本发明，但并不能说本发明受这些限定。
(实施例1)抗人流感病毒人型抗体的制造本实施例中，针对使用杂交瘤细胞、制造单克隆抗体进行说明。1)病毒的制备使用从国立感染症研究所得到的人流感疫苗株即作为A型病毒Hmi亚型的A/New Caledonia/20/99株、作为H3N2亚型的A/Hiroshima/52/05株、作为人流感B型病毒的B/ Malaysia/2506/04株，使它们分别感染MDCK细胞(狗肾上皮细胞株)，在胰蛋白酶存在下 37°C培养2 3天后，采取病毒。2)流感病毒HA抗原的纯化流感病毒HA抗原的纯化可用本领域人员所周知的方法进行。将上述各流感病毒疫苗株接种到孵化鸡蛋，在33 35°C培养2天后，在4°C放置一晚，采取感染尿膜腔液。接着，以超滤法等浓缩，用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒粒子。即在0 60%的蔗糖密度梯度中以旋转数35000rpm进行超离心，采取蔗糖密度40 %左右的部分。将该浓缩病毒部分醚处理后，添加甲醛溶液，用蔗糖密度梯度离心法进一步纯化，得到流感HA抗原。 3)杂交瘤细胞的制造从接种2006/2007年季节流感疫苗、具体而言为由作为人流感A型病毒H3N2亚型的A/Hiroshima/52/05株或作为人流感B型病毒的B/Malaysia/^2506/04株制备的流感疫苗后的健康人中，在疫苗接种2 4周后，采取IOmL末梢血，使用Ficoll Paque Plus (GE Healthcare公司制)等来采取单核细胞部分、作为杂交瘤细胞制造用细胞部分。在细胞融合前用不添加血清的DMEM清洗单核细胞部分，得到作为杂交瘤细胞制作用细胞的单核细胞。作为制作杂交瘤细胞的配偶体细胞，使用作为鼠骨髓瘤细胞和人原巨核细胞的杂交骨髓瘤细胞的SPYMEG细胞(MBL公司制)。在细胞融合前用不添加血清DMEM清洗以添加10% 胎牛血清DMEM培养基传代SPYMEG细胞后培养2天而得到的产物。然后，将上述得到的单核细胞和SPYMEG细胞按照细胞数1 5 1 10的比例混合，进行离心分离除去上清液。充分松散沉淀的细胞块后，边搅拌边经1分钟缓慢添加50% 聚乙二醇1500-PBS溶液0. 6mL,然后经2分钟缓慢加入IOmL不添加血清DMEM。再添加IOmL 不添加血清DMEM后，添加ImL胎牛血清，结束细胞融合。接着，离心分离后除去上清液，用 20mL不添加血清DMEM清洗。最后，慢慢地分散细胞，加入120mL HAT培养基{在添加15%胎牛血清DMEM中加入HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)和BM condimed(Roche 公司制)等的人杂交瘤细胞用培养基添加剂而形成的培养基}，用移液管慢慢地将细胞悬浮。4)杂交瘤细胞的克隆将上述3)的细胞悬浮液分注到6个培养用96孔微型板中，在含有5% CO2的培养器中、在37°C培养10 14天。在此期间，间隔3 4天交换HAT培养基的一半量。接着， 取培养上清液的一部分、筛选杂交瘤细胞。在ELISA用96孔微型板中，将上述2)中制备的纯化HA抗原(1 μ g/孔)固相化， 进一步用5%脱脂乳粉的PBS-0. 1% Tween 20 (TBS-T)溶液封闭。之后，将上述的细胞悬浮液培养后的培养上清液50 μ L加入到该ELISA用微型板的各孔中，在37°C反应30分钟，在孔的固相上形成由纯化HA抗原和抗HA抗原抗体(抗人流感病毒人型抗体)构成的一次免疫复合物。该一次免疫复合物与过氧化物酶标记抗山羊抗体反应后，利用着色过氧化物酶反应从而检出培养上清液中的抗人流感病毒人型抗体。接着，将确认有该抗体产生的细胞进行增殖的培养用微型板的各孔中所含有的细胞取出，进行3次有限稀释法，利用上述相同方法克隆目的细胞。将克隆的杂交瘤细胞株设为 R1D8、K4E7 和 G4G11。5)抗体的纯化将各杂交瘤细胞株在使培养液中的胎牛血清含量从10%降到2%、最终为无血清的培养液中培养。将在无血清培养液中培养3 7天的各杂交瘤细胞的培养上清液IOOmL 以2000rpm离心处理10分种，用0. 45 μ m过滤器过滤得到的上清液、除去固体成分，利用 ImL 使 Protein G 固定化的 6%琼脂凝胶(HiTrap Protein G HPTM、GE Healthcare 公司制)进行纯化。将杂交瘤细胞株R1D8、K4E7和G4G11产生的单克隆抗体分别命名为B-1、 D-I和E-2。同样地，纯化作为单克隆抗体的来自其它杂交瘤细胞上清液的A-l、A-2、B-2、 B-3、C-l、D-2和E-I等单克隆抗体。(实验例1-1)各杂交瘤细胞的培养上清液的性状 1)中和活性各杂交瘤细胞培养上清液的对各流感病毒的中和活性测定按照Arch. Virol.，86， 129-135(1985)、Microbiol. Immunol.，29，327-335 (1985)进行。在96孔微型板(中和活性测定用)中，以2X IO4个/孔分注MDCK细胞，在37°C 培养一晚。等量混合通过RDE处理除去非特异抑制剂的各抗体的培养上清液的8倍稀释液、 与将从以下的流感病毒疫苗株得到的病毒溶液分别按照100病灶(focus)形成单位/孔的方式制备而成的物质，在37°C保温1小时。然后将30 μ L该混合液分注到加入了上述培养的MDCK细胞的微型板的各孔中，在37°C保温30分钟。接着，除去各孔的溶液、用PBS清洗各孔，加入不添加胎牛血清MEM。在37°C保温6 10小时后，除去添加液，室温下用无水乙醇处理细胞10分钟，固定细胞。干燥各孔，利用与染色试验同样的酶抗体染色法进行细胞染色。染色后，用自来水清洗细胞，干燥后，在光学显微镜下数出染色的病灶数。中和活性用病灶减数率表示。将其结果示于表1。人流感病毒疫苗株A.流感 A 型A/New Caledonia/20/99 株(HI)、A/Hiroshima/52/05 株(H3N2)B.流感 B 型B/Malaysia/2506/04 株2)抗体的红细胞凝集抑制活性(HI)向96孔微型板(红细胞凝集抑制活性(HI)测定用)的各孔中加入25 μ L的RDE 处理后的杂交瘤细胞培养上清液的梯度稀释液(2 64倍)，接着，与各上述1)中用到的病毒(8ΗΑ单位/50 μ L) 25 μ L混合，在室温反应30分钟。之后，加入0. 75%土拨鼠红细胞 50 μ L充分混和，研究杂交瘤细胞培养上清液中的抗体给予各病毒的红细胞凝集活性的影响。将其结果示于表1。[表 1]表1针对流感病毒的人型单克隆抗体
权利要求
1.一种抗人流感病毒人型抗体，其特征在于，对人流感A型病毒H3N2亚型具有中和活性、与人流感A型病毒H3N2亚型的血凝素HAl区域结合，或对人流感B型病毒具有中和活性。
2.如权利要求1所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗人流感病毒人型抗体对人流感A型病毒Hl亚型和人流感A型病毒H2亚型没有中和活性。
3.如权利要求1所述的抗人流感病毒人型抗体，其是抗流感人型抗体，对人流感A型病毒H3N2亚型具有中和活性的抗体至少对A/Hiroshima/52/05株具有中和活性，对人流感B 型病毒具有中和活性的抗体至少对B/Malaysia/2506/04株具有中和活性。
4.如权利要求1 3中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗体识别的抗原决定部位是，构成人流感A型病毒H3N2亚型的血凝素HAl的氨基酸序列中从N末端计数包含第173-181氨基酸序列的区域和/或包含第227-239氨基酸序列的区域。
5.如权利要求4所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗原决定部位包括含有以下序列号1或2表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在这些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或导入1 2个氨基酸的任一种氨基酸序列，1)序列号1 =NFDKLYIffG,2)序列号2 :KFDKLHWG。
6.如权利要求4所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗原决定部位包括含有以下序列号3或4表示的氨基酸序列的氨基酸序列；或者在这些氨基酸序列中，取代、缺失、添加或导入1 2个氨基酸的任一种氨基酸序列，1)序列号3 :SSRISIYWTIVKP,2)序列号4 :PSRISIYWTIVKPo
7.一种抗人流感病毒人型抗体，编码抗体可变区域的DNA碱基序列包括选自以下序列号5 12表示的任一种碱基序列中的碱基序列；或者在这些碱基序列中，取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的任一种碱基序列，1)序列号5 :GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGT GGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGG GACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA ATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCT CTTCA，2)序列号6 :GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCC TCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTC TCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA，3)序列号7 :CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC CTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGT GGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTC GACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA，4)序列号8 :CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCAC TTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCAC GCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGAC GCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGA TTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT,5)序列号9 :CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCAC CTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCC TGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCA GTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGC CAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGG TCACCGTCTCCTCA,6)序列号10 :GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC CTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAC TCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCT TCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA，7)序列号11 :CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGA GTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCA GAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCG AGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTC A,8)序列号12 :CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCT CTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGA CTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGC CTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTC GTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT。
8.如权利要求7所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗人流感病毒人型抗体的抗原是人流感病毒的 A/Hiroshima/52/05 株或 B/Malaysia/2506/04 株。
9.如权利要求7所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，在编码抗体可变区域的DNA中， 具有序列号5 8表示的可变区域的抗体是对人流感A型病毒的H3N2亚型具有中和活性的抗体；具有序列号9 12表示的可变区域的抗体是对人流感B型病毒具有中和活性的抗体。
10.如权利要求8所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，在编码抗体可变区域的DNA中， 序列号5、7、9和11所示的DNA是编码重链可变区域的DNA ；序列号6、8、10和12所示的DNA 是编码轻链可变区域的DNA。
11.如权利要求1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体，其中，抗体是全抗体。
12. —种含有多核苷酸的DNA，其特征在于，是编码权利要求1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体的可变区域的DNA，该多核苷酸由下述碱基序列构成选自以下序列号5 12所示的任一种碱基序列的碱基序列；或者在这些碱基序列中，取代、缺失、添加或导入1 多个核苷酸的任一种碱基序列，1)序列号5 :GAGGAGAACCTGTTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGGCTCTGGATTCACGTTTAGTACTTACGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGACAGGGGCTGGAGT GGGTCTCCTCTATTAGCGGTAGTGGTGAAATTTCCTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCTGTTCACCATCTCCAGG GACAATTCCAAGGACACAGTGTTTCTGCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAA ATCCGACGTTTGGGAGGGTTATCGACCCTCAAAAGATGCTCTTCATATGTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCT CTTCA，2)序列号6 :GACGTCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGTCGGGCAAGTCAGAGCGTGAGCAATTATGTGAATTGGTATCAACAGAAGCCAGGGAGAGCCCCTAGGCTCC TCATCTCTAGTGCGTCCAATTTGTGGGCTGGGGTCCCGCCAAGTTCAGTGGCCGTGGAGAAGAGACAGACTTCACTC TCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGACCTTCTCAGTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA，3)序列号7 :CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTC CTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCTCTTATTCTATATATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGT GGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAAGCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTC GACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGGGAGATTACGATATTTTGACTGGTTATTATTATTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA，4)序列号8 :CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCAC TTGTGGCTTGAGCTCTGGCTCAGTCTCTCCTAGTTACTACGCCAGCTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCAC GCACGCTCATCTACAACACAAACACTCGCTCCTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCTTCCTTGGGAGCGAC GCTGCCCTCACCATCACGGGGGCCCAGGCAGATGATGAGTCTGATTATTTCTGTGTGCTGTATATGCCTAGTGGCGA TTGGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT,5)序列号9 :CAGGTGCAGTTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTTACAGACCCTGTCCCTCAC CTGCGTTGTCTCTGGTGACTCCATCAGCAGGGGTGGTTACTACTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGAGAGGGGCC TGGAGTGGATTGGGGACATCTATCACAGTGGGAGTACCAACTACAACCCGGCCCTCAAGAGTCGAACTACCATCTCA GTAGAGACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGC CAGAGAGCCTCCACCTGACTACAGTGACTACAAGGTTGGGAAGGGTTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGG TCACCGTCTCCTCA,6)序列号10 :GAAATTGTGTTGGCACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTGAGACCGTTGACACCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC CTCATAAATGATGCATCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAC TCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGGTGTCAGCAGCATAGCAACTGGCCCCCCACCT TCGGCCAAGGGTCACGGCTGGAGATTAAA，7)序列号11 :CAGGTGAAGTTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCGCAGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGAGGCGTCTGGATTCGACTTCACTGTGTATGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTTGAGTGGGTGGCATCTATTTGGCATAACGGAGGAAAAGCATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTGTCCA GAGACAATCCCCAGAAGACAGTGTATCTGCAAATGAGTGGCCTGAGACCCGAGGACACGGCTACATATTACTGTGCG AGAGAGTTTCCTTTCATGGGCATCTATGACTACGGCATGGACGCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCGCCTC A，8)序列号 12 :CAGTCTGTGCTGGCTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCATCATCT CTTGTTCTGGAACCTCCTCCAACATCGGCGGTAATTCTGTCAACTGGTACCAGCACCCCCCAGGGGCGGCCCCGAGA CTCCTCATCTATACTACCGATCAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGC CTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAATCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGAAGTTTGGGATGACAGCCTGACTC GTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTACGT。
13. —种组合物，含有权利要求1 11中任一项所述的抗人流感病毒人型抗体。
全文摘要
本发明涉及对人流感病毒具有中和活性的人型抗体。更详细而言，涉及识别人流感A型病毒的H3N2亚型或人流感B型病毒的高度保守的区域、具有中和活性的人型抗体。抗人流感病毒·人型抗体对人流感A型病毒H3N2亚型具有中和活性、与人流感A型病毒H3N2亚型的血凝素HA1区域结合，或对人流感B型病毒具有中和活性；编码抗体可变区域的DNA碱基序列包含序列号5～12所示任一种的序列。
文档编号C07K16/10GK102264896SQ20098015293
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月24日 优先权日2008年12月25日
发明者久原基树, 井手野祥次, 大下昌利, 奥野良信, 柚木干弘, 生田和良, 百田匡寿, 纐缬律子 申请人:一般财团法人阪大微生物病研究会, 国立大学法人大阪大学, 株式会社医学生物学研究所