专利名称：用于产生针对细胞相关抗原如p2x7、cxcr7或cxcr4的免疫球蛋白的基因免疫的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于产生针对细胞相关抗原、更具体地是膜锚定的抗原的免疫球蛋白序列的方法。本发明还提供可通过本发明的方法获得的免疫球蛋白序列。具体地，本发明涉及利用DNA疫苗接种产生免疫球蛋白序列。更具体地，本发明涉及通过DNA疫苗接种在骆驼科动物中产生免疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列优选地针对细胞相关抗原，特别是具有多个跨膜结构域的抗原，包括GPCRs和离子通道。此外，本发明涉及针对细胞相关抗原的所述免疫球蛋白序列，更具体地，针对膜锚定的抗原的所述免疫球蛋白序列，所述抗原诸如例如，GPCRs和离子通道，更优选的是离子通 道。细胞相关抗原，更具体是具有单个或多个跨膜结构域的那些，难以以其天然构象纯化。为了鉴定能够在体内修饰靶标功能的针对天然表位的抗体(或抗体片段，诸如纳米抗体)，将靶抗原以其天然构象施用至骆驼科动物是非常重要的[Dormitz等.(2008). Trends in Biotechnology (生物技术趋势)26 :659_667]。在不存在纯化的这些细胞相关抗原的天然蛋白时，最适用的免疫策略由以规则的时间间隔重复注射功能性表达所选抗原的全细胞组成。WO 05/044858和WO 07/042289中记述了已经成功实施了所述免疫策略(即， 导致对中和性、体内成熟的纳米抗体的鉴定)的靶标的实例。然而，重复加强注射表达靶标的细胞通常导致变弱的或不能检测的靶标特异性免疫反应，特别是当所述靶标的表达水平很低且宿主细胞背景是高度免疫原性时。通过使用骆驼来源的细胞系，其对美洲驼(llama) 的免疫原性较弱，体液反应可以更集中针对所述靶标。然而，重复注射(准)自体-表面标记还导致针对骆驼细胞系表面标记的反应。鉴定针对GPCRs、离子通道或任意其它类型的多跨膜细胞表面标记的(中和性)选择性抗体是具有挑战性的[Michel 等.(2009). Naunyn-Schmied Archives Pharmacology 379:385-388]，因为i)最常见的是，没有一种天然蛋白可以用于免疫或随后的抗体鉴定， )多跨膜通常表现出较低的免疫原性(由于与大多数单跨膜受体相比，有限数量的细胞外表面暴露的氨基酸残基所导致)，和iii)多跨膜表面分子通常以较低的密度表达。
背景技术：
免疫球蛋白序列，诸如抗体和来源于其的抗原结合片段，在研究和治疗性应用中广泛用于特异性靶向其各自的抗原。典型地，抗体的产生包括对实验动物的免疫，生产抗体的细胞的融合以产生杂交瘤和对所需要的特异性的筛选。备选地，可以通过筛选天然或合成的文库，例如，通过噬菌体展示，产生抗体。已在多种出版物中广泛记述了免疫球蛋白序列如纳米抗体的产生，在所述出版物中，可以示例的有 WO 94/04678,Hamers-Casterman 等· 1993 和 Muyldermans 等· 2001。在这些方法中，将骆驼科动物用靶抗原免疫，以诱导针对所述靶抗原的免疫反应。进一步筛选由所述免疫获得的所有纳米抗体以获得结合所述靶抗原的纳米抗体。在这些情形中，抗体的产生需要纯化的抗原以用于免疫和/或筛选。抗原可以从天然来源、或在重组生产过程中进行纯化。—种重要种类的潜在的治疗靶标是细胞相关抗原，其包括跨膜抗原，特别是具有多个跨膜结构域的跨膜抗原。然而，细胞相关抗原，尤其是膜结合的抗原，难以以其天然构象获得，原因在于它们包埋在细胞膜中或者锚定在细胞膜中。然而，为了获得针对以天然构象存在的表位(即，构象表位，其存在于体内)的免疫球蛋白序列，用处于正确构象的靶抗原进行免疫是关键的。所述构象表位对于产生药用活性免疫球蛋白序列是极为重要的。例如，与离子通道的孔区特异性相互作用的免疫球蛋白序列将影响其传导性，且因此提供药学 作用。免疫和/或筛选免疫球蛋白序列可以使用所述抗原的肽片段进行。然而，所述方法不会提供针对构象依赖型表位的抗体，因为所述表位不能通过短的合成肽而复制。因此，对于这些细胞相关抗原，用携带所述抗原的全细胞免疫和随后对以这种方式诱导的全体纳米抗体筛选结合所述细胞相关抗原的纳米抗体是一种选择(如例如在WO 2005/044858 ；WO 2007/042289 ；WO 2008/074839 ；WO 2009/068625 ；WO 2009/138519 中进行的)。然而，所述细胞表达多种抗原，导致主要针对非目的抗原的抗体反应。因此，通过这种方法可获得的抗体反应特征在于低特异性，并且特别地特征在于，在所有产生的抗体中目的抗体的频率极低。因此，这种方法排除了针对目的靶抗原的抗体的有效产生。因此，本领域没有提供令人满意的产生针对构象表位、特别是膜相关抗原的适当宽度的特异性抗体反应的方法。发明概述本发明的目的是克服现有技术的这些缺点。具体地，本发明的目的是提供一种产生针对复杂的抗原如表现构象表位的细胞相关抗原的免疫球蛋白序列的方法。通过本发明克服了上述问题。已经发现基因疫苗接种可以引起针对构象表位、即针对采用其天然构象的细胞相关抗原的良好特异性和可接受宽度的抗体反应。本发明涉及下列各项。用于产生可以结合细胞相关抗原和/或具有针对细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括下述步骤a)用编码所述细胞相关抗原或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分的核酸基因疫苗接种非人动物；和b)任选地用采用其天然构象的所述抗原加强所述动物，所述采用其天然构象的抗原选自包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞、细胞来源的膜提取物、 携带富集抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒；c)筛选来源于所述非人动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。在本发明的具体的实施方案中，所述细胞相关抗原选自跨膜抗原、具有多个跨膜结构域的跨膜抗原，诸如GPCRs或离子通道。按照本发明，所述非人动物可以选自脊椎动物，鲨鱼，哺乳动物，蜥蜴，骆驼科动物，美洲轮，优选骆驼科动物和美洲驼。在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列(例如，\-序列)，或重链可变结构域序列(例如，Vh-序列)；更具体地，所述免疫球蛋白序列可以是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。按照本发明，所述免疫球蛋白序列可以是结构域抗体，或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”，或 适于用作dAbs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于Vhh序列，且优选是纳米抗体。按照本发明，疫苗接种可以通过无针喷射注射(needle-free jet injection)、通过冲击法、通过针头介导的注射如纹身(Tattoo)、通过以贴片将DNA局部施用到皮肤上、或通过任意这些施用方法而后通过体内电穿孔进行，并且另外包括通过皮内、肌内或皮下施用DNA进行的疫苗接种。所述免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以由所述非人哺乳动物的血液获得。在本发明中，所述细胞相关抗原可以在允许表达天然构象的抗原的任何细胞背景下表达。所述细胞背景的实例为0!0，0)87，!^293，或骆驼科动物来源的细胞。优选地，所述细胞相关抗原是跨膜抗原，其包括但不限于，选自CXCR7，CXCR4和P2X7的抗原。免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以在细胞或病毒的组、集合或样品中表达，并且筛选所述细胞或病毒的组、集合或样品以获得表达可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的细胞或病毒，更具体地，可以由所述细胞或病毒纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。按照本发明，免疫球蛋白序列的组、集合或文库可以由核酸序列的组、集合或文库编码，并且筛选所述核酸序列的组、集合或文库以获得编码可以结合所述细胞相关抗原和/ 或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列；更具体地，可以纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。按照本发明，可以纯化和/或分离可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的所述免疫球蛋白序列。本发明还涉及可通过本发明所述的方法可获得的免疫球蛋白，和包括所述免疫球蛋白序列的组合物，更具体地涉及针对(如本文定义)离子通道和GPCRs的免疫球蛋白序列。特别地，本发明涉及针对(如本文定义)离子通道的免疫球蛋白序列，以及包括一种或多种所述免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种所述免疫球蛋白序列组成的化合物或构建体，且具体是蛋白和多肽(本发明还分别称为“本发明的免疫球蛋白序列”，“本发明的化合物”，和“本发明的多肽”)。本发明还涉及编码所述免疫球蛋白序列和多肽的核酸 (本发明还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述免疫球蛋白序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述免疫球蛋白序列或多肽的宿主细胞；涉及包括所述免疫球蛋白序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物、且特别是药物组合物；并且涉及所述免疫球蛋白序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文提及的预防、治疗或诊断目的的应用。附图简述
图1.在用Pig-jet (图片A)或纹身法(图片B)基因疫苗接种后，在美洲驼中体液免疫反应的动力学。
图2.单次HBSAg蛋白加强对DNA疫苗接种的美洲驼的影响。图例同图1。图3.相对于蛋白免疫(美洲驼32和33)，通过“DNA”致敏-“蛋白”加强方案(美洲驼124，160，117,203)获得的体液免疫反应。图4.重链抗体(IgG2和3)介导的针对HBSAg的抗体反应。发明 详述本发明包括，但不限于，后附的权利要求书的主题。A)定义除非另外指明或定义，所用的所有术语具有本领域常用的意思，这是技术人员所清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等，“Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)〃(第 2 版)，卷 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社)(1989) ；F. Ausubel 等，编，“Current protocols in molecular biology (现代分子生物学方法)“,Green Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987) ；Lewin,"Genes II(基因 II)，，，John Wiley & Sons，纽约，N. Y.， (1985) ；Old 等.,"Principles of Gene Manipulation :An Introduction to Genetic Engineering(基因操作原理基因工程入门)，，，第2版，University of California Press (加利福尼亚大学出版社)，Berkeley, CA(1981) ；Roitt 等.，“Immunology (免疫学)，，(第 6 版)，Mosby/Elsevier, Edinburgh(2001) ；Roitt 等·，Roitt' s Essential Immunology (Roitt，s 基础免疫学)，第 10 版· Blackwell Publishing，英国(2001)；和 Janeway 等.,“Immunobiology (免疫学)，，(第 6 版)，Garland Science Publishing/ Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及其中所引用的公知背景技术；除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”-在本文中不管是用来指重链抗体还是常规4-链抗体-该术语用作概括性术语，包括完整尺寸的抗体，其单条链、以及所有的其部分、结构域或片段(分别包括但不限于，抗原_结合结构域或片段如Vhh结构域或VH/VL结构域)。术语抗原_结合分子或抗原_结合蛋白可与免疫球蛋白序列互换使用，并且包括纳米抗体。在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列(例如，\-序列)，或重链可变结构域序列(例如，Vh-序列)；更具体地，所述免疫球蛋白序列可以是来源于常规4-链抗体的轻链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。按照本发明，所述免疫球蛋白序列可以是结构域抗体，或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”，或适于用作dAbs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于Vhh序列，且优选是纳米抗体。本发明提供的免疫球蛋白序列优选地以基本上分离的形式(如本文定义)存在， 或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文定义)，其可以包括一种或多种本发明的免疫球蛋白序列或基本上由一种或多种本发明的免疫球蛋白序列组成，并且其可以任选地还包括一种或多种其它的免疫球蛋白序列(所有任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，所述本发明的一种或多种免疫球蛋白序列可以用作所述蛋白或多肽中的结合单位，其可以任选地包含一种或多种可以作为结合单位的其它免疫球蛋白序列 (即，针对除细胞相关抗原以外的一种或多种其它靶标)，从而分别提供本发明的单价、多价或多特异性多肽，所有均如本文所述。所述蛋白或多肽也可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物免疫球蛋白序列。本发明还包括完全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白序列。例如，本发明包括骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化的骆驼科动物免疫球蛋白序列，或骆驼源化的结构域抗体，例如，骆驼源化的Dab，如由Ward等(参见例如WO 94/04678以及Davies和 Riechmarm(1994和1996))所述。而且，本发明包括融合的免疫球蛋白序列，例如，形成多价和/或多特异性构建体(对于包含一个或多个Vhh结构域的多价和多特异性多肽及其制备， 还参考 Conrath 等.，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，卷 276，10. 7346-7350，2001，以及例如TO 96/34103和WO 99/23221)， 和包括标记或其它功能性结构部分(例如，毒素、标记、放射性化学品等)的免疫球蛋白序列，其可来源于本发明的免疫球蛋白序列。可以认为所述免疫球蛋白序列和免疫球蛋白序列的结构，特别是纳米抗体-然而不限于此-由四个构架区或“FR’ S”组成，其在本领域中和在本文中分别称为“构架区1”或 “FR1” ；“构架区2”或“FR2” ；“构架区3”或“FR3” ；和“构架区4”或“FR4” ；所述构架区由三个互补决定区或“⑶R，s”中断，其在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2” ；和“互补决定区3”或“CDR3”。纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。 然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别限制它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层要求，并且还优选地适于本文所述的目的。当用于本文时，术语“免疫球蛋白序列”是指编码免疫球蛋白分子的核酸序列和免疫球蛋白多肽本身这二者。任何更加限制性的意思将通过具体的上下文而清楚。所有这些分子还称为“本发明的多肽”，其与本发明的“免疫球蛋白序列”同义。另外，术语“序列”在用于本文时(例如，在术语如“免疫球蛋白序列”，“抗体序列”， “可变结构域序列”，"Vra序列”或“蛋白序列”中)通常应该理解为包括相关的免疫球蛋白序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列二者，除非上下文需要更局限性的解释。在下文中，对本发明的“核酸分子”的引用可以涉及用于基因疫苗接种的核酸，或编码本发明的免疫球蛋白序列的核酸，或二者，这将通过具体的上下文变得清楚。除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于专业技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及例如下列的综述Presta，Adv. Drug Deliv. Rev.(高级药物递送评论)2006，58 (5_6) :640_56 ； Levin 和 Weiss，Mol. Biosyst.(分子生物系统)2006，2 (1) :49_57 ；Irving 等，J. Immunol. Methods (免疫学方法杂志),2001, 248 (1-2), 31-45 ；Schmitz 等，Placenta (胎盘),2000, 21 增刊 A, S106-12, Gonzales 等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)，2005，26 (1)，31-43，它们描述了蛋白工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于改善蛋白诸如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的技术。本发明涉及可以结合本文定义的抗原和/或具有针对本文定义的抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。在本发明的情形中,“结合某种抗原和/或具有针对某种抗原的亲和件”具有本领域中常用的意思，例如，如在抗体及其各自的抗原的情形中所理解的意思。在本发明的具体实施方案中，术语“结合和/或具有针对……的亲和性”意指所述免疫球蛋白序列特异性与抗原相互作用，并且与“针对”所述抗原的免疫球蛋白序列互换使用。术语“特异性”是指特定的免疫球蛋白序列、抗原_结合分子或抗原_结合蛋白 (诸如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和力， 表示为抗原与抗原_结合蛋白的解离平衡常数(Kd)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原_结合位点之间的结合强度的量度KD值越小，抗原决定簇和抗原_结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(Ka)，其为1/KD)。专业技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和力可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽) 和相关抗原之间的结合强度的量度。抗体亲抗原性与抗原决定簇与其在抗原_结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，本发明的免疫球蛋白序列(诸如本发明的免疫球蛋白序列、纳米抗体和/ 或多肽)将以10_5-10_12摩尔/升或更小、并且优选地10_7-10_12摩尔/升或更小并且更优选地10_8-10_12摩尔/升的解离常数(Kd) ( S卩，以IO5-IO12升/摩尔或更大、并且优选地IO7-IO12 升/摩尔或更大、且更优选地IO8-IO12升/摩尔的缔合常数(Ka))而结合它们的抗原，和/ 或以IO2M-1S-1-约 107Μ 优选 103M-1S-LlO7M-1 S、更优选 ΙΟ Υ Ο'Μ 诸如 K^M—V-iolV的k。n-速率与本文定义的细胞相关抗原结合；和/或以Is—1 (t1/2 = 0. 69s) -IiTfV1 (假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选 IO-2S-LlO-6S-1,更优选IO-3S-LlO-6S-1,诸如IO-4S-LlO-6S-1的k。ff速率与本文定义的细胞相关抗原结合。任何大于10_4摩尔/升的Kd值(或任何小于IO4M4的Ka值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于IOnM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，诸如放射性免疫测定 (RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。解离常数可以是实际的或表观解离常数，这是专业技术人员应该清楚的。确定解离常数的方法对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10_4摩尔/升或10_3摩尔/升(例如，IO-2摩尔/升) 的解离常数。任选地，专业技术人员还应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(Ka)利用[KD = 1/KJ的关系计算所述(实际或表观)解离常数。亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为Kd或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有 (摩尔/升广乂或M—1)的单位。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的免疫球蛋白序列、 免疫球蛋白序列、纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的Kd值表示；专业技术人员应该清楚，考虑到Ka = 1/KD的关系，通过其Kd值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的Ka值。由于Kd-值通过公知的关系式DG = RT. In (Kd)(等价于DG =-RT. In (Ka))与结合的自由能(DG)相关，Kd-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且In表示自然对数。关 于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用(诸如本发明的免疫球蛋白序列与本文定义的细胞相关抗原的结合)的Kd典型地在InM)-IO-5M(IOOOOnM) 范围内。相互作用越强，其Kd越低。Kd也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为k。ff)与其缔合速率(表示为k。n) 的比例(以致Kd = k。ff/k。n和Ka = k。n/k。ff)。解离速率k。ff具有单位s—1 (其中s是秒的SI 单位符号)。缔合速率、具有单位Μ—、—1。关于本发明的免疫球蛋白序列，缔合速率可以在IO2M4iT1-约IOl1iT1之间变化， 对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2 = In(2)/ k。ff与给定的分子相互作用的半衰期相关。本发明的免疫球蛋白序列的解离速率可以在 IO-6S-1 (接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到Is—1 (t1/2 = 0. 69s)之间变化。两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学 (Intern. Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上， 另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生k。n，k。ff测量值以及因此产生Kd(或Ka) 值。例如，这可以使用公知的Biacore仪器进行。专业技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的固有结合亲和力，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的Kd可以与表观Kd相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。可以用来评估亲和力的另一种方法是Friguet等(免疫方法杂志(J. Immunol. Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA (酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。然而，Kd的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观Kd值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观Kd测量可以用作真实Kd的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性对待Kd和表观KD。最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团或生色团或其它化学结构部分标记的参照分子C，诸如在 ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。 典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果， 获得IC5tl值，其对应于在不存在A的条件下关于C所测量的信号为一半时的A的浓度。假定已知参照分子的KD，即Kd ref,以及参照分子的总浓度cMf，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观 Kd =Kd = IC50/ (1+cref/Kd ref)。注意，如果 cref < < Kd ref,则 Kd IC500 假定以一致的方式(例如，保持cMf不变)针对比较的结合剂进行IC5tl测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC5tl进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于Kd 或等价于表观KD。在 本发明的上下文中，“构象依赖型表位”,或“构象表位”表示包括不在抗原一级序列的单一连续区段中的氨基酸的表位。换言之，由于蛋白靶标的二级和/或三级结构，在一级结构中可能被间隔开的氨基酸彼此接近，由此参与形成表位。例如，如果抗原包括三个氨基酸环，则在这些环中每一个环上的残基可以参与形成单个的表位。这适用于包括多于一个结构域或亚单位的抗原。在这种情形中，表位可以由不同结构域或亚单位上的氨基酸形成。通过适当的条件完全或部分变性蛋白，即，部分或完全破坏二级和/或三级结构，也将部分或完全破坏构象表位。专业技术人员将理解通过使蛋白变性而破坏构象表位的精确条件取决于所述蛋白的性质和具体的情形。在优选实施方案中，本发明涉及针对构象表位的免疫球蛋白序列。具体地，本发明涉及针对本文定义的细胞相关抗原上的构象表位的免疫球蛋白序列，其可以优选的是骆驼科动物免疫球蛋白序列，包括纳米抗体。在本发明的上下文中，“细胞相关抗原”意指稳固地锚定在或者位于细胞膜(包括亚细胞区室和细胞器的膜)中的抗原，并且包括具有单个或多个跨膜区的抗原。换言之，该术语是指展现出膜_依赖性构象表位的抗原。具体地，该术语是指具有本文定义的构象表位的抗原。该术语包括跨膜抗原，具有多个跨膜结构域的跨膜抗原如GPCRs或离子通道。在所有这些抗原中，专业技术人员知晓多种可药用的靶抗原，其代表本发明的优选的细胞相关抗原。本发明特别涉及这样的细胞相关抗原，其中构象依赖型表位依赖于在膜中的正确锚定和/或位置。因此，本发明提供针对所述构象依赖型表位的免疫球蛋白序列。在优选的实施方案中，本发明涉及作为具有一个或多个、优选多个跨膜结构域的完整的膜蛋白的抗原。这些抗原位于细胞质膜、和/或亚细胞区室和细胞器的膜中并且在其中运作。多种跨膜蛋白，如跨膜受体，包括两个或多个亚单位或结构域，其彼此在功能上相互作用。完整的膜蛋白包括三个不同的部分或结构域，S卩，细胞外(区室外)结构域，跨膜结构域和细胞内(或区室内)结构域。具有多个跨膜结构域的蛋白典型地还将具有多个细胞外/区室外和细胞内/区室内结构域。例如，七跨膜受体包括7个跨膜结构域。因此，术语细胞相关抗原在本文中理解为意欲排除仅是松散缔合的抗原，S卩，排除不是稳固地锚定或位于膜内的抗原。如果抗原包括至少一个延伸到膜内的结构域或部分， 则抗原是稳固锚定的。在一个实施方案中，本发明排除通过脂质尾部插入膜而不具有跨膜结构域的抗原。在这种情形中，蛋白的亲水部分或结构域的构象不取决于膜环境。例如，可以表达缺少脂质尾部、以正确的构象存在的重组蛋白，即，表达在抗原通过脂质尾部与膜缔合时也存在的构象表位。类似地，在具体实施方案中，本发明排除仅是松散地缔合的任何其它的蛋白。 在这种情形中，“松散地缔合”意指甚至在不存在膜的条件下表现出其天然构象的蛋白，即， 其天然构象不依赖于锚定或包埋在膜中。在更具体的实施方案中，本发明排除ART2. 2。本发明所述的细胞相关抗原的典型实例包括七膜结构域受体，其包括G蛋白偶联的受体，如本发明进一步所述的那些，肾上腺素能受体，嗅觉受体，受体酪氨酸激酶，如表皮生长因子受体，胰岛素受体，成纤维细胞生长因子受体，高亲和性神经营养蛋白受体，和Eph 受体，整联蛋白，低亲和性神经生长因子受体，NMDA受体，一些免疫受体，包括Toll-样受体，T细胞受体和CD28。此外，本发明所述的细胞相关抗原还包括离子通道，如本发明进一步所述的那些，钙通道，钠通道，钾通道，2P离子通道，6-TM离子通道，电压-门控离子通道和/或钙-激活的钾通道。当 用于本文时，术语“细胞相关抗原”意欲包括，并且还指，所述细胞相关抗原的任意部分、片段、亚单位、或结构域。所述细胞相关抗原的任何亚部分都落入本发明的范围之内，条件是其表现出目的构象表位。例如，如果目的表位位于受体的结合位点中，或者位于离子通道的孔中，则所述细胞相关抗原的能够形成所述表位的任何片段都包括在本发明中。优选地，这些部分、结构域、片段或亚单位是所述细胞相关抗原负责膜依赖性构象的那些部分。例如，如果蛋白包括多个通过延长的细胞内环连接的跨膜结构域，则认为所述环被部分或完全省略，而不影响细胞外构象表位。特别地，本发明涉及针对以其天然构象存在的细胞相关抗原的免疫球蛋白序列。 在本发明的上下文中，“天然构象”意指蛋白表现出其二级和/或三级结构，特别是其膜依赖性二级和/或三级结构。换言之，天然构象描述以非变性形式存在的蛋白，并且描述其中存在构象表位，特别是存在膜依赖型构象表位的构象。具体地，蛋白具有当所述蛋白整合到膜内或稳固地附着到膜上时存在的构象。当存在于下列之中时，可以获得以其天然构象存在的抗原在包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞中、细胞来源的膜提取物、携带抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体、或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒中。在任意这些实施方案中，抗原可以通过适当的方式富集。所述细胞相关抗原可以在允许表达以其天然或自然构象存在的抗原的任何适宜的细胞上表达，所述细胞包括但不限于，Cho, Cos7，Hek293，或骆驼科动物来源的细胞。本发明的细胞相关抗原优选是可药用的膜蛋白，特别是具有多个跨膜结构域的可药用的膜蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述靶标是GPCR或离子通道。具体地，下文提供了代表本发明所述的细胞相关抗原的离子通道的非限制性实例。还列出了特异性识别所述离子通道的免疫球蛋白序列的治疗作用。
权利要求
1.用于产生可以结合细胞相关抗原和/或具有针对细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的方法，所述方法包括下述步骤a)用编码所述细胞相关抗原或所述细胞相关抗原的结构域或特定部分的核酸基因疫苗接种非人动物；和b)任选地用采用其天然构象的所述抗原加强所述动物，所述采用其天然构象的抗原选自包括表达所述细胞相关抗原的天然的或转染的细胞的细胞、细胞来源的膜提取物、携带富集抗原的小泡或任何其它膜衍生物、脂质体或表达所述细胞相关抗原的病毒颗粒；c)筛选来源于所述非人动物的免疫球蛋白序列的组、集合或文库，以获得可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞相关抗原选自跨膜抗原，包括具有多个跨膜结构域的跨膜抗原，其包括但不限于GPCRs或离子通道。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述非人动物选自脊椎动物，诸如鲨鱼，蜥蜴， 和哺乳动物，更特别地是骆驼科动物，诸如美洲驼(llama)和羊驼(alpaca)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述非人动物是骆驼科动物或美洲驼。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是轻链可变结构域序列，或重链可变结构域序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是来源于常规4-链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是结构域抗体， 或适于用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或适于用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”，或适于用作dAbs的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，包括但不限于 Vhh序列或适于用作纳米抗体的免疫球蛋白序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列是纳米抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中疫苗接种通过无针喷射注射、通过冲击法、通过针头介导的注射如纹身、通过局部施用或通过任意DNA施用方法而后通过体内电穿孔进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中疫苗接种通过皮内、肌内或皮下施用 DNA进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中免疫球蛋白序列的组、集合或文库获自血液、淋巴结、脾、骨髓或携带编码所述非人哺乳动物的这些免疫球蛋白序列的细胞的任何组织。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞相关抗原在允许表达天然构象的靶标的任何细胞上表达，所述细胞诸如但不限于选自下列的细胞Cho，Cos7, Hek293，或骆驼科动物来源的细胞，诸如美洲驼来源的细胞或羊驼来源的细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞相关抗原是跨膜抗原，诸如例如GPCR和/或离子通道。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述抗原选自CXCR7，CXCR4或/和 P2X7。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白序列的组、集合或文库在细胞或病毒的组、集合或样品上表达，并且筛选所述细胞的组、集合或样品，以获得表达可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中从所述细胞或病毒纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中免疫球蛋白序列的组、集合或文库由核酸序列的组、集合或文库编码，并且筛选所述核酸序列的组、集合或文库，以获得编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中纯化和/或分离编码可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列的核酸序列，然后表达所述免疫球蛋白序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中纯化和/或分离可以结合所述细胞相关抗原和/或具有针对所述细胞相关抗原的亲和性的免疫球蛋白序列。
20.通过权利要求1-19中任一项的方法可获得的免疫球蛋白。
21.通过权利要求1-19中任一项的方法可获得的针对离子通道的免疫球蛋白。
22.通过权利要求1-19中任一项的方法获得的针对P2X7的免疫球蛋白。
23.包括根据权利要求20、21或22所述的免疫球蛋白序列的组合物。
全文摘要
本发明涉及用于产生针对细胞相关抗原、更具体地是膜锚定的抗原的免疫球蛋白序列的方法。本发明还提供可通过本发明的方法获得的免疫球蛋白序列。具体地，本发明涉及利用DNA接种产生免疫球蛋白序列。更具体地，本发明涉及通过DNA接种在骆驼科动物中产生免疫球蛋白序列，所述免疫球蛋白序列优选地针对细胞相关抗原，特别是具有多个跨膜结构域的抗原，包括GPCRs和离子通道。此外，本发明涉及针对细胞相关抗原的所述免疫球蛋白序列，更具体地，针对膜锚定的抗原的所述免疫球蛋白序列，所述抗原诸如例如是GPCRs和离子通道，更优选地是离子通道。
文档编号C07K16/00GK102257003SQ200980151192
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月21日 优先权日2008年12月19日
发明者卡特林恩·斯托特勒斯, 图恩·莱瑞曼斯, 弗里德里希·诺尔特, 玛里亚·冈萨雷斯, 若阿纳·阿松桑, 菲利普·范龙帕伊 申请人:埃博灵克斯股份有限公司