治疗方法

专利名称：治疗方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地，本发明涉及治疗病理的病症如癌症的组合疗法。背景癌症是对人类健康而言最致命的威胁之一。仅在美国，癌症的每年新发患者为近 1300000，并且是仅次于心血管病的第二号致死原因，在所有死亡中约占1/4。实体瘤导致那些死亡的大部分。尽管在某些癌症的医学治疗中有明显的进展，所有癌症的总体5年生存率在过去的20年中仅仅提高了约10%。癌症，或恶性肿瘤，以不受控制的方式转移并快速生长，导致及时检出和治疗非常困难。HGF是间质衍生的多效性因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、促运动和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导的，而且在多种肿瘤中经常观察到异常的HGF和c-met表达。参见例如Maulik等，Cytokine & Growth Factor Reviews (细胞因子和生长因子综述)(2002)，13 :41-59 ；DaniIkovitch-Miagkova 和 Zbar， J. Clin. Invest.(临床研究杂志)(2002),109(7) :863_867。在肿瘤进展和转移中牵涉HGF/ c-Met信号传导途径的调控。参见例如Trusgolino和Comoglio，Nature Rev.(自然综述) (2002) ,2 :289-300)。HGF结合Met受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域并调控多种多样的生物学过程，诸如细胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育而言是至关重要的，尤其是在肌肉祖细胞迁移及肝和神经系统发育中(Bladt等，Nature (自然)(1995)，376，768-771.； Hamanoue 等，Faseb J (2000), 14,399-406 ；Maina 等，Cell(细胞)(1996)，87，531-542 ； Schmidt 等，Nature (自然)(1995)，373，699-702 ；Uehara 等，Nature (自然)(1995)，373， 702-705)。敲除Met和HGF的小鼠的发育表型非常相似，这说明HGF是Met受体的关联配体(Schmidt等，1995，同上Uehara等，1995，同上)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino 等，J Cell Biol (1992)，119，6四_641 ;Matsumoto 和 Nakamura, Exs (1993)，65，225-249 ；Nusrat 等，J Clin Invest (临床研究杂志)(1994)93， 2056-206 。Met受体前体经蛋白酶剪切切割成由二硫键连接的胞外α亚基和跨膜β 亚基(Tempest等，Br J Cancer (英国癌症杂志)(1988)，58，3-7)。β亚基包含胞质激酶结构域，而且在C末端包含多底物停靠位点，在此处衔接物(adapter)蛋白结合并起动信号传导(Bardelli 等，Oncogene (癌基因)(1997)，15，3103-3111 ；Nguyen 等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1997)，272，20811-20819 ；Pelicci 等，Oncogene (癌基因)(1995)， 10,1631-1638 ；Ponzetto 等，Cell (细胞)(1994)，77，261-271 ；Weidner 等，Nature (自然)(1996)，384，173-176)。HGF结合后，Met激活，分别经由Gabl和Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK激活而导致了酪氨酸磷酸化和下游信号传导，它驱动细胞运动和增殖(Furge 等，Oncogene (癌基因 M2000)，19,5582-5589 ;Hartmann 等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1994)，269，21936-21939 ;Ponzetto 等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1996)，271， 14119-14123 ；Royal 和 Park，J Biol Chem (生物化学杂志)(1995)，270，27780-27787)。据显示，Met可在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper等，Nature (自然) (1984)，311,29-33 ；Park 等，Cell (细胞)(1986)，45，895-904)。已在多种人癌症中观察到了 Met的过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠癌中过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增(Di Renzo等，Clin Cancer Res (临床癌症研究)(1995)，1，147-154 ； Liu等，Oncogene (癌基因)(1992)，7，181-185)。据报道，Met蛋白还在口腔鳞状细胞癌、 肝细胞癌、肾细胞癌、乳腺癌和肺癌中过表达(Jin等，Cancer (癌症)(1997)，79，749-760 ； Morello 等，J Cell Physiol (细胞生理学杂志 M2001)，189，285-290 ;Natali 等，Int J CanceH 国际癌症杂志)(1996)，69，212-217 ;01ivero 等，Br J Cancer (英国癌症杂志) (1996)，74，1862-1868 ；Suzuki 等，Br J Cancer (英国癌症杂志)(1996)，74，1862-1868)。 此外，在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA的过表(Boix等，!fepat0l0gy(肝脏病学)(1994)，19，88-91 ；Kuniyasu 等，Int J Cancer (国际癌症杂志)(1993)，55，72-75 ；Liu 等，Oncogene (癌基因)(1"2)，7,181-185)。在肾乳头状癌中发现了 Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成性受体激活(Olivero 等，Int J Cancer (国际癌症杂志)(1999)，82，640-643 ；Schmidt 等， Nat Genet (自然遗传)(1997)，16，68-73 ；Schmidt 等，Oncogene (癌基因)(1999)，18， 2343-2350)。这些激活突变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形成和肿瘤发生(Jeffers等，Natl Acad Sci U S A(美国科学院院刊)(1997)，94， 11445-11450)。此外，这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano等，Faseb J(2000), 14, 399-406 ；Lorenzato 等，Cancer Res (癌症研究)Q002)，62，7025-7030)。转化细胞中的 HGF 依赖性Met激活介导运动、分散和迁移的增加，最终导致侵入性肿瘤生长和转移(Jeffers 等，Mol Cell Biol (分子细胞生物学)(1996)，16，1115-1125 ；Meiners 等，Oncogene (癌基因)(1998)，16,9-20)。Met已显示出与驱动受体激活、转化和侵入的其它蛋白质相互作用。在肿瘤细胞中，据报道，Met与α6β4整联蛋白(诸如层粘连蛋白的胞外基质(ECM)组分的受体)相互作用，以促进HGF依赖性的侵入生长(Trusolino等，Cell (细胞)(2001)，107，643-654)。 此外，Met胞外域已显示出与脑信号蛋白(semaphorin)家族的成员丛蛋白Bl相互作用，以增强侵入生长(Giordano等，Nat Cell Biol (自然细胞生物学)(2002)，4，720-724)。而且，已知牵涉肿瘤发生和转移的⑶44v6据报道也与Met和HGF形成复合物并导致Met受体激活(Orian-Rousseau 等，Genes Dev (基因和发育)Q002)，16，3074-3086)。Met是受体酪氨酸激酶(RTK)亚家族的成员，该家族包括Ron和ka(Maulik等， Cytokine Growth Factor Rev (细胞因子生长因子综述)(2002)，13，41-59)。Met 胞外域的结构预测表明它与脑信号蛋白和丛蛋白同源。Met的N末端包含约500个氨基酸的义脆结构域，其在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白属于一个分泌的和膜结合的蛋白质大家族，首先因其在神经发育中的作用而被记载(Van Vactor和Lorenz，Curr Bio (现代生物学)(1999)，19，R201-204)。不过，近来将脑信号蛋白的过表达与肿瘤的侵入和转移联系起来了。在丛蛋白、脑信号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI 结构域(也称为Met相关序列结构域)邻近kma结构域，随后是4个IPT重复片段，其是在丛蛋白和转录因子中发现的免疫球蛋白样区域。近来的研究表明Met kma结构域足以使HGF和肝素结合(Gherardi等，Proc Natl Acad Sci U S A (美国科学院院刊)(2003)， 100(21) :12039-44)。如上所述，Met受体酪氨酸激酶由其关联配体HGF激活，而且受体磷酸化激活下游 MAPK、PI-3 激酶和 PLC-γ 途径(L. Trusolino 和 P. M. Comoglio，Nat Rev Cancer (自然综述癌症)2，289Q002) ；C. Birchmeier 等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然综述分子细胞生物学)4,915 000 )。激酶结构域内的Y1234/Y1235磷酸化对于Met激酶激活来说是关键的，而多底物停靠位点中的Y1349和Y1356对于结合src同源体-2 (SH2)、磷酸酪氨酸结合(PTB) JPMet结合结构域(MBD)蛋白来说是重要的(C. Ponzetto等，Cell (细胞)77， 261(1994) ；K. M. Weidner 等，Nature (自然)384，173 (1996) ；G. Pelicci 等，Oncogene (癌基因)10，1631 (1995))，用以介导下游信号传导途径的激活。另一个近膜磷酸化位点Y1003 已经很好地表征了其与Cbl E3连接酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(P. Peschard 等，Mol Cell (分子细胞)8，995(2001) ；P. Peschard, N. Ishiyama, T.Lin，S. Lipkowitz, Μ. Park, J Biol Chem (生物化学杂志)279，四565 (2004))。据报道，Cbl的结合驱动吞蛋白(endophilin)介导的受体内吞、泛素化及随后的受体降解(A. Petrelli等，Nature (自然)416,187 0002))。该受体下调的机制以前在也具有相似Cbl结合位点的EGFR家族中有记载(K. Shtiegman，Y. Yarden，Semin Cancer Biol (癌症生物学讲座)13，四 Q003)； M. D. Marmot, Y. Yarden, Oncogene (癌基因)23，2057 (2004) ；P. Peschard, M. Park, Cancer Cell (癌细胞)3，519 000；3))。多种肿瘤中据报道有Met和HGF失调。在数种癌中观察到配体驱动的Met激活。在肺、乳腺癌、和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤内HGF(J. M. Siegfried 等，Ann Thorac Surg 66,1915(1998) ；P. C. Ma 等，Anticancer Res (抗癌研究)23,49(2003) ；B. E.Elliott 等 Can J Physiol Pharmacol 80,91(2002) ；C. Seidel, 等，Med Oncol 15,145(1998))。在多种癌中，诸如在结肠直肠、肺、胃、和肾癌中，据报道有Met和/或HGF的过表达、Met扩增或突变，而且认为这驱动配体依赖性受体激活 (C. Birchmeier 等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然综述分子细胞生物学)4，915 (2003)； G. Maulik 等，Cytokine Growth Factor Rev (细胞因子生长因子综述)13，41 Q002))。另外，肝小鼠模型中诱导性Met过表达引起了肝细胞癌，这证明了受体过表达驱动配体非依赖性肿瘤发生(R. Wang，等，J Cell Biol 153，1023 (2001))。Met参与癌的最引人注目的证据据报道是在家族性和散发性肾乳头状癌(RPC)患者中，Met激酶结构域中造成受体组成性激活的突变在RPC中被鉴定为种系和体细胞突变(LJchmidt等，Nat Genet (自然遗传)16,68(1997))。将这些突变导入转基因小鼠模型造成肿瘤发生和转移(M. Jeffers等， Proc Natl Acad Sci U S A (美国科学院院刊)94，11445 (1997))。表皮生长因子受体(EGFR)家族包括参与细胞应答如分化和增殖的四种密切相关的受体(HER1/EGFR，HER2，HER3和HER4)。过表达EGFR激酶或其配体TGF-α常常与许多癌症相关，包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤和星形细胞瘤，并且认为促进这些肿瘤的恶性生长。也已经发现EGFR基因(EGFRvIII)中的特异性缺失突变增加细胞致肿瘤性。激活EGFR刺激的信号传导途径促进多个可能促癌的过程，例如增殖、血管发生、细胞运动性和侵袭、降低细胞凋亡和诱导药物抗性。增加的 HER1/EGFR表达经常与重病、转移和差的预后相关联。例如，在NSCLC和胃癌中，已经显示增加的HER1/EGFR表达与高转移率、差的肿瘤分化和增加的肿瘤增殖相关。在NSCLC和成胶质细胞瘤中已经观察到激活受体的内在性蛋白酪氨酸激酶活性和/或增加下游信号传导的突变。然而，突变作为赋予对EGF受体抑制剂(例如厄洛替尼 (erlotinib) (TARCEVA )或吉非替尼(gefitinib))的敏感性的主要机制的作用存在争议。已经报道全长EGF受体的突变形式预测了对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的反应性(Paez，J.G.等(2004) Science (科学)304 1497-1500 ;Lynch，T. J.等(2004) N. Engl. J. Med.(新英格兰医学杂志)350 =2129-2139)。细胞培养研究已经显示表达EGF受体的此类突变形式的细胞系(即H325Q对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的生长抑制更敏感，需要高得多的浓度的吉非替尼来抑制表达野生型EGF受体的肿瘤细胞系。这些观察表明特定突变形式的EGF受体可能反应对EGF受体抑制剂的更大的敏感性，但没有鉴定完全无反应的表型。直接抑制EGFR的激酶活性的化合物以及通过阻断EGFR激活降低EGFR激酶活性的抗体开发用作抗肿瘤试剂是强烈努力研究的领域(de Bono J. S.和Rowinsky， Ε. K. (2002) Trends in Mol. Medicine (分子医学发展趋势)8 :S19_S26 ；Dancey，J.和 Sausville, Ε. Α. (2003)Nature Rev. Drug Discovery (自然综述.药物发现)2 :92-313)。 数个研究已经证明、公开或表明一些EGFR激酶抑制剂当与某些其它抗癌或化疗试剂或治疗组合使用时可能改善对肿瘤细胞或瘤形成的杀伤(例如Herbst，R.S.等Q001) Expert Opin. Biol. Ther.(生物学理论专家观点)1 :719-732 ；Solomon，B.等(2003) Iht.J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55 :713-723 ；Krishnan, S.等(2003)Frontiers in Bioscience (生命科学前沿)8，el-13 ；Grunwald, V.和 Hidalgo，Μ. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95 :851-867 ；Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs ( ^fF ^Sfi 点)4(6) :658-666 ；Khali 1,Μ. Y.等(2003)Expert Rev. Anticancer Ther.(抗癌理论专家综述)3 :367-380 ；Bulgaru,A. Μ.等(2003)Expert Rev. Anticancer Ther.(抗癌理论专家综述)3 :269-279 ；Dancey, J.禾口 Sausville, Ε. Α. (2003)Nature Rev. Drug Discovery (自然综述.药物发现)2 :92-313 ;Ciardiello，F.等(2000) Cl in. Cancer Res.(临床癌症研究)6 :2053-2063 ；和专利公开 No :US 2003/0157104)。厄洛替尼(例如盐酸厄洛替尼，也称为TARCEVA 或0SI-774)是可口服的EGFR 激酶抑制剂。在体外，厄洛替尼已经证明在很多人肿瘤细胞系(包括结肠直肠癌和乳腺癌) 中对EGFR激酶有重要抑制活性(Moyer J. D.等(1997)Cancer Res(癌症研究).57 :4838)， 并且临床前评价已经证明有抵抗很多表达EGFR的人肿瘤异种移植物的活性(Pollack， V. Α.等(1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291 :739)。厄洛替尼在很多适应症的临床试验中已经证明有活性，包括头和颈癌(Soulieres，D.，等Q004) J. Clin. Oncol.(临床肿瘤学)22 77), NSCLC(Perez-Soler R,等(2001)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20 :310a,文摘 1235)， CRC (0za,M.，等 Q003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22 :196a，文摘 785)和 MBC (Winer，Ε·，等 (2002) Breast Cancer Res. Treat.(乳腺癌研究治疗)76 :5115a，文摘 445 Jones, R. J.， 等 Q003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22 :45a，文摘 180)。在 III 期试验中，在患有晚期、治疗-顽抗的NSCLC患者中，厄洛替尼单一疗法显著延长存活、延迟疾病进展并且延迟肺癌相关症状的恶化(Sh印herd，F.等(2004) J.Clin· Oncology (临床肿瘤学)，22 :14S (7 月15日增刊)，文摘7022)。在2004年11月美国食品药品管理局(U. S. Food and Drug Administration(FDA))批准TARCEVA 用于在至少一次在先化学治疗方案失败后治疗患有局部进展的或转移的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。尽管在癌症治疗中有重大进展，仍然在寻求改进的疗法。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公开，其全文通过引用并入本文。发明概述本发明提供用于治疗病理的病症如癌症的疗法，其中抗c-met抗体提供显著的抗肿瘤活性。本发明还提供用于治疗病理的病症如癌症的组合疗法，其中抗c-met抗体与 EGFR拮抗剂组合，由此提供显著的抗肿瘤活性。一方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者以每三周大约 15mg/kg的剂量施用抗c-met抗体。另一方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗c-met抗体；和(b) EGFR拮抗剂。一方面，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间 (time to disease progression, TTP)或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗c-met抗体；和(b) EGFR拮抗剂。在一些实施方案中，抗-c-met抗体以足以获得15微克/ml或高于15微克/ml的血清谷浓度(serum trough concentration)的量施用。在一些实施方案中，抗-c-met抗体以总剂量大约15mg/kg在三周的期间中施用。在一个实施方案中，EGFR拮抗剂是厄洛替尼。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以150mg的剂量施用。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以IOOmg的剂量施用。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以50mg的剂量施用。在一个实施方案中，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间(TTP)、无进展存活、或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约 15mg/kg的剂量的抗-c-met抗体(如MetMAb)；和(b)在三周的周期中每天150mg剂量的厄洛替尼(N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二 O-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺)。本申请第一次公开了在人中施用包含Fc区的单价单臂抗体，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。参见，例如W02005/063816。 在一些情况下全长抗体在结合目标抗原时显示出激动效应(其可能是不想要的)，即使作为Fab片段其是拮抗性抗体。参见，例如美国专利No. 6，468，5四。当拮抗性效应是想要的治疗功能时这种现象是不利的。单臂抗体的单价特性(即抗体包含单抗原结合臂)在该抗体结合目标分子时产生和/或保证拮抗功能，适合用于治疗需要拮抗功能且抗体的双价产生不利激动效应的病理的病症。另外，本文描述的包含Fc区的单臂抗体的特征在于，与具有相似/基本相同抗原结合特性的Fab形式相比具有优异的药物代谢动力学属性(如体内增强的半衰期和/或降低的清除率)，因此克服了使用常规单价Fab抗体中的主要缺点。因此，在一些实施方案中，抗-c-met抗体是包含Fc区的单臂抗体(即重链可变结
11构域和轻链可变结构域形成单抗原结合臂)，其中该Fc区包含第一和第二 Fc多肽，其中第一和第二 Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。在一些实施方案中，该抗-c-met抗体包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重链可变结构域EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 10)，CHl 序列，和第一 Fc多肽；(b)第二多肽，其包含具有下述序列的轻链可变结构域DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :11)，和 CLl序列；和(c) 第三多肽，其包含第二 Fc多肽，其中重链可变结构域和轻链可变结构域以复合物存在并形成单抗原结合臂，其中第一和第二 Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。在一些实施方案中， 第一多肽包含

图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO 12)并且第二多肽包含图2中所述的Fc 序列(SEQ ID N0:13)。在一些实施方案中，第一多肽包含图2中所述的Fc序列(SEQ ID NO 13)并且第二多肽包含图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO 12)。在一些实施方案中，该抗-c-met抗体包含(a)包含重链可变结构域的第一多肽， 所述多肽包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 14) ； (b)包含轻链可变结构域的第二多肽，该多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SE Q ID NO 15)；和包含Fc序列的第三多肽，该多肽包含序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK( SEQ ID NO :13)，其中重链可变结构域和轻链可变结构域以复合物存在并形成单抗原结合臂，其中第一和第二 Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。在一个实施方案中，该抗-c-met抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含图1中所描述的CDR1-HC，CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO :4，5，和/或9)中的一条或多条。在一些实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含图1 中所描述的CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQID而1，2，和/或3)中的一条或多条。在一些实施方案中，该重链可变结构域包含图1中所描述的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和 FR4-HC序列(SEQ ID NO 21-24) 0在一些实施方案中，该轻链可变结构域包含图1中所描述的 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 和 FR4-LC 序列(SEQ ID NO :16-19)。适用于本发明的方法的其它抗-c-met抗体在本文中描述并且是本领域中已知的。一方面，抗-c-met抗体包括至少一个特性，其促进抗体片段内的Fc序列的异二聚化而使同二聚化最小。这样的一种或多种特性改善了免疫球蛋白群体的产量和/或纯度和 /或同质性。在一个实施方案中，该抗体包含Fc突变，其构成“凸起(“knobs")”和“孔洞”(〃 holes")，如W02005/063816中描述。例如孔洞突变可以是Fc多肽中T366A，L368A 和/或料07￥中的一种或多种，并且空腔(cavity)突变可以是T366W。本发明的方法可用于影响任何适当的病理状态。例如，本发明的方法可用于治疗不同癌症，实体瘤和软组织肿瘤等均可。本发明的治疗可改善的癌症的非限制性实例包括乳腺癌(breast cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、 # 小细 Ifi月市· (non-small cell lung cancer) > # - M ^ ik E ^ (non-Hodgkins Iymphoma(NHL))、肾细胞癌(renal cell cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌 (liver cancer)、姨腺癌(pancreatic cancer)、软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)、卡波济肉瘤(kaposi' s sarcoma)、类癌瘤的癌瘤(carcinoid carcinoma)、头禾口颈癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胃癌(gastric cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、和多发性骨髓瘤(multiple myeloma) 0在某些方面，癌症是转移的。 在其它方面，癌症是非转移的。在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌 (bladder cancer)、食管癌(esophageal cancer)、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌 (thyroid cancer)、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌、或成胶质细胞瘤(glioblastoma) ο在一些实施方案中，受试者的癌表达c-met。在一些实施方案中，受试者的癌表达 EGFR0在一些实施方案中，受试者的癌显示c-met和/或EGFR表达、扩增、或激活。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高水平的IL8(显示高水平的IL8表达，如IL8蛋白表达)。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约150pg/ml的 IL8，或在一些实施方案中，高于大约50pg/ml的IL8。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约10pg/ml，20pg/ml，30pg/ml或更高的IL8。测量IL8血清浓度的方法是本领域已知的并且一种方法在本实施例中描述。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高水平的HGF(显示高水平的HGF 表达，如HGF蛋白表达)。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约5，000, 10，000，或 50，000pg/ml 的 HGF。抗-c-met抗体可连续施用或与EGFR拮抗剂组合在相同组合物中或作为单独的组合物施用。抗-c-met抗体和EGFR拮抗剂的施用可同时进行，例如作为单一组合物或作为两种或多种不同组合物，使用相同或不同的施用途径。备选地或另外地，可以任何顺序连续进行施用。备选地或另外地，该步骤可作为以任何顺序的连续和同时的组合实施。在某些实施方案中，两种或多种组合物的施用之间可存在的间隔范围在数分钟至数天-数周至数月。例如，可以首先施用EGFR拮抗剂，随后是抗-c-met抗体。然而，也涵盖了同时施用或首先施用抗-c-met抗体。取决于待治疗的具体癌症适应症，本发明的组合治疗可与另外的治疗剂进行组合，如化疗剂、VEGF拮抗剂，或与另外的疗法如放射性疗法或手术进行组合。许多已知的化疗剂可在本发明的组合治疗中使用。优选地将使用治疗具体适应症的标准的那些化疗剂。 在组合中将使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与当该相应药剂不与其它一种或多种药剂一起使用时的剂量或频率相同或更低。本发明也提供预后的方法。因此，公开的方法可提供用于方便、有效并可能经济的方式获得对评估病症将来的进程(包括对正在治疗的患者选择适当的疗法)有用的数据和 fn息ο另一方面，本发明提供评价患有或怀疑患有癌症的患者的方法，该方法包括基于来自于该患者生物学样品中的IL8的表达与对照样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后；其中患者生物学样品中相对于对照样品中的IL8的表达对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，该方法还包括(a)从患者获得生物学样品(例如在治疗前和/或治疗过程中)；和(b)检测在该生物学样品(一个或多个)中的IL8的表达。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。另一方面，本发明提供用于评价正在进行癌症治疗的患者的方法，该方法包括基于来自于该患者的生物学样品(例如血清)中的IL8的表达与在治疗前采集的该患者生物学样品中IL8的表达的比较预测该患者的癌症预后，其中正在进行治疗的患者血清中IL8 的表达相对于治疗前样品中表达而言降低对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，癌症的预后包括对下述任何一个或多个提供预言或预测(预后)对治疗(例如，用c-met拮抗剂(如抗c-met抗体)或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的反应，c-met拮抗剂(如抗-c-met抗体)或c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的活性，对治疗(例如，用c-met拮抗剂或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的反应，治疗(例如，用 c-met拮抗剂或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的活性，易患癌症或诊断为癌症的患者的存活时间，无复发存活时间，易患癌症或诊断为癌症的患者的无进展存活时间，易患癌症或诊断为癌症的一组患者的反应率，易患癌症或诊断为癌症的一组患者的反应时间，和/或易患癌症或诊断为癌症的患者中转移的可能性。在一些实施方案中，存活时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，存活时间预言或预测为降低。在一些实施方案中，无复发存活时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，无复发存活时间预言或预测为减少。在一些实施方案中，反应率预言或预测为增加。在一些实施方案中，反应率预言或预测为减少。在一些实施方案中，反应时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，反应时间预言或预测为降低。在一些实施方案中，转移可能性预言或预测为增加。在一些实施方案中，转移可能性预言或预测为降低。另一方面，本发明提供选择对于患有或怀疑患有癌症的患者的治疗的方法，该方法包括(a)基于来自于该患者生物学样品中的IL8的表达与对照样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后，其中患者生物学样品中相对于对照样品中的IL8的表达对该患
14者的癌症是预后性的，和(b)步骤(a)之后，选择对于该患者的癌症治疗，其中该治疗的选择基于在步骤(a)中确定的患者的预后。在一些实施方案中，该方法还包括(C)获得患者的生物学样品；(d)检测在该生物学样品中的IL8的表达，其中在该患者生物学样品中IL8 的表达对癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8 表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。另一方面，本发明提供选择对于正在进行癌症治疗的患者的治疗的方法，该方法包括(a)基于来自于该患者生物学样品(例如血清)中的IL8的表达与治疗前采集的该患者生物学样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后，其中正在进行治疗的患者血清中IL8的表达相对于治疗前样品中表达而言对该患者的癌症是预后性的，和(b)步骤(a) 之后，选择对于该患者的癌症治疗，其中该治疗的选择基于在步骤(a)中确定的患者的预后。在一些实施方案中，该方法还包括(c)获得患者的生物学样品；(d)检测在该生物学样品中的IL8的表达，其中在该患者生物学样品中IL8的表达对癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。附图简述图1 描述了 MetMAb (0A5D5v2)的构架(FR)、CDR、第一恒定结构域(CL或CHl)和 Fc区(Fe)的氨基酸序列。所描述的Fc序列包含“孔洞”(空腔)突变T366S，L368A和 Y407V，如 WO 2005/063816 中所描述。图2 描述了包含“凸起”("knob")(隆凸)突变T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所描述。在一个实施方案中，包含这种序列的Fc多肽与包含图1的Fc序列的Fc多肽形成复合物从而产生Fc区。图3 在小鼠、大鼠和食蟹猴(cynomolgus monkey)中进行单次IV或IP推注剂量的MetMAb后平均血清MetMAb浓度-时间曲线图。如图所示MetMAb在第0天给药。图4 在KP4胰腺癌异种移植物模型中在多种剂量水平的单次IV推注剂量的 MetMAb后平均肿瘤体积-时间曲线图。如图所示MetMAb在第0天给药。图5:平均肿瘤体积-剂量曲线图。在第21天的组平均肿瘤体积=Σ (第21天肿瘤体积-相同动物在第0天的肿瘤体积)/η。图6 在ΚΡ4异种移植物模型中不同给药方案的IV推注剂量的MetMAb之后平均肿瘤体积-时间曲线图。箭头表示剂量组的给药时间如下(从顶排到底排)顶部箭头 MetMAb 0. 825mg/kg 每周一次(QlW)；中间箭头MetMAb 1. 25mg/kg 每两周一次(Q2W)；底部箭头=MetMAb 2. 5mg/kg每三周一次(Q3W)。在该图中〃 0A5D5"是指MetMAb。菱形表示 PBS对照。图7 在KP4异种移植物模型中单次IV推注剂量或IV输注MetMAb后平均肿瘤体积-时间曲线图。MetMAb如图所示进行给药。图8 在携带H596非小细胞肺癌肿瘤huHGF_SCID转基因小鼠中在IV推注剂量之后平均肿瘤体积-时间曲线图。MetMAb如图所示进行给药。图9 说明对于MetMAb的理论人群Η /PD肿瘤进展模型，由直接KP4肿瘤生长
15抑制的两区室(two-compartment)非线性1 模型构成。CL =总清除率的非饱和清除部分；CLd =区室间清除率；Kmltl =在50 % Vmaxlo的MetMAb血清浓度；Vmaxltl =总清除的饱和清除部分的最大药物去除；Vl =表观中心分布体积；V2 =表观外周分布体积；IC5tl = Michaelis-Menten常数，代表导致50%细胞生长抑制的MetMAb血清浓度；IMax =最大 MetMAb肿瘤生长抑制效应常数；KGN = KP4肿瘤细胞系体内净生长率；C = MetMAb血清浓度。图10 来自于15mg/kg Q3丽etMAb模拟实验的代表性I3K曲线图和MTC值。PK = 药物代谢动力学特征曲线(pharmacokinetic profile) ；MTC =最小肿瘤稳定MetMAb浓度。图11 对应于图10中所示1 曲线图和MTC值的肿瘤质量模拟实验。AUC =曲线下MetMAb血清面积；MTC =最小肿瘤稳定MetMAb浓度。图12 :1期剂量渐增(dose escalation)研究设计。图13 1期剂量渐增研究中患者诊断、治疗组和施用周期。在剂量-渐增阶段中每个患者的MetMAb暴露周期。除非另有注明，所有患者由于进展性疾病脱离研究。图14 每个剂量组中每个药物代谢动力学时间点的MetMAb血清浓度在所有患者中进行平均。对每个组用均值(士SD)MetMAb浓度相对于时间进行作图。图15 使用PK/PD建模来确定人中MTC中值(median)，其是基于临床前肿瘤异种移植物研究和种间比例确定来进行。人中血清中MetMAb的MTC确定为15ug/mL。使用基于来自这种1期研究观察到的1 数据的模拟实验来鉴定15mg/kg Q3W剂量(箭头)，其在 90%的患者中获得大于或等于MTC的稳态谷浓度。MTC =最小肿瘤稳定浓度，PK =药物代谢动力学，PD =药效学；SS =稳态，Q3W =每三周一次。图16 =Met的抑制可能影响循环配体HGF的水平。通过基于ELISA的方法测量血清HGF水平。数据以基线HGF表达降序呈现。总体而言，用MetMAb处理时似乎有很小或没有HGF表达的增加。然而显示最高水平的基线HGF表达的两个患者表现出显著的HGF表达降低。对于患者11009，药物治疗后HGF水平降低70%并且保持低水平。C=周期，D=天， HGF =肝细胞生长因子，M =男性，F =女性，ClDl，C2D1，C3D1 给药前；C1D2 给药后24h。图17 血清IL8水平的评价。数据以基线IL8表达的降序呈现。总体而言，具有高于正常对照的基线血清IL8水平的大部分患者在MetMAb输注后有血清IL8的降低。在 4周期间健康志愿者IL8的受试者内变异是 3-10pg/ml。IL8 =白细胞介素8，MSD =中间测量发现(meso scale discovery)，C =周期，D =天，M =男性，F =女性，C1D1，C2D1， C3D1 给药前；C1D2 给药后24h。图18 参与剂量渐增阶段的所有患者的最佳肿瘤反应。一位患者未进行评价，因为该患者在第一评价时间点之前有进展；另一位患者的CT评价在这些数据收集的时间不能获得。标明了患者数目和肿瘤类型。SLD=最长直径的总和。图19 患者11009的CT和MRI扫描。左上组患者11009在2007年8月的CT扫描。右上组患者11009的CT扫描，这使得她有资格登记进入MetMAbI期试验。左下组CT 扫描显示完全反应。右下组:MRI扫描确认了完全反应。圆圈标明了肿瘤的位点。图20 患者11009的标本组织的免疫组织化学染色。患者11009的标本胃腺癌样本的免疫组织化学染色揭示肿瘤细胞中有中度的膜和胞质c-met表达和胞质和膜周边HGF 表达。
详细描述I.定义术语"肝细胞生长因子"或"HGF"，用于本文时，除非另有说明，是指任何天然或变体(天然的或合成的)HGF多肽，其能够在允许此类过程发生的条件下激活HGF/c-met 信号传导途径。术语"野生型HGF" —般是指包含天然存在HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。 术语"野生型HGF序列"一般是指在天然存在的HGF中发现的氨基酸序列。c-met是HGF 的已知受体，通过c-met在生物学上完成HGF的细胞内信号传导。术语"HGF变体"用于本文时是指这样的HGF多肽，其包括天然HGF序列中一个或多个氨基酸突变。任选地，一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换(一个或多个)。“天然序列”多肽包含与来自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可以从自然分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽具体地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)，天然存在的变体形式(例如， 可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。多肽“变体”指与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性，更优选地至少约90%氨基酸序列同一性，以及甚至更优选地至少约95%氨基酸序列同一性。“ EGFR “是指受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体，其在Ullrich等， Nature (自然)(1984)309 :418425中描述，另外也称为Her-I和c-erbB基因产物，以及其变体如EGFRvIII。EGFR的变体也包括缺失、置换和插入变体，例如在Lynch等(New England Journal of Medicine (新英格兰医学杂志)2004，350 :2129)，Paez 等(Science (科学)2004，304 :1497)，Pao 等(PNAS 2004，101 13306)中描述的那些。“生物学样品"(可相互替换地称为“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖从个体获得的多种样品类型并可用于诊断或检测测定中。该定义涵盖生物学来源的血和其它液体样品，实体组织样品如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞，以及其后代。该定义也包括在它们获得后以任何方式操作的样品，如用试剂处理，增溶，或富集某些成分如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片的目的。术语"生物学样品"涵盖临床样品，并也包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，来自于新鲜、冷冻和/或储存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸；血液或任何血液成分；体液如脑脊液、羊水、腹水或间质液；来自于受试者怀孕或发育的任何时间的细胞。在一些实施方案中，生物学样品从原发或转移肿瘤中获得。生物学样品可含有本身与组织不天然混合的化合物如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、 固定剂、营养素、抗生素、或诸如此类的。“抗-c-met抗体"是以足够亲和力和特异性结合c-met的抗体。所选择的抗体通常具有针对c-met的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于IOOnM-IpM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振(surface plasmon resonance)的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号W02005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，该抗-c-met抗体可在靶向和介入其中涉及c-met活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。‘‘ c-met激活〃是指c-met受体的激活或磷酸化。通常，c-met激活导致信号转导(例如由c-met受体的细胞内激酶结构域磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。c-met激活可由c-met配体(HGF)结合感兴趣的c_met受体来介导。HGF结合c_met 可激活c-met的激酶结构域并由此导致c-met中酪氨酸残基的磷酸化和/或另外的底物多肽(一个或多个)中的酪氨酸残基的磷酸化。“EGFR拮抗剂”(互换地称为“EGFR抑制剂”)是干扰EGFR激活或功能的药剂。EGFR 抑制剂的实例包括EGFR抗体；EGFR配体的抗体；小分子EGFR拮抗剂；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA(例如，shRNA)分子(见例如，W02004/87207)。优选地，EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体或小分子。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是靶向EGFR的药物。在特定实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力(解离常数)约为1，OOOnM以下。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力约为IOOnM以下。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力约为50nM以下。在一个特定的实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR共价结合。在一个特定的实施方案中，EGFR抑制剂以1，OOOnM以下的IC50抑制EGFR细胞传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以500nM以下的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以50nM以下的IC50抑制EGFR信号传导。在某些实施方案中，EGFR拮抗剂降低或抑制，至少10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%, 90%或更高的EGFR的表达水平或生物学活性。"EGFR激活”指EGFR的激活或磷酸化。一般情况下，EGFR激活导致信号转导(例如，其由EGFR受体的细胞内激酶结构域磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。 EGFR激活可以由结合包含EGFR的EGFR 二聚体的EGFR配体所介导。EGFR配体与EGFR 二聚体的结合可以激活二聚体中的一个或多个EGFR的激酶结构域并且由此导致在一个或多个EGFR中的酪氨酸残基的磷酸化和/或在另外的底物多肽(一个或多个)中的酪氨酸残基的磷酸化。用于本文时，术语"EGFR-靶向药物"是指结合EGFR并抑制EGFR激活的治疗齐U。此类药剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL 8509)(参见美国专利No. 4，943，533，Mendelsohn等)及其变体，如嵌合的225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab) ；ERBUTIX )和改型的人225 (Η225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.) ；IMC-11F8，其是全人的、EGFR-靴向抗体(Liiclone)； 结合II型突变的EGFR的抗体(美国专利No. 5，212，290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No. 5，891，996中所描述；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF (参见 W098/50433, Abgenix) ；EMD 55900 (Stragliotto 等 Eur. J. Cancer 32A :636-640 (1996))； EMD7200 (matuzumab)，其是针对EGFR的人源化EGFR抗体，与EGF和TGF- α两者竞争EGFR 的结合；和mAb 806或人源化mAb 806 (Johns等，J.Biol. Chem.(生物化学杂志)279 ( ) 30375-30384 (2004))。抗-EGFR抗体可与细胞毒性剂缀合，从而产生免疫缀合物(参见，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的实例包括ZD1839或吉非替尼
18(IRESSA ；Astra Zeneca) ；CP-358774 或厄洛替尼(TARCEVA ;Genentech/0SI)；和 AG1478， AG1571(SU 5271 ； Sugen) ；EMD-7200。短语"基因扩增"是指这样的过程，通过该过程多拷贝的基因或基因片段在特定细胞或细胞系中形成。被复制的区(一段扩增的DNA)常常被称为“扩增子”。通常，所产生的信使RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也与该特定基因表达产生的拷贝数成比例的增加。“酪氨酸激酶抑制剂"是这样的分子，其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如c-met 受体的酪氨酸激酶活性。“显示c-met和/或EGFR表达、扩增或激活”的癌症或生物学样品是在诊断测试中，表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，具有扩增的c-met和/或EGFR基因，和/或其它证明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物学样品。“不显示c-met和/或EGFR表达、扩增或激活”的癌症或生物学样品是在诊断测试中，不表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，不具有扩增的c-met和/或EGFR基因，和/ 或其它未证明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物学样品。“显示c-met和/或EGFR激活〃的癌症或生物学样品是在诊断测试中，证明 c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过 ELISA测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接确定。“不显示c-met和/或EGFR激活〃的癌症或生物学样品是在诊断测试中，未证明 c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过 ELISA测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接确定。“显示c-met和/或EGFR扩增“的癌症或生物学样品是在诊断测试中具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物学样品。“不显示c-met和/或EGFR扩增“的癌症或生物学样品是在诊断测试中不具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物学样品。“磷酸-ELISA测定(phospho-ELISA assay)，，在本文中指在酶联免疫吸附测定法 (ELISA)中评估一种或多种c-met和/或EGFR的磷酸化的测定，其中使用检测磷酸化的 c-met和/或EGFR的试剂(通常是抗体)、底物或下游信号传导分子。优选的是，使用检测磷酸化c-met和/或EGFR的抗体。该测定可对细胞裂解物、优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞裂解物进行。"c-met和/或EGFR过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌细胞相比， 具有显著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定中通过评估细胞表面上存在的 c-met和/或EGFR蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定，IHC)来测定c-met和/或 EGFR的过表达或扩增。备选地/另外地，可测量细胞中编码c-met和/或EGFR的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH ；参见1998年10月公布的W098/4M79)、Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查。
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“不过表达或扩增c-met和/或EGFR"的癌症细胞是指与同一组织类型的非癌细胞相比，不具有高于正常水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌症细胞。术语“突变”在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因，RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到，而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中，突变一般是体细胞的。突变包括序列重排，诸如插入、缺失、和点突变 (包括单核苷酸/氨基酸多态性)。蛋白质“表达”指基因中所编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。在本文中，“表达”目的蛋白质(诸如HER受体或HER配体)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA，或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。术语〃白细胞介素8〃或〃 IL8"或〃 IL-8"，用于本文时，除非另外指明，是指任何天然或变体(天然的或合成的)IL8多肽，其能够在允许此类过程发生的条件下激活 IL8信号传导途径。术语"野生型IL8" —般是指包含天然存在IL8蛋白的氨基酸序列的多肽。术语"野生型IL8序列"一般是指在天然存在的IL8中发现的氨基酸序列。术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等科学(kience)， 246 :1306(1989)；和 Houck 等分子内分泌学(Mol. Endocrin.)，5 1806 (1991)，所记载的， 及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和PlGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶， 即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外，已经鉴定出neuropilin-Ι作为肝素-结合VEGF-A同种型受体，并可能在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表示人 VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。在本申请中可通过例如〃 VEGF(8-109), “ “ VEGF(1-109) 〃或〃 VEGF165〃表示对任何此类形式的VEGF的引述。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然 VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲和力。术语"VEGF变体"用于本文时是指在天然VEGF序列中包括一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地，该一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换(一个或多个)。为了对本文描述的VEGF变体速记命名的目的，请注意数字是指根据推定的天然VEGF的氨基酸序列(在Leimg等，见上文和Houck等，见上文中提供)的氨基酸残基位置。"VEGF生物学活性”包括与任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性如调节正常和异常血管发生和血管生成二者Perrara和Davis-Smyth(1997)内分泌综述 (Endocrine Rev.) 18 4-25 ；Ferrara (1999)分子医学杂志(J. Mol. Med.) 77 :527-543)；促进胚胎血管发生和血管生成(Carmeliet等.(1996)自然(Nature) 380 :4；35_439 ;Ferrara 等.(1996)自然(Nature) 380 :439-442)；和调节雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生长和软骨形成(Ferrara等.(1998)自然医学(Nature Med.) 4 :336-340 ；Gerber 等.(1999)自然医学(Nature Med.) 5 =623-628) 0除了作为血管发生和血管生成中的生血管因子之外，VEGF还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物学效应，如内皮细胞存活， 血管渗透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入Perrara和Davis-Smyth (1997)，见上文，和 Cebe-Suarez 等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life. Sci). 63 :601-615(2006)。 而且，最近的研究已经报道了 VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分裂作用。Guerrin等.(19%)细胞生理学杂志 (J. Cell Physiol.) 164 :385-394 ；Oberg-Welsh 等(1997).分子细胞内分泌学(Mol. Cell. Endocrinol). 126 :125-132(1997) ；Sondell 等.神经科学杂志(J. Neurosci.) 19 5731-5740(1999)。“血管发生抑制剂”或“抗血管发生剂”指直接或是间接抑制血管发生、血管生成、 或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、 或其缀合物或融合蛋白。应当理解抗血管发生剂包括结合和阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的那些药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A、或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-I受体)的抗体，抗-PDGFR抑制剂如GLEEVEC (甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate) )0抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如制管张素、内皮生长抑素等。参见例如Klagsbrun和D’ Amore生理学年评(Annu. Rev. Physiol.) 53 :217-39 (1991) ；Streit 和 Detmar 癌基因(Oncogene) 22 3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3) ；Ferrara和Alitalo 自然药物(Nature Medicine) 5 :1359-1364(1999) ；Tonini 等癌基因(Oncogene) 22 6549-6556(2003)(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；及Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8 200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生药剂的表1)。"VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基)。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%,80%,90%或更多。在一个实施方案中，受到VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、 VEGF (1-109)或VEGF165。可用于本发明方法的VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段；和特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF 结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白质)结合的受体分子及衍生物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA ；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(ρ印tibody) ’及VEGF适配体。术语“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于IOOnM-IpM之间的Kd 值结合hVEGF。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号W02005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，本发明的抗-VEGF抗体可在靶向或干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，该抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法(如在下文实施例中描述的)；肿瘤细胞
21生长抑制测定法(如例如W089/06692所描述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5，500，36 ；及激动性活性或造血测定法(参见TO95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。在某些实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. 1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗-VEGF单克隆抗体(根据I^resta等癌症研究(CancerRes.) 57 :4593-4599(1997)产生)。在一个实施方案中，该抗-VEGF 抗体是“贝伐珠单抗(Bevacizumab，BV) ”、也称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN ”。 其包含突变的人IgGl构架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A. 4. 6. 1 (其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补性决定区。贝伐珠单抗大约93%的氨基酸序列(包括大部分构架区)衍生自人IgGl，而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4. 6.1。贝伐珠单抗具有约149,000 道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐珠单抗已经被FDA批准用于联合其它化学治疗方案来治疗转移性结肠直肠癌(metastatic colorectal cancer(CRC))和非小细胞肺癌 (NSCLC)。Hurwitz 等，N. Engl. J. Med.(新英格兰医学杂志)350 :2335-42(2004) ；Sandler 等，N. Engl. J.Med.(新英格兰医学杂志)355 :2M2_5(K2006)。目前，贝伐珠单抗在许多正在进行的临床试验中进行研究以用于治疗多种癌症适应症。Kerbel，J. Clin. Oncol.(临床肿瘤学)19 :45S-51SQ001) ；De Vore 等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 19 :485a. (2000)； Hurwitz 等，Clin. Colorectal Cancer 6 :66-69 (2006) ； Johnson 等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20 :315a(2001) ；Kabbinavar 等 J. Clin. Oncol.(临床肿瘤学)21 :60-65(2003)； Miller 等，Breast Can. Res. Treat. 94 =Suppl 1 :S6 (2005)。贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月沈日授权的美国专利号6，884，879。另外的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-3UB20-4. 1)，如PCT
发明者亚瑟·E·雷耶斯二世, 史蒂夫·艾普勒, 埃米·C·彼得森, 尼尔森·L·琼布, 布兰登·C·本德, 普里蒂·赫格德, 项洪, 马克·麦钱特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司