白介素-21受体结合蛋白的利记博彩app

专利名称：白介素-21受体结合蛋白的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及结合白介素-21受体(IL-21R)，特别是人IL-21R的结合蛋白及其抗原 结合片段，及其在调节IL-21R相关活性中的用途。本文中公开的结合蛋白在治疗和/或诊 断IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、高增殖性血液病 症、和其它免疫系统病症中有用。
背景技术：
抗原激起免疫应答并激活最大的两群淋巴细胞T细胞和B细胞。遭遇抗原后，T 细胞增殖并分化成效应器细胞，而B细胞增殖并分化成抗体分泌浆细胞。这些效应器细胞 分泌和/或响应细胞因子，细胞因子是由淋巴细胞和其它细胞类型分泌的小蛋白质(小于 约 30kDa)。人IL-21是与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性的细胞因子(Parrish-Novak 等0000)Nature 408:57-63)。尽管白介素细胞因子间序列同源性低，但是细胞因子分享 共同的折叠，折叠成该家族代表性的“四螺旋束”结构。大多数细胞因子结合I类或II类 细胞因子受体。II类细胞因子受体包括IL-10和干扰素的受体，而I受细胞因子受体包括 IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-15以及造血生长因子、瘦蛋白、和生长激素 的受体(Cosman (1993) Cytokine 5:95-106)。人IL-21R是I类细胞因子受体。编码人IL-21及其受体(IL-21R)的核苷酸和氨基 酸序列记载于国际申请公开号WO 00/053761和WO 0 1/085792 ;Parrish_Novak等Q000) supra ；及 Ozaki 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11439-44。IL-21R 与 IL-2 受体 β链和IL-4受体α链具有最高的序列同源性(Ozaki等Q000) supra)。在配体结合时， IL-21R与IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受体复合物分享的共同伽马细 胞因子受体链(Y c)联合(Ozaki 等 Q000) supra ；Asao 等 Q001)J. Immunol. 167 :1_5)。IL-21R在淋巴样组织中，特别是在T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突 细胞(DC)和巨噬细胞上表达(Parrish-Novak等(2000) supra)，这容许这些细胞响应 IL-21 (Leonard and Spolski (2005) Nat. Rev. Immunol. 5 :688-98)。IL-21R 的广泛淋巴 样分布指示IL-21在免疫调节中发挥重要作用。体外研究显示了 IL-21显著调控B细 胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞、及 NK 细胞的功能(Parrish-Novak 等 Q000) supra ；Kasaian 等 (2002) Immunity 16 :559-69)。最新的证据提示IL-21介导的信号传导可具有抗肿瘤活性 (Sivakumar等Q004) Immunology 112 :177-82)，而且IL-21能在小鼠中预防抗原诱导的消 除(Shang 等 Q006)Cell. Immunol. 241 :66-74)。在自身免疫中，破坏IL-21基因和注射重组IL-21显示出分别调控实验性自身免 疫性重症肌无力(EAMG)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展(King等Q004)Cell117 :265-77 ；Ozaki 等(2004) J. Immunol. 173 :5361-71 ；Vollmer 等(2005) J. Immunol. 174 2696-2701 ；Liu 等(2006) J. Immunol. 176 :5247-54)。在这些实验系统中，提示操纵 IL-21 介导的信号传导直接改变CD8+细胞、B细胞、T辅助细胞、和NK细胞的功能。发明概述本发明描述了特异性结合人和鼠IL-21R的结合蛋白例如人抗体及其片段的分离 和表征。本文中描述的结合蛋白衍生自抗体18A5，其披露于美国专利No. 7，495，085，通过 述及将其全部收入本文。本发明的结合蛋白具有程度比亲本18A5抗体大得多的对人和/ 或鼠IL-21R的亲和力。本发明至少部分提供以高亲和力和特异性结合IL-21R，特别是人IL-21R的 IL-21R结合剂(诸如结合蛋白及其抗原结合片段)。本发明的结合蛋白及其抗原结合片段 在本文中也分别称作“抗IL-21R结合蛋白”及“其片段”。在一个实施方案中，结合蛋白或 其片段降低、抑制、或拮抗IL-21R活性。此类结合蛋白可用于通过拮抗IL-21R活性来调节 免疫应答或IL-21R相关病症。在其它实施方案中，抗IL-21R结合蛋白可用于诊断，或作为 靶向结合蛋白用于将治疗剂或细胞毒剂投递至IL-21R表达细胞。如此，本发明的抗IL-21R 结合蛋白在诊断和治疗IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植 排斥、高增殖性病症、和其它免疫系统病症中有用。因而，在一个方面，本发明的结合蛋白特征为一种结合IL-21R，特别是人IL-21R 的分离的结合蛋白(例如分离的抗体)或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗IL-21R 结合蛋白(例如抗体)可具有一项或多项下述特征(1)它是单克隆或单特异性结合蛋白； ⑵它是人结合蛋白；(3)它是体外生成的结合蛋白；(4)它是体内(例如转基因小鼠系统) 生成的结合蛋白；(5)它抑制IL-21结合IL-21R;(6)它是IgGl ； (7)它以至少约IO5M4iT1 的结合常数结合人IL_21R;(8)它以至少约^clO4M4iT1的结合常数结合鼠IL-21R; (9)它以 约ΙΟ、—1或更少的解离常数结合人IL-21R ;(10)它以约ΙΟ、—1或更少的解离常数结合鼠 IL-21R ； (11)它以约1. 75ηΜ或更少的IC50抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性BaF3细 胞增殖；(12)它以约0. 5nM或更少的IC50抑制鼠IL-21R介导的鼠IL-21R表达性BaF3细 胞增殖；(13)它以约14. OnM或更少的IC50抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性TFl细 胞增殖；(14)它以约1.9nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的人原代B细胞增殖；(15)它以 约1. 5nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的人原代⑶4+ T细胞增殖；和(16)它以约5. OnM 或更少的IC5tl抑制IL-21介导的鼠原代⑶4+ T细胞增殖。本发明的结合蛋白(术语“结合蛋白”根据需要还包括及指其抗原结合片段) 的非限制性例示性实施方案在本文中称作AbA-AbZ，而且这些术语与美国临时专利申请 No. 61/055，500中使用的术语的关系呈现于表2A。本发明的结合蛋白的其它例示性实施方 案，即scFv，在本文中称作H3-H6、L1-L6、L8-L21、和L23-L25，如表2B中详述的。本发明的一个实施方案是结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其 中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同 的氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48， 50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98， 100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136， 138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165—168，171—193，213—229，240, 242, 244, M6，和M8。分离的结合蛋白或抗原结合片段可以是例如抗体、scFv、VH、\、 或 CDR。本发明的另一个实施方案是结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段， 其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95% 相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO :13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33， 35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83， 85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125， 127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161,239， 241，243，245，和 247。本发明的又一个实施方案是包含至少一种选自下组的氨基酸序列的分离的结合 蛋白或抗原结合片段SEQ ID NO :14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42, 44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92， 94,96,98,100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132， 134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193， 213-229，240，242，244，246，和 248。本发明的又一个实施方案是结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段， 其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相 同的氨基酸序列:SEQ ID NO 6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40， 42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90， 92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130， 132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162—195，213—229， 240, 242, 244, M6，和M8，且其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自 下组的序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10，12，163，164，169，170，194， 和195，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列 至少约 95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38， 40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88， 90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128， 130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168， 171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。本发明的又一个实施方案是结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段， 其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95% 相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO :5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27， 29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77， 79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121， 123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159， 161，239，M1，M3，M5，和M7，且其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由 与选自下组的序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO :5,7,9, 和11，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列 至少约95%相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO 13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77， 79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121， 123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159， 161, 239, 241, 243, 245,^P 247。本发明的又一个实施方案是包含至少一种选自下组的氨基酸序列的分离的结合 蛋白或抗原结合片段:SEQ ID NO :6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36, 38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86， 88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126， 128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162—195， 213-229，240, 242, 244, M6，和M8，其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种 与选自下组的序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10，12，163，164，169， 170，194，和195，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨 基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，26，28，30，32， 34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82， 84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124， 126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162， 165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。本发明的另一个实施方案是结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段， 其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链，且其中该重链包含至少一种选自下 组的氨基酸序列:SEQ ID NO :14,16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和 242,或与其基本上相同的序列(例如与其基本上相同的序列包括与其至少约85 %，90 %， 95 %，96%，97%，98%，99%，或更多相同的序列)，或与其基本上同源的序列(例如与其 基本上同源的序列包括与其至少约50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%， 95%,96%,97%,98%,99%,或更多相同的序列)。在又一个实施方案中，结合蛋白或抗原 结合片段包含\域和Vh域，且该￥11域包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 14, 16，18，和20，或与其基本上相同或同源的序列。本发明的另一个实施方案是结合IL-21R的 分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链， 且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO =22,24,26,28,30,32,34, 36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，74，76，78，80，82，84，86，96，98， 100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和 248，或与其基本上相同或同源的序 列。在又一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含\域和Vh域，且该\域包含至少 一种选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO =22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48, 50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223，225，227，和 229，或与其基本上相同或同 源的序列。在又一个实施方案中，重链包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO =88,90,92, 94，213，218，219，M0，和M2，且轻链包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO =96,98,100, 102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244，246，和 248，或与其基本上相同或 同源的序列。本发明的结合蛋白，例如抗体，可以是种系的或非种系的。它们可以特异性结合与 AbA-AbZ, H3-H6、L1-L6、L8-L21、或L23-L25结合的表位相同的IL-21R表位或相似的表位(例如交叠表位)。在其它实施方案中，结合蛋白特异性结合IL-21R片段，例如SEQ ID NO 2或4所示氨基酸序列或与其至少85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或更多相同的序 列的至少10，20，50，75，100，150，或200个连续氨基酸的片段。本发明的另一个实施方案是结合选自下组的结合蛋白识别的IL-21R表位的分 离的结合蛋白或其抗原结合片段AbA-AbZ，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25，其中该结 合蛋白或抗原结合片段竞争性抑制选自下组的结合蛋白结合人IL-21R:AbA-AbZ，H3-H6， L1-L6，L8-L21，和L23-L25。在另一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含重链、轻 链、或Fv片段，其包含选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO :14，16，18，20，22，24，洸，28，30， 32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80， 82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122， 124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160， 162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248，或与其基本上相同或同源的序 列。在又一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段，其包含由 选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列=SEQ ID NO 13，15，17，19，21，23，25，27，29，31， 33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81， 83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123， 125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161， 239，241,243, M5，和M7，或与其基本上相同或同源的序列。在其它实施方案中，结合蛋白包含这些Vh和\域的至少一种互补决定区(OTR) (例如一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种邻近的 CDR(例如由框架区(FR)或接头隔开的两种或更多种CDR)或非邻近的CDR(例如由至少一 种其它CDR和例如FR隔开的两种或更多种CDR))。例如，结合蛋白可包括Vh域和/或八域 的一种、两种、三种或更多种⑶R。本公开提供来自AbA-AbZ、H3-H6、L1-L6、L8-L21、和 L23-L25 之 Vh 和 \ 域的核酸 序列。还涵盖包含至少一种来自AbA-AbZ、H3-H6、Ll-L6、L8-L21、和L23-L25的CDR的核酸 序列。本公开还提供包含此类核酸的载体和宿主细胞。本发明的结合蛋白可以是全长的(例如包括至少一条完整重链和至少一条完整 轻链)，或者可以只包括抗原结合片段(例如，保留特异性结合抗原的能力的全长结合蛋白 的Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、单链Fv片段、Fd片段、dAb片段、CDR、或其它片段)。结合蛋白 可以包括选自卡帕(κ)、拉姆达(λ)、阿尔法(α)、伽马(Y)、德尔塔(δ)、厄普西隆(ε) 和谬(μ)恒定区基因任一的恒定区或其一部分。例如，可以使用各种同种型的重链恒定 区，包括=IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgM, IgAl, IgA2，IgD，和IgE0轻链恒定区可以选自卡帕 或拉姆达。结合蛋白可以是IgG，或者它也可以是IgGl κ或IgGl λ。本文中描述的抗IL-21R结合蛋白可以衍生化或连接至另一功能性分子(诸如另 一肽或蛋白质，例如Fab片段)。例如，本发明的结合蛋白可以功能性连接(例如通过化学偶 联、遗传融合、非共价联合或其它方式)至至少一种其它分子实体，诸如另一结合蛋白(例 如双特异性或多特异性结合蛋白)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞抑制剂、等等。在本发明的一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段对人IL-21R的结合常数 为至少约IO5M4sA在另一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段以约1. 75ηΜ或更少的IC50抑制IL-21介导的BaF3细胞增殖，且所述BaF3细胞包含人IL-21R。在另一个实施方案 中，结合蛋白或抗原结合片段以约14. OnM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的TFl细胞增殖， 且所述TFl细胞包含人IL-21R。在另一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段以约1. 9nM 或更少的IC5tl抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖，且所述B细胞包含人IL-21R。在又一 个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段以约1. 5nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的原代 人⑶4+细胞增殖，且所述⑶4+细胞包含人IL-21R。在一个实施方案中，本发明提供结合蛋白或抗原结合片段，所述蛋白或抗原结合 片段与和SEQ ID NO 2的至少100个连续氨基酸的任何序列至少约95%相同的氨基酸序 列特异性结合。另一个实施方案提供抑制IL-21结合IL-21R的结合蛋白或抗原结合片段。 在至少一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段是IgGl。在至少一个实施方案中，结合蛋 白或抗原结合片段是人的。在另一个方面，本发明特征为一种药物组合物，其含有至少一种抗IL-21R结合蛋 白和药学可接受载体。药物组合物可进一步包括至少一种抗IL-21R结合蛋白和至少一种 其它治疗剂(例如细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制 剂、细胞毒剂、细胞抑制剂、或其组合，如本文中更详细描述的)的组合。抗IL-21R结合蛋 白和治疗剂的组合也在本发明的范围内。本发明的组合物和组合可用于调节IL-21R相关 免疫病症，例如通过调控IL-21R信号传导来进行。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白是抗体。在进一步的实施方案中，抗体是多 克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人的、单链的、嵌合的、 合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的(grafted)、体外生成的和/或多特异性的(例如自 至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)。本发明的其它实施方案包括编码抗IL-21R结合蛋白的分离的核酸、包含该核酸 的表达载体、和经该载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、 植物细胞、或昆虫细胞。结合蛋白可以用可检测物质直接或间接标记以便于结合的或未结合的结合蛋白的 检测。合适的可检测物质包括但不限于各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、和放射性材料。在另一个方面，本发明提供用于在体内将药剂例如治疗剂或细胞毒剂投递或靶 向至IL-21R表达细胞的方法。该方法包括在容许结合蛋白结合IL-21R的条件下对受试 者施用抗IL-21R结合蛋白。结合蛋白可以偶联至第二治疗性模块(second therapeutic moiety)，例如毒素。在另一个实施方案中，本发明提供诊断试剂盒，其包含本发明的结合蛋白或抗原 结合片段。本公开的别的方面会在说明中部分列出，而且根据说明会部分显而易见，或者通 过实践本发明可学会。本发明在权利要求中列出和具体指出，而且本公开不应解释为限制 权利要求的范围。下面的详细说明包括本发明各种实施方案的例示性呈现，它们对于要求 保护的发明不是限制性的。附图构成本说明书的一部分，而且与说明一起只用来例示实施 方案，而非限制本发明。附图简述图l(a-c)描绘scFv对人IL_21R_BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv
12混合，然后与100pg/ml人IL-21 —起温育。48小时后通过CELLTITER GLO (Promega Corporation, Madison, WI) ij jfi±f·。图2 (a-c)描绘scFv对人IL-21R-TF1细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混合， 然后与100pg/ml人IL-21 —起温育。48小时后通过CELLTITER-GL0 测量增殖。图3 (a-c)描绘scFv对鼠IL_21R_BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混 合，然后与400pg/ml鼠IL-21 —起温育。48小时后通过CELLTITER-GL0 测量增殖。图4(a_c)描绘scFv与亲本抗体18A5IgG竞争对鼠IL-21R的结合。将scFv与 生物素化的鼠IL-21R H/F混合，并将混合物添加至在ELISA板上固定化的抗体18A5。用 HRP-链霉亲合素检测mIL-21R捕捉，并以A450信号的降低指示对mIL_21R结合的竞争。图5描绘21对重链/轻链对IL-21依赖性增殖的中和。将图中所示抗体添加至细 胞。随后添加IL-21，并在48小时后用CELLTITER GLO 测量增殖。对人IL_21R_BaF3细 胞用 100pg/ml 人 IL-21 (图 5a_c)、对人 IL-2IR-TFl 细胞用 100pg/ml 人 IL-21 (图 5d-f)、 或对鼠IL-21R-BaF3细胞用400pg/ml鼠IL-21 (图5g_i)来进行测定。图6描绘21种抗IL-21R IgG对瞬时表达人IL-21R(图6a_c)、大鼠IL-21R(图 6d-f)、猕猴IL-21R(图6g-i)、和人伽马(γ)共同链(图6j-l)的CHO细胞的结合。用 IL-21R或对照伽马(Y)共同链瞬时转染CHO细胞，并在基于细胞的ELISA中用HRP偶联的 抗人IgG测量结合。图 7 (a-c)描绘特定抗 IL-21R 抗体(图 7a，AbS ；图 7b，AbQ、AbT、AbO ；图 7c， AbR、AbP、和AbU)的结合特异性，这是通过表面等离振子共振测量得出的。在抗人IgG上 捕捉抗IL-21R抗体，并在BIAC0RE (GE Healthcare, Piscataway，NJ)仪器中测量随后对 鼠IL-21R-H/F、人IL-13-H/F、人IL_2R0、或人可溶性IL-4R任一的结合。图7d显示人 IL-2Ri3和人可溶性IL-4R分别被特异性抗IL_2Ri3和抗IL-4R抗体所捕捉(对照)。图8(a_d)描绘抗IL-21R抗体对人和鼠IL-21R的结合。在BIAC0RE 芯片上固定 化的抗人IgG上捕捉所示人抗IL-21R抗体。让不同浓度的人IL-2IR-His/FLAG(图8a_b) 和鼠IL-2IR-His/FLAG(图8c_d)流过芯片，并监测结合和解离。图9描绘抗IL-21R抗体对人和猕猴IL-21R的结合。在BIAC0RE 芯片上固定化 的抗人IgG上捕捉人抗IL-21R抗体AbS和AbT。让不同浓度的人和猕猴IL_21R-His/FLAG 流过芯片，并监测结合和解离。图9a显示猕猴IL-2IR-His/FLAG结合至AbS。图9b显示 人IL-2IR-His/FLAG结合至AbS。图9c显示猕猴IL-2IR-His/FLAG结合至AbT。图9d显 示人 IL-2IR-His/FLAG 结合至 AbT。

图10描绘IL-21R抗体的表位评估。在图IOa所示实验中(还可见Y轴左边的图 解)，通过BIAC0RE 芯片上固定化的抗IL-21R抗体AbS来捕捉鼠IL-21R-H/F (His-Flag融 合蛋白)。使别的抗IL-21R抗体(AbS、AbT、D5 (D5-20，一种中和性抗鼠IL-21R抗体)、和 7C2(—种非中和性抗鼠IL-21R对照抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F 的结合。在图IOb所示实验中，通过BIAC0RE 芯片上固定化的抗IL-21R抗体AbS来捕捉 人IL-21R-H/F。使别的抗IL-21R抗体(AbS、AbT、和9D2( —种非中和性抗人IL-21R对照 抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F的结合。图11描绘所示抗体对人IL-21R_BaF3细胞和鼠IL_21R_BaF3细胞增殖的中和。 将抗体添加至细胞。随后添加IL-21，并在48小时后用CELLTITER GLO 测量增殖。对人IL-21R-BaF3 细胞用 100pg/ml 人 IL-21 (图 Ila)、对鼠 IL_21R_BaF3 细胞用 200pg/ml 鼠 IL-21 (图lib)、及对人IL-21R-TF1细胞用100pg/ml人IL-21 (图lie)来进行测定。图12描绘对人原代B细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与抗⑶40抗体和人IL-21 一起将所示抗体添加至原代人B细胞。3天后测量3H-胸苷掺入。图1 描绘AbQ、AbR、 AbS、AbT、AbU、IL-13三重突变体、和18A5亲本抗体之间的比较；图12b描绘AbT、AbV、AbW、 AbU、和人IgGl对照(hlgl)之间的比较。图13描绘对人原代⑶4+ T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21 —起将 所示抗体添加至活化的原代人CD4+ T细胞，并在3天后测量3H-胸苷掺入。图14描绘对鼠原代⑶8+ T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21 —起将 所示抗体添加至活化的原代鼠CD8+ T细胞，并在3天后测量3H-胸苷掺入。图15描绘由抗IL-21R抗体诱导的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测量。通 过碘化丙啶的掺入来测量经所示抗IL-21R抗体包被的CFSE标记的BJAB细胞的PBMC依赖 性杀伤。包括抗CD20抗体利妥昔单抗(RITUXAN ,Genentech，Inc.，South San Francisco, CA)作为阳性对照，而且包括抗IL-13抗体作为阴性对照。图16描绘抗IL-21R抗体的补体Clq结合。在ELISA板上固定化所示抗IL-21R 抗体，并在与人血清一起温育后，用鸡抗人Clq和HRP偶联的抗鸡IgY抗体测量Clq结合。 包括抗⑶20抗体利妥昔单抗(RITUXAN )作为阳性对照，并包括抗IL-13抗体作为阴性 对照。图17 (a-c)描绘 AbQ 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、
和恒定区。图18 (a-c)描绘 AbR 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图19 (a-c)描绘 Abff 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、
和恒定区。图20 (a-c)描绘 AbS 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图21 (a-c)描绘 AbT 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图22 (a-c)描绘 AbO 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、
和恒定区。图23 (a-c)描绘 AbP 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图 24 (a-c)描绘 AbU 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图25 (a-c)描绘 AbV 的氨基酸序列，包括 Vh 和 Vl 域、CDR (Hl，H2，H3，Ll，L2，和 L3)、 和恒定区。图沈(『0描绘与产生图5、11、12、13、和14(上文描述的)所示结果的研究类似 实施的别的研究产生的结果。图27描绘IL-21细胞因子与抗体AbT竞争对鼠IL-21R的结合。将媒介(vehicle)或渐增量的IL-21与生物素化的鼠IL-2IR-His/FLAG混合，并将混合物添加至在ELISA板 上固定化的AbT。用HRP-链霉亲合素检测mIL-2 IR捕捉，并以A450信号的降低指示mIL_2 IR 结合的竞争。发明详述本发明的结合蛋白最初衍生自亲本抗体18A5，但是在重链和/或轻链互补决定区 3(CDR3)部分氨基酸序列方面不同于18A5。另外，本发明的结合蛋白显示结合和中和人和 鼠IL-21R 二者方面与等同形式(例如scFv或IgG)的18A5相比改良的效力。先前没有报 告单一结合蛋白对来自这两个物种(人和小鼠)的IL-21R的高效力中和。具有比它们的 亲本抗体更大的中和效力的本发明结合蛋白可转化为与先前记载的药剂相比更高的功效。 另外，已经改变了 Vh和\框架区的氨基酸序列以匹配由人基因组序列编码的序列，由此降 低用本发明结合蛋白处理的患者中人抗人抗体应答的潜力。定义为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。别的定义遍及详述和说明书中的其 它地方列出。术语“结合蛋白”如本文中使用的包括如下的任何天然发生的、重组的、合成的、 或遗传工程的蛋白质或其组合，其结合抗原、靶蛋白质、或肽，或其片段。本发明的结合蛋 白可包括抗体，或衍生自至少一种抗体片段。结合蛋白可包括天然发生的蛋白质和/或合 成工程的蛋白质。本发明的结合蛋白可结合抗原或其片段以形成复合物，并引发生物学应 答(例如激动或拮抗特定生物学活性)。结合蛋白可包括分离的抗体片段。由抗体重和 轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻和重链可变区经肽接头相连接的重组单链多肽分 子(“scFv蛋白质”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。结合蛋白片段 还可包括功能性抗体片段，诸如例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fe、Fd、Fd，、Fv、和单抗体可变域 (dAb)。结合蛋白抗原是双链或单链，而且可包含单个结合域或多个结合域。结合蛋白还可包括结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽融合或以其它 方式连接至免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽，后者继而融合或以其它方式连接至包含来 自免疫球蛋白重链的一个或多个天然或工程化恒定区的区域，所述恒定区不同于CH1，例如 IgG和IgA的Ch2和Ch3区或者IgE的CH3和CH4区(更完整的说明参见例如Ledbetter等， 美国专利公开文本2005/0136049)。结合域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括如下的区 域，其包括融合或以其它方式连接至铰链区多肽的天然或工程化免疫球蛋白重链Ch2恒定 区多肽(或CH3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)和融合或以其它方式连接至 Ch2恒定区多肽(或Ch3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)的天然或工程化免疫 球蛋白重链CH3恒定区多肽(或CH4，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)。通常，此 类结合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一项选自下组的免疫学活性抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性、补体结合、和/或对靶物(例如靶抗原)的结合。本发明的结合蛋白可衍生 自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。术语“抗体”如本文中使用的指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋 白。此类抗体包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、 多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合 成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变型抗体、嫁接偶联抗体(即偶联或融合至其它蛋白质、放射性标记物、细胞毒素的抗体)、和体外生成的抗体。抗体可来自任何类的抗体，包括但不限 于IgG, IgA、IgM, IgD、和IgE，及来自任何亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。 抗体可具有选自例如IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如卡 帕(κ)或拉姆达(λ)的轻链。本发明的抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、 骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。抗体的恒定区可进行改变，例如突变，以修饰 抗体的特性(例如以提高或降低下述一项或多项Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基 的数目、效应器细胞功能、或补体功能)。通常，抗体特异性结合预定抗原，例如与病症有关 的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神经变性性的、代谢的、和/或恶性的 病症。术语“单域结合蛋白”如本文中使用的包括结合抗原、蛋白质、或多肽的任何单域 结合支架。单域结合蛋白可包括如下的任何天然的、重组的、合成的、或遗传工程的蛋白质 支架或其组合，其结合抗原或其片段以形成复合物，并引发生物学应答(例如激动或拮抗 特定生物学活性)。单域结合蛋白可衍生自天然发生的蛋白质或抗体，或者它们可以合成 工程化或通过重组技术来生成。单域结合蛋白可以是任何现有技术的单域结合蛋白或任 何未来的单域结合蛋白，而且可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、 鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。在本发明的一些实施方案中，单域结合蛋白支架可衍生自在鱼 中找到的免疫球蛋白的可变区，诸如例如衍生自在鲨鱼血清中找到的称作新型抗原受体 (NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。生成衍生自NAR可变区(“IgNAR”)的单域结合支架的 方法记载于国际申请公开号 No. WO 03/014161 及 MreltsovQ005)Protein Sci. 14(11) 2901-09。在其它实施方案中，单域结合蛋白是现有技术中描述为不含轻链的重链抗体的天 然发生的单域结合蛋白。此类单域结合蛋白披露于例如国际申请公开号WO 94/004678。出 于清楚原因，衍生自天然不含轻链的重链抗体的可变域结合蛋白在本文中称作VHH或“纳 米抗体” (nanobody)以将它与常规四链免疫球蛋白的Vh区分开。此类VHH分子可衍生自在 骆驼科(Camelidae)物种中产生的抗体，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼、和原驼中。骆 驼科以外的其它科也可用于生成天然不含轻链的重链结合蛋白。VHH分子比传统的IgG分 子小大约10倍。它们是单一多肽，而且非常稳定，对极端pH和温度条件有抗性。此外，它们 对蛋白酶的作用有抗性，常规抗体则不然。此外，体外表达VHH能生成高产量的、正确折叠 的功能性VHH。另外，在camelids中生成的结合蛋白能识别经抗体文库或经免疫camelids 以外的哺乳动物在体外生成的抗体识别的表位以外的表位(参见例如国际申请公开号WO 97/049805和WO 94/004678，通过述及将二者收入本文)。术语“抗原结合域”和“抗原结合片段”指结合蛋白的一部分，其包负责含结合蛋白 和抗原之间特异性结合的氨基酸。抗原中受到结合蛋白特异性识别和结合的部分称作“表 位”。抗原结合域可包含抗体的轻链可变区和重链可变区(Vh)；然而，它不必包含二者。 例如，Fd片段具有两个Vh区，而且常常保留完整抗原结合域的抗原结合功能。结合蛋白的 抗原结合片段的例子包括但不限于(I)Fab片段，即具有\、Vh、(^和ChI域的单价片段；(2) F(ab' )2片段，即具有通过铰链区处的二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；(3)Fd 片段，其具有两个Vh和一个ChI域；(4) Fv片段，其具有抗体单臂的\和Vh域；(5) dAb片段 (参见例如Ward等(1989) Nature 341力44-46)，其具有Vh域；(6)分离的CDR;和(7)单链可变片段(scFv)。虽然Fv片段的两个域(即\和Vh)由分开的基因编码，但是它们能接合 在一起，这使用重组方法，通过合成的接头，使得它们能够作为单一蛋白质链生成，其中八 和Vh区配对以形成单价分子(称作scFv)(参见例如Bird等(1988) Science 242 :423-26 ； Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. ki. USA 85:5879-83)。这些结合域片段可使用本领域 技术人员知道的常规技术来获得，而且可以以与完整结合蛋白诸如例如抗体相同的方式对 片段评估功能。术语“中和”指结合蛋白或其抗原结合片段(例如抗体)降低或阻断信号传导途 径或抗原，例如IL-21/IL-21R信号传导途径或IL-21R抗原的活性。术语“有效量”指足以调节IL-21R活性以改善或减轻临床症状的严重程度或实现 期望的生物学结果，例如降低T细胞和/或B细胞活性、遏制自身免疫、遏制移植排斥的剂
量或量。术语“人结合蛋白”包括具有基本上与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列(包 括例如 Kabat 等(5th ed. 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest， U. S. Department of Health and Human ServicesiNIH Publication No. 91 3242记载的) 对应的可变和恒定区的结合蛋白。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列 编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突 变)，例如在⑶R中，特别是在⑶R3在。人抗体中可以有至少一个、两个、三个、四个、五个、 或更多个位置被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换。短语“抑制”、“拮抗”、“阻断”、或“中和” IL-21R活性及其类似短语指IL-21R的至 少一种活性由于结合抗IL-21R抗体而降低、抑制、或以其它方式减弱，其中降低是相对于 IL-21R在该抗体缺失下的活性。IL-21R活性可使用本领域已知的任何技术来测量。抑制或 拮抗不必指示完全消除IL-21R生物学活性。活性的降低可以是约10^,20^,30^,40%, 50%，60%，70%，80%，90%，95%，或更多。术语“白介素-21受体”或“IL-21R”等等指结合IL-21配体的I类细胞因子 家族受体，也称作MU-I (参见例如美国专利申请No. 09/569，384和美国申请公开文本 No. 2004/0265960 ；2006/0159655 ；2006/0024268 ；和 2008/0241098) ,NILR 或 zalphall (参 见例如国际申请公开号 WO 01/085792 ；Parrish Novak 等 Q000) supra ;0zaki 等 QOOO) supra)。IL-21R与 IL-2 和 IL-15 受体分享的 β 链、和 IL-4 α 同源(Ozaki 等 Q000) supra)。 在配体结合时，IL-21R能够与共同伽马细胞因子受体链(Yc)相互作用并诱导STATl和 STAT3(Asao 等 Q001) supra)或 STAT5 (Ozaki 等 Q000) supra)磷酸化。IL-21R 显示广泛 的淋巴样组织分布。术语“白介素-21受体”或“IL-21R”等等还指能够与IL-21 (优选哺乳 动物起源的IL-21，例如鼠或人IL-21)相互作用且具有至少一项下述特征的多肽(优选哺 乳动物起源的，例如鼠或人IL-21R)或(在上下文需要时)编码此类多肽的多核苷酸(1) 天然发生的哺乳动物IL-21R多肽的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID N0:2(人-对应于 GENBANK (U. S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda,MD)登录号 NP_068570) 或SEQ ID NO :4(鼠-对应于GENBANK .登录号NP_068687)所列氨基酸序列或其片段； (2)与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85%， 90 %，95%，98%，或99%同源的氨基酸序列；C3)由天然发生的哺乳动物IL-21R核苷酸序 列或其片段(例如SEQ ID NO :1(人-对应于GENBANK 登录号NM_021798)或SEQ ID N0:3 (鼠-对应于GENBANK 登录号NM_021887)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少85%，90%，95%， 98%，或99%同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；( 由与天然发生的IL-21R核苷酸序 列或其片段例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3或其片段简并的核苷酸序列编码的氨基酸 序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。 另外，涵盖在所公开的方法中有用的其它非人和非哺乳动物IL-21R。术语“白介素-21 ”或“ IL-21，，指与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性 (Parrish-Novak等Q000) supra)且结合IL-21R的细胞因子。此类细胞因子分享共同的 折叠，折叠成该家族特征性的“四螺旋束”结构。IL-21主要在活化的CD4+ T细胞中表达， 而且据报告对 NK、B 和 T 细胞有效果(Parrish Novak 等(2000) supra ；Kasaian 等(2002) supra)。在IL-21结合至IL-21R时，IL-21R的活化引起例如STAT5或STAT3信号传导 (Ozaki等(2000) supra)。术语“白介素-21”或“ IL-21”还指能够与IL-21R (优选哺乳动 物起源的，例如鼠或人IL-21R)相互作用且具有至少一项下述特征的多肽(优选哺乳动物 起源的，例如鼠或人IL-21)或(在上下文需要时)编码此类多肽的多核苷酸(1)天然发 生的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO :212 (人)所列氨基酸序列或 其片段；(2)与SEQ ID NO :212所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85%，90%， 95%，98%，或99%同源的氨基酸序列；C3)由天然发生的哺乳动物IL-21核苷酸序列或其 片段(例如SEQ ID NO :211 (人)或其片段)编码的氨基酸序列；⑷由与SEQ ID NO :211 所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少85 %，90 %，95 %，98 %，或99 %同源的核苷 酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21核苷酸序列或其片段简并的核苷酸 序列编码的氨基酸序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸序列之一 杂交的核苷酸序列。术语“IL-21R活性”等等(例如“IL-21R的活性”、“IL-21/IL-21R活性”)指因 IL-21R结合而发起或中断的至少一种细胞过程。IL-21R活性包括但不限于(1)与配体 (例如IL-21多肽)相互作用(例如结合)；(2)联合或活化信号转导(也称作“信号传导”， 指响应特定刺激发生的细胞内级联)和信号转导分子(例如伽马链(Yc)和JAK1)，和/或 刺激STAT蛋白质(例如STAT5和/或STAT3)的磷酸化和/或活化；及( 调控免疫细胞 (例如T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)和巨核细胞)的增殖、分化、 效应器细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、和/或存活。如本文中使用的，“体外生成的抗体”指如下的抗体，其中整个或部分可变区(例如 至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片、或能对候选序列 测试它们结合抗原的能力的任何其它方法)中生成的。术语“分离的”指基本上不含其天然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含 细胞材料或来自衍生它的细胞或组织来源的其它蛋白质。该术语还指如下的制备物，其中 分离的蛋白质对于药物组合物是足够纯的，或者至少70-80% (w/w)纯的、至少80-90% (w/ w)纯的、至少 90-95% (w/w)纯的、或至少 95%，96%，97%，98%，99%，或 100% (w/w)纯 的。短语“百分比相同”或“百分比同一性”指至少两种不同序列之间的相似性。此百 分比同一性可通过标准算法来确定，例如Altshul等((1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10)记载的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) ；Needleman 等((1970) J. Mol. Biol. 48 :444-53)的算法；或 Meyers 等((1988) Comput. App 1. Biosci. 4 11-17)的算法。一组参数可以是Blosum 62评分矩阵及缺口罚分12、缺口延伸罚分4、 和移码缺口罚分5。两种氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性还可以使用Meyers和 Miller ((1989) CABIOS 4 :11-17)的算法来确定，该算法已经掺入ALIGN程序(2. O版)，使 用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4。百分比同一性通常通过比较相似 长度的序列来计算。术语“全集(r印ertoire)”指完全或部分地自编码至少一种免疫球蛋白的至少一 种序列衍生的至少一种核苷酸序列。可以通过在体内重排重链的V、D、和J区段及轻链的V 和J区段来生成序列。或者，可以自响应例如体外刺激而发生重排的细胞生成序列。或者， 可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变、或其它方法来获得部分或整个/所有序列(参见例 如美国专利No. 5，565，332)。全集可以只包括一种序列，或者可以包括多种序列，包括遗传 上多样的集合中的多种序列。术语“特异性结合”等等指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异 性结合以高的亲和力和低至中的能力来表征，与通常具有低的亲和力和中至高的能力的非 特异性结合区分开。通常，当结合常数Ka高于约IOl1iT1时，认为结合是特异性的。如果 必要，通过改变结合条件，能降低非特异性结合且基本上不影响特异性结合。熟练技术人员 能使用常规技术来改进适宜的结合条件，诸如结合蛋白的浓度、溶液的离子强度、温度、容 许结合进行的时间、封闭剂(例如血清清蛋白或乳酪蛋白)的浓度、等。本文中列出了例示 性的条件，但是本领域普通技术人员知道的其它条件落在本发明的范围内。如本文中使用的，术语“严格”、“严格性”、等等描述用于杂交和清洗的条件。本发 明的分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物来鉴定和分离具有如下序列的核酸，该序列与 编码所公开的多核苷酸的序列相同或相似。因此，以此方式分离得到的多核苷酸可用于生 成针对IL-21R的结合蛋白或鉴定表达此类结合蛋白的细胞。用于鉴定和分离核酸的杂交 方法包括聚合酶链式反应(PCR) ,Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，而且是本领域 技术人员公知的。可以在具有不同严格性的条件下实施杂交反应。杂交反应的严格性包括任意两个 核酸分子会彼此杂交的难度和它们会保持杂交的条件。优选的是，在低严格性条件、更优选 严格条件、和最优选高严格条件下，每个杂交的多核苷酸杂交至其对应多核苷酸。严格条件 是本领域技术人员知道的，而且可见于例如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)6.3. 1-6.3.6。含水的和不含水的方法均在此文献中有记 载，而且均可使用。严格杂交条件的一个例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45°C 杂交，接着在0. 2X SSC/0. 1% SDS中于50°C清洗至少一次。严格杂交条件还可用在例如 0. 2X SSC/0. SDS中于551、601、或651清洗来实现。高严格条件包括例如在0. 5M磷 酸钠/7% SDS中于65°C杂交，接着在0. 2X SSC/1 % SDS中于65 °C清洗至少一次。严格条 件的其它例子显示于下文表1 高严格条件指至少像例如条件A-F那样严格的条件；严格条 件指至少像例如条件G-L那样严格的条件；而低严格条件指至少像例如条件M-R那样严格 的条件。表1 杂交条件
19
权利要求
1.一种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗原 结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO :14,16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60， 62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108， 110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146， 148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。
2.权利要求1的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是抗体。
3.权利要求1的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是 ScFv0
4.权利要求1的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是VH。
5.权利要求1的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是VL。
6.权利要求1的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是 CDR。
7.一种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗原 结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码的 氨基酸序列:SEQ ID NO :13,15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47， 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97， 99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135， 137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和 247。
8.权利要求7的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是抗体。
9.权利要求7的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段 是 ScFv0
10.权利要求7的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是VH。
11.权利要求7的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是\。
12.权利要求7的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是CDR。
13.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，包含至少一种选自下组的氨基酸序列 SEQ ID NO 14,16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56， 58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104， 106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142， 144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244， 246，和 248。
14.权利要求13的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是抗体。
15.权利要求13的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是scFv。
16.权利要求13的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是VH。
17.权利要求13的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是八。
18.权利要求13的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片 段是CDR。
19.一种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗 原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列SEQ ID NO 6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102， 104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140， 142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和 248，且其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95% 相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10，12，163，164，169，170，194，和195，那么该结合蛋 白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基 酸序列=SEQ ID NO :14,16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102， 104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140， 142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242， 244，246，和 248。
20.一种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗 原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列编码 的氨基酸序列:SEQ ID NO :5,7,9,11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41， 43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91， 93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131， 133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245， 和247，且其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的序列至少约95% 相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID N0:5，7，9，和11，那么该结合蛋白或抗原 结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95%相同的核苷酸序列 编码的氨基酸序列:SEQ ID NO :13,15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43， 45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93， 95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133， 135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和，247。
21.权利要求19的结合蛋白或抗原结合片段，包含至少一种选自下组的氨基酸序列 SEQ ID NO 6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50， 52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100， 102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138， 140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246， 和 248，其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95% 相同的氨基酸序列=SEQ ID NO :6，8，10，12，163，164，169，170，194，和195，那么该结合蛋 白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95%相同的氨基 酸序列=SEQ ID NO :14,16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102， 104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140， 142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165—168，171—193，213—229，240，242， 244，246，和 248。
22.—种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗 原结合片段包含轻链和重链，且其中该重链包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 14,16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和 242。
23.—种结合IL-21R的分离的结合蛋白或其抗原结合片段，其中该结合蛋白或其抗 原结合片段包含轻链和重链，且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，74， 76,78,80,82,84,86,96,98,100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和 248。
24.权利要求22的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含 Vl域和Vh域，且其中该Vh域包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO =14,16,18, 和20。
25.权利要求23的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含 Vl域和Vh域，且其中该VL域包含至少一种选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO =22,24,26, 28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223， 225，227，和 229。
26.权利要求22或23的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述重链包含选自下组的氨基 酸序列=SEQ ID NO :88，90，92，94，213，218，219，240，和对2，且所述轻链包含选自下组的氨 基酸序列:SEQ ID NO :96,98,100，102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244， 246，和 248。
27.一种结合受选自下组的结合蛋白识别的IL-21R表位的分离的结合蛋白或其抗原 结合片段AbA-AbW，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25，其中该结合蛋白或抗原结合片段 竞争性抑制选自下组的结合蛋白对人IL-21R的结合AbA-AbW，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和 L23-L250
28.权利要求27的结合蛋白或抗原结合片段，包含重链、轻链、或Fv片段，所述重链、轻 链、或Fv片段含有选自下组的氨基酸序列=SEQ ID NO 14，16，18，20，22，24，洸，28，30，32，.34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82， 84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124， 126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162， 165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和 248。
29.权利要求27的结合蛋白或抗原结合片段，包含重链、轻链、或Fv片段，所述重链、轻 链、或Fv片段含有由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO 13,15,17,19, 21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69， 71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115， 117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153， 155，157，159，161，239，241，243，245，和 247。
30.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段对人IL-21R的结合常数为至少约IO5M4sA
31.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段以约1.75nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的BaF3细胞增殖，且其中所述BaF3 细胞包含人IL-21R。
32.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段以约14. OnM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的TFl细胞增殖，且其中所述TFl 细胞包含人IL-21R。
33.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段以约1.9nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖，且其中所述 B细胞包含人IL-21R。
34.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段以约1. 5nM或更少的IC5tl抑制IL-21介导的原代人CD4+细胞增殖，且其中所 述CD4+细胞包含人IL-21R。
35.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段特异性结合与SEQ ID NO :2的至少100个连续氨基酸的任何序列至少约95% 相同的氨基酸序列。
36.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段抑制IL-21结合IL-21R。
37.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是IgGl。
38.权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是人的结合蛋白或抗原结合片段。
39.一种药物组合物，其包含权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段。
40.一种分离的核酸，其编码权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段。
41.一种表达载体，其包含权利要求40的核酸。
42.一种宿主细胞，其经权利要求41的载体转化。
43.权利要求42的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、植 物细胞、或昆虫细胞。
44.一种诊断试剂盒，包含权利要求1，2，19，或20任一项的结合蛋白或抗原结合片段。
45.权利要求19-38任一项的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是抗体。
46.权利要求19-38任一项的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是scFv。
47.权利要求19-38任一项的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是VH。
48.权利要求19-38任一项的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是\。
49.权利要求19-38任一项的分离的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或 抗原结合片段是CDR。
全文摘要
本发明提供特异性结合人白介素-21受体(IL-21R)的结合蛋白及其抗原结合片段。该结合蛋白能起例如IL-21R活性拮抗剂的作用，由此调控一般而言的免疫应答，及具体而言的由IL-21R介导的免疫应答。所公开的组合物和方法可以例如在诊断和/或治疗IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、癌症、和其它免疫系统病症中使用。
文档编号C07K16/28GK102105491SQ200980128968
公开日2011年6月22日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月23日
发明者尤利亚·武格梅斯特, 德博拉·A·扬, 戴维·洛, 维亚·瓦尔格-阿彻, 莱尔德·布卢姆, 达文德·吉尔 申请人:医学免疫有限公司, 惠氏有限责任公司