方法

专利名称：：方法
技术领域：
：本发明涉及通过利用酶降解固醇糖苷(sterylglycoside)来降低油或脂(fat)(包括生物燃料底物，如生物柴油底物)和/或生物燃料(包括生物柴油)中的固醇糖苷的量的方法。本发明还涉及通过本发明的方法产生的油或脂(包括生物燃料底物，例如生物柴油底物)或生物燃料(包括生物柴油)。
背景技术：
：最近对能源安全和全球变暖的担忧使得生物燃料作为可再生能源的应用越来越受到关注。生物柴油已经产生15-20年，并且直至最近仍主要在欧洲大多由菜籽油生产。近年，美国生物柴油的生产显著增加。随着美国生物柴油生产的扩大，越来越多量的大豆油(和/或含有不同量(有时为较少量)固醇糖苷的其它油)被用作生产生物柴油的原料。最近意识到由含有固醇糖苷的油制备的生物柴油和生物柴油混合物(biodieselblend)可能带来问题。例如，生物燃料中存在的固醇糖苷可能引起生物燃料中产生沉淀，这是不期望的，因为该沉淀可能引起滤器堵塞和/或导致燃烧该生物燃料的发动机停止。沉淀可以是固醇糖苷沉淀或者也可以是固醇糖苷与生物燃料中的其它成分组合的沉淀。已经提出，固醇糖苷沉淀可加重生物燃料中其它成分的沉淀和/或聚集。固醇糖苷在贮存过程中经过数周可沉淀。因此，虽然新生产的生物柴油可以满足质量标准，但在贮存数周后生物柴油可能不能够通过滤器测试。已经发现，在生物燃料(包括生物柴油)的生产过程中不易除去固醇糖苷。生物柴油生产商已经试图通过额外的过滤步骤或通过离心克服这些难题。W02007/076163涉及利用特定的过滤方法除去固醇糖苷。具体而言，W02007/076163公开了通过添加吸附剂、助滤剂、硼酸、皂(soap)、蔗糖、糖(sugar)、葡萄糖、氯化钠、柠檬酸、硅酸镁、粘土、硅藻土、卵磷脂、颗粒粘土、颗粒葡萄糖、颗粒糖、蛋白、组织化植物蛋白、碳、纤维素、包含硼酸的溶液、硅水凝胶及其组合来除去生物柴油中的固醇糖苷的方法，这些物质声称能够除去生物柴油中的固醇糖苷。这种方法的一个缺点是该方法引入了可能费钱和/或耗时的额外的过滤步骤。通过过滤或离心除去固醇糖苷的另一个缺点是在能够从油中除去固醇糖苷之前可能必需等待固醇糖苷沉淀和/或聚集。本发明旨在克服与生物燃料中存在的固醇糖苷相关的难题。发明概述本发明的各方面体现于权利要求以及以下描述中。令人惊奇地，发现通过使用能够水解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键的酶能够除去油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)中的固醇糖苷，特别地，所述酶可以为本文定义的糖苷酶，例如β-葡糖苷酶和/或淀粉葡糖苷酶。4发明详述本发明第一方面提供了降低油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料中的固醇糖苷的量(或除去固醇糖苷)的方法，所述方法包括将一种或多种酶和包含固醇糖苷的油或脂混合；从而使所述一种或多种酶降解所述固醇糖苷。本发明第二方面提供了一种或多种酶在油或脂(例如生物燃料底物)中用于降低固醇糖苷的量(或除去固醇糖苷)的应用。本发明第三方面提供了通过本发明的方法可获得的(优选获得的)一种或多种油或脂(例如生物燃料底物)或生物燃料。本发明第四方面提供了一种或多种油或脂(例如生物燃料底物)或生物燃料，其中所述油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料的固醇糖苷的量与没有经过本发明的酶处理的相当的(comparable)油或脂相比降低。本发明另一方面提供了用于生产生物燃料的酶组合物，所述酶组合物包含一种或多种能够水解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键的酶，合适地，所述酶组合物包含一种或多种葡糖苷酶，合适地，所述酶组合物包含一种或多种β-葡糖苷酶，合适地，所述酶组合物包含一种或多种淀粉葡糖苷酶。合适地，在本发明方法和/或应用中使用的一种或多种酶可以为以下酶中的一种或多种能够进行糖苷键裂解的酶，尤其是能够进行固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键的裂解的酶，能够进行以下反应的酶；糖苷酶(Ε.C.3.2.1.X)，如β-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶(Ε.C.3.2.1.3)。合适地，用于本发明的一种或多种酶可以为以下酶中的一种或多种能够水解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键的酶。合适地，用于本发明的一种或多种酶可以为以下酶中的一种或多种葡糖苷酶，如β-葡糖苷酶或淀粉葡糖苷酶或具有淀粉葡糖苷酶活性的另外的酶。在一个实施方式中，适合用在本发明中的酶可以为果胶酶GrindamylCa150(可获自DaniscoA/S)。不期望受理论约束，认为GrindamylCa150是除了果胶酶活性之外还具有多种副活性的酶制剂。这些副活性之一可以为葡糖苷酶活性。不期望受理论约束，认为就是这种β-葡糖苷酶副活性使所述酶组合物GrindamylCa150能够水解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键。适合本发明使用的酶可以为淀粉葡糖苷酶AMG8000(可获自DaniscoA/S)。β-谷固醇(豆固-5-烯-3β-醇)在一个实施方式中，淀粉葡糖苷酶或能够进行固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷中的糖苷键的裂解的酶与油或脂肪(例如生物燃料底物)、水和能够进行油或醇的酯交换的酶混合ο在一个实施方式中，合适的油或脂(例如生物燃料底物)可以为生物柴油底物(即适合形成生物柴油的油或脂)。在一个实施方式中，合适的油或脂可以为生物燃料底物(如生物柴油底物)。在另一个实施方式中，合适的油或脂可以为食品工业中使用的油或脂。在再一个实施方式中，可以将从中除去固醇糖苷和/或固醇糖苷含量降低的油或脂用作生物燃料底物和/或可以将其用在食品工业中。在一个实施方式中，油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)可以为植物油或植物脂。在再一个实施方式中，油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)可以为包含固醇糖苷的油或脂(合适地为植物油或植物脂)。在另一个实施方式中，油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)可以为选自以下组成的组的植物油菜籽油、芥花籽油(canolaoil)、大豆油、米糠油、棕榈油、玉米油、棉籽油、向日葵油、红花油、旱金莲籽油(nasturtiumseedoil)、芥菜籽油、橄榄油、芝麻油、花生油、巴巴苏坚果油(babassunutoil)、蓖麻油、棕榈仁油、低芥子酸菜籽油、羽扇豆油(lupinoil)、麻风树油、椰子油、亚麻籽油、月见草油、霍霍巴油、非洲酪脂树坚果油(sheanutoil)或亚麻荠油。在一个实施方式中，优选油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)可以为选自以下组成的组的植物油菜籽油、芥花籽油、大豆油、米糠油、棕榈油、玉米油、棉籽油和向日葵油。在一个实施方式中，合适地，生物燃料可以为生物柴油。在一个实施方式中，合适地，所述方法可以进一步包括脱胶步骤，例如水-脱胶步马聚ο本发明使用的“水-脱胶步骤”通常可以通过将0.5-3%w/w的热水和温(60-900C)原油(crudeoil)混合而进行。通常的处理时间为30-60分钟。所述水-脱胶步骤除去当水合时在油中变得不溶的磷脂和粘胶。所述水合磷脂和胶可以通过沉淀、过滤或离心(离心为最常用的操作)而从油中分离。所述水-脱胶步骤的主要目的是从油中分离水合磷脂。在本发明中上述将热水混合在油中广义应理解为根据本领域标准的水-脱胶方法将含水溶液混入油中。在另一个实施方式中，本发明的方法可以进一步包括酶促脱胶步骤在另一个实施方式中，本发明的方法可以包括其中将水加入到油或脂(如生物燃料底物)中的酶促脱胶步骤。合适地，在酶促脱胶步骤过程中加入的水量可以为油重量的约0.1%-约5%(通常为约2%w/w酶/油)。合适地，在脱胶步骤(例如水脱胶步骤和/或酶促脱胶步骤)之前、过程中和/或之后利用本发明的一种或多种酶减少固醇糖苷的量。换而言之，所述一种或多种酶(如葡糖苷酶，如淀粉葡糖苷酶)与油或脂(如生物燃料底物)的混合发生在脱胶步骤(例如水脱胶步骤和/或酶促脱胶步骤)之前、过程中和/或之后。6在再一个实施方式中，本发明的方法可以包括酯交换步骤。在一个实施方式中，合适地，所述方法可以进一步包括离心步骤。合适地，在离心步骤之前、过程中和/或之后利用本发明的一种或多种酶减少固醇糖苷的量。换而言之，所述一种或多种酶(如葡糖苷酶，如淀粉葡糖苷酶)与油或脂(如生物燃料底物)的混合发生在离心之前、过程中和/或之后。在一个实施方式中，所述方法可以在约30°C_70°C进行，合适地在约40°C_60°C进行，合适地在约45°C-55°C进行，合适地在约50°C进行。合适地，所述方法可以在原油(粗油)上进行。合适地，所述方法可以在将油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)加工成生物燃料(或生物柴油)的过程中，在油或脂(例如生物燃料底物，如生物柴油底物)上进行。在一个实施方式中，合适地，可以在油的精炼过程中将一种或多种酶与油(优选植物油，如生物燃料底物)混合。当油或脂(例如生物燃料底物)经历脱胶步骤时，可以在将水加入到油或脂(例如生物燃料底物)中的脱胶步骤的过程中加入酶。在一个实施方式中，可以在酶促脱胶步骤的过程中加入所述酶。当油或脂(例如生物燃料底物)经历酯交换步骤(可以利用催化油和甲醇之间的酯交换的酶进行该步骤)时，还可以在酶促酯交换步骤过程中将本发明的酶加入到油或脂中。在另一个实施方式中，合适地，可以将一种或多种酶和水与油或脂(优选植物油，如生物燃料底物)混合。在另一个实施方式中，合适地，可以在油进行酶促脱胶步骤的同时将一种或多种酶与所述油或脂(优选植物油，如生物燃料底物)混合，合适地，在所述酶促脱胶步骤中将水加入到油或脂(例如生物燃料底物)中。在另一个实施方式中，合适地，可以在油或脂进行酯交换(优选酶促酯交换)步骤的同时将一种或多种酶与所述油或脂(优选植物油，如生物燃料底物)混合。在一个实施方式中，优选与未经处理的油或脂(例如生物燃料底物)(即相同的油或脂(如生物燃料底物)但未经本发明方法处理)相比，通过本发明的方法可获得(优选获得)的油或脂(例如生物燃料底物)所含的固醇糖苷较少。在一个实施方式中，优选与未经处理的生物燃料(例如生物柴油)(即相同生物燃料但未经本发明方法处理)相比，通过本发明的方法可获得(优选获得)的生物燃料(例如生物柴油)所含的固醇糖苷较少。不期望受理论约束，本发明使用的酶可以通过水解固醇糖苷以形成游离的固醇和糖或酰化糖(取决于固醇糖苷是否被酰化)而除去固醇糖苷。在一些实施方式中，本发明可以包括除去油或脂中形成的任何游离固醇的步骤。例如，可以在进一步加工油或脂的过程中、之前或之后除去游离固醇。当油或脂用在食品工业中时，这可能尤其有益。合适地，本发明的方法和应用除去油或脂(例如生物燃料底物)中的至少20%、50^^80%的固醇糖苷。7测定油或脂(例如生物燃料底物)或生物燃料中的固醇糖苷的量可以通过任何常规方法测定油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料中的固醇糖苷的量。可以通过，例如Phillipsetal.(2005),JournalofFoodLipids,12(2),124-140中描述的固相提取法和气相色谱法测定油或脂中的固醇糖苷量。可以利用标准的滤器堵塞试验，如D2068"StandardTestMethodforFilterBlockingTendencyofDistillateFuelOils”中的ASTM法测定生物柴油的质量。当使用所述标准滤器阻塞试验测定时，根据本发明除去固醇糖苷的生物柴油的质量好于相当的对照生物柴油(与本发明的相同，只是不经历本发明的方法)。当指油或脂(例如生物燃料底物)中和/或生物燃料中的固醇糖苷量“减少”或“降低”时，术语“减少”或“降低”表示与相当的油或脂(例如生物燃料底物)或生物燃料(除了没有加入本发明的酶外，其与所请求保护的生物燃料底物或生物燃料相同)相比。优点本发明提供了用于除去油和脂(尤其是用作生物燃料底物或在食品工业中使用的油或脂)和/或生物燃料(如生物柴油)中的固醇糖苷的简便且成本合算的方法。本发明的一个优点是可以在固醇糖苷沉淀前除去油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料(如生物柴油)中的固醇糖苷。本发明的另一个优点是可以在加工过程中除去油或脂(例如生物燃料底物)中的固醇糖苷。本发明的另一个优点是无需为了除去油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料(如生物柴油)中的固醇糖苷而进行离心或过滤步骤。本发明的再一个优点是其是有效除去油或脂(例如生物燃料底物和/或食物油或脂)和/或生物燃料中的固醇糖苷的方法。本发明的再一个优点是不需要用于除去油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料(如生物柴油)中的固醇糖苷的专门的或昂贵的离心或过滤设备。本发明的另一个优点是产生的生物燃料(尤其是生物柴油)即使在贮存(如贮存数周)后仍能够通过“滤器阻塞试验”。固醇糖苷固醇糖苷由与一个固醇分子的羟基相连的一个碳水化合物单元组成。所述固醇部分可以为菜油固醇、豆固醇、谷固醇、菜子固醇和二氢谷固醇。所述糖部分可以由葡萄糖，木糖，甚至是阿拉伯糖(Graminae)组成。当所述糖部分为葡萄糖时，固醇糖苷可以指固醇葡糖苷(sterylglucoside)0在本发明中，术语固醇糖苷意在涵盖固醇葡糖苷。在一个实施方式中，所述固醇糖苷为固醇葡糖苷。所述糖部分可以通过糖苷键与固醇部分连接。所述糖部分可以在碳6位置被酰化。固醇糖苷以酰化和未酰化形式天然存在于油和脂(尤其是植物油和脂)中。当为酰化形式时，其极易溶于油。在本发明中，术语“固醇糖苷”表示酰化和未酰化的固醇糖苷两者。类似地，本发明使用的术语“固醇葡糖苷”表示酰化和未酰化的固醇葡糖苷两者。在用于将油或脂(例如生物燃料底物)转化成生物燃料(例如生物柴油)的步骤的过程中，酰化固醇糖苷被转化成未酰化固醇糖苷，而未酰化固醇糖苷的熔点高且较不易溶于生物柴油或柴油燃料混合物中。固醇糖苷(例如固醇葡糖苷)能够沉淀，以在燃料中形成分散的细固体颗粒，该细固体颗粒通过简单加热不能通过堵塞的燃料滤器。这些颗粒还可促进其它燃料组分的结晶，这可恶化冷结晶组分(如单甘油酯)的问题。固醇糖苷可以在任何温度下(不仅仅在冷温度下)形成聚集物。固醇糖苷在生物燃料中的水平即使很低(例如10-90ppm)也可以形成聚集物。固醇糖苷具有约240°C的高熔点，因此不能简单地通过熔解除去包含固醇糖苷的聚集物。植物原油中固醇糖苷的量是可变的。大豆原油中固醇糖苷的量高于通常用于制造生物燃料的其它一些油，如菜籽油、玉米油、棉油或向日葵油。仅作为示例，将不同植物油中存在的固醇糖苷的水平示于下表植物油固醇糖苷的水平(ppm)大豆油2300玉米油500向曰葵油300生物燃料在本发明中将生物燃料(还可以指农作物燃料(agrofuel或agrifuel))宽泛地定义为包含或源自最近死亡的生物材料(最常见的是植物)的固体、液体或气体燃料。这使其与源自死亡时间很长的生物材料的石油燃料不同。理论上，可以由任意(生物)碳源产生生物燃料。目前最常见的是捕获太阳能的光合植物。多种不同的植物和源自植物的物质都可用于生产生物燃料。全球都在使用生物燃料，且生物燃料工业正在欧洲、亚洲和美洲扩大。最常使用的生物燃料为用于汽车运输的液体燃料。可再生生物燃料的使用降低了对石油的依赖性，并增强了能源安全。在一个实施方式中，优选地，本发明教导的生物燃料为液体燃料。所述生物燃料优选用于运输的液体生物燃料。在一个实施方式中，优选地，所述生物燃料为生物柴油。油或脂合适地，油或脂可以为植物油或脂或经加工的植物油或脂。合适地，用于本发明的油或脂(优选植物油或脂)可以为包含固醇糖苷的任意油或脂(优选植物油或脂)。在一个实施方式中，所述油或脂为包含至少IOppm固醇糖苷的油或脂。用于本发明的植物油或脂可以选自由以下组成的组中的一种或多种菜籽油、芥花籽油、大豆油、米糠油、棕榈油、玉米油、棉籽油、向日葵油、红花油、旱金莲籽油、芥菜籽油、橄榄油、芝麻油、花生油、巴巴苏坚果油、蓖麻油、棕榈仁油、低芥子酸菜籽油、羽扇豆油、麻风树油、椰子油、亚麻籽油、月见草油、霍霍巴油、非洲酪脂树坚果油或亚麻荠油。用于本发明的植物油或脂可以选自由以下组成的组中的一种或多种菜籽油、大豆油(也称为豆油)、向日葵油、芥花籽油、棕榈油、米糠油、棉油和玉米油。在一个实施方式中，优选地，所述植物油为大豆油。在一个实施方式中，优选地，所述油可以为源自藻类的油。在一个实施方式中，所述油或脂(优选植物油或脂)适合用于生产生物燃料，如生物柴油，并由此被分别认为是“生物燃料底物”或“生物柴油底物”。在一些实施方式中，所述油或脂可以为动物脂和/或油。所述油或脂可以为原油或者可以为经加工的油。本发明使用的术语“经加工的油”表示已经经过一些形式的加工(例如精炼、漂白、脱胶、酯交换和/或除臭)的油。在一些实施方式中，所述油或脂可以为氢化油、油或脂衍生物，或者油或脂的一部分。在一个实施方式中，优选地，所述油或脂为原油(优选为植物原油)和/或经加工的油(优选经加工的植物油)。在一个实施方式中，优选地，所述油或脂用于生产生物燃料，并由此被认为是生物燃料底物，合适地为生物柴油底物。在另一个实施方式中，所述油或脂可用于生产用于食品工业的食用油或脂，在这种情况下，所述油或脂被认为是可食用的油或脂。生物燃料底物本发明使用的生物燃料底物表示可以被转化成生物燃料(优选液体生物燃料)的任何物质。合适地，所述生物燃料底物为最近死亡的生物物质，最常见的为植物。在一个实施方式中，优选地，所述生物燃料底物为油或脂。生物柴油生物柴油与常规的石油柴油类似，但其由植物或动物脂和油产生。目前生物柴油越来越受欢迎，原因是其被作为对环境的损害可能比化石燃料小的可再生的碳中性燃料。生物柴油可以被用作用于柴油发动机的石油柴油的替代燃料，并且通常被用作石油柴油的添加物。纯生物柴油被分类为B100，但其经常与石油柴油混合，由此含20%生物柴油的柴油为B20。多数生物柴油通常在催化剂的存在下，由三甘油酯(如油和/或脂)和醇的酯交换产生，从而形成酯和甘油。所述催化剂通常为氢氧化钠或氢氧化钾。由于甲醇和乙醇是商业生物柴油生产中最常用的醇，商业生产的多数生物柴油都包含脂肪酸的甲酯或乙酯。生物柴油为生物燃料，并且其化学名称为脂肪酸甲(或乙)酯(FAME)。在一个实施方式中，所述生物柴油可以为由混合有石油柴油的植物和/或动物脂或油生产的生物柴油。在一个实施方式中，优选地，本发明所指的所述生物燃料为生物柴油。食物在一个实施方式中，所述油或脂可以被用作食物，或用在食物的制备中。在本发明10中使用的术语“食物”具有宽泛的含义且涵盖人用食物和动物用食物(即饲料)。在优选方面，所述食物用于人消费。所述食物可以为溶液或固体的形式，这取决于应用和/或使用的形式和/或施用的形式。—方面，根据本发明制备的油或脂可以用于选自以下一种或多种的食品中蛋，基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱、沙拉调料、沙司、冰淇淋、改良的蛋黄和由其制造的产品；焙烤食品，包括面包、蛋糕、甜面团产品(sweetdoughproduct)、叠层面团产品(laminateddough)、液态奶蛋糊、松饼、炸面圈、饼干、薄脆饼干和曲奇饼；糖果，包括巧克力、冰糖、焦糖、halawa、口香糖(包括不含糖的口香糖和加糖变甜的口香糖，泡泡糖、软泡泡糖、橡皮糖和布丁；冷冻产品，包括果汁冰糕，优选冷冻乳制品，包括冰淇淋和牛奶冻；乳制品，包括干酪、黄油、乳、咖啡奶精、生奶油、乳蛋糕乳脂、乳饮料和酸乳酪；幕斯、搅打植物奶油(whippedvegetablecream)；食用油和脂、搅打起泡和不起泡的产品、水包油乳液、油包水乳液、人造黄油、起酥油和涂抹食品(spreads)，包括低脂和超低脂涂抹食品；调味品、蛋黄酱、蘸酱、基于奶油的沙司、基于奶油的汤、饮料、调味乳液和沙司。在一个实施方式中，所述油或脂可以为食用油或脂、搅打起泡和不起泡的产品、水包油乳液、油包水乳液、人造黄油、起酥油和涂抹食品(spreads)，包括低脂和超低脂涂抹食PΡΠO食品组分可以将本发明的组合物用作食品组分。本发明使用的术语“食物组分”包括可以加入到食品中或者为食品的制品。本发明使用的术语食品组分还指能够以低水平用在需要乳化、凝胶化、组织化(texturising)、稳定化、悬浮、成膜和结构化、保持多汁并改善口感的多种产品中的制品。所述食品组分可以是液体或固体的形式，这取决于应用和/或使用的形式和/或施用的形式。本发明的酶本发明的酶是指能够切断固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷的糖苷键的酶。在一个实施方式中，所述酶可以被称为“糖苷酶”。本发明使用的术语“糖苷酶”可以指能够裂解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷的糖苷键的酶，优选在以下教导的测试条件下(使用固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷底物)能够切断固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷的糖苷键的酶。如果在以下教导的测试条件下，糖苷酶水解固醇糖苷底物中的固醇糖苷，则糖苷酶被认为是适合本发明使用的酶((如糖苷酶)。禾艮据本发日月测丨定Sl是否裂解固酉享_苷禾Π/或酰化固酉苷键的实验利用以下步骤制备固醇糖苷底物(可以为酰化的或未酰化的)在7ml微量玻璃瓶(dramglass)中称量1.Omg固醇糖苷；加入10μ199%的乙醇；加入200μ150mMHEPES缓冲液，pH7；加入含0.4%TritonXlOO的300μ1IOmMHEPES缓冲液。通过在40°C搅动30分钟分散固醇糖苷。利用感兴趣的酶按照以下方法处理5Χ100μ1固醇糖苷底物样品。表1样品号12_固醇糖苷底物μ100100/Kμ110感兴趣的酶μ10将100μ1固醇糖苷底物转移到Eppendorf试管中并置于40°C的振荡孵箱中。加入酶或水，并将反应混合物在40°C温育16小时。利用Iml氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。将样品重新溶解在200μ1氯仿甲醇O1)中，然后通过HPTLC分析(按照实施例1中的教导)。为了证明固醇的形成，还可以利用植物固醇为对照物，通过GLC(按照实施例1中的教导)分析样品。利用感兴趣的酶处理固醇糖苷时由固醇糖苷形成的游离固醇证实了所述酶能够裂解固醇糖苷和/或酰化固醇糖苷的糖苷键，并且能够用在本发明中。在本发明的一个实施方式中，所述酶能够裂解(或者可以裂解)固醇葡糖苷和/或酰化固醇葡糖苷的糖苷键。在一个实施方式中，所述酶可以为“葡糖苷酶”。本发明使用的术语“葡糖苷酶”可以表示优选在以下教导的试验条件下，能够裂解固醇葡糖苷和/或酰化固醇葡糖苷中的糖苷键的酶。禾艮据本发日月测丨定Sl是否裂解固醇苷禾Π/或酰化固酉享葡_苷苷键的实利用以下步骤制备固醇葡糖苷底物(其可以为酰化的或未酰化的)，例如来自Matreya,Pennsylvania的固醇葡糖苷98%在7ml微量玻璃瓶(dramglass)中称量1.Omg固醇葡糖苷；加入10μ199%的乙醇；加入200μ150mMHEPES缓冲液，pH7；加入含0.4%TritonX100的300μ1IOmMHEPES缓冲液。通过在40°C搅拌30分钟分散固醇葡糖苷。利用感兴趣的酶按照以下方法处理5Χ100μ1固醇葡糖苷底物的样品。表1样品号12_固醇葡糖苷底物μ100100/Kμ110感兴趣的酶μ10将100μ1固醇葡糖苷底物转移到Eppendorf试管中并置于40°C的振荡孵箱中。加入酶或水，并将反应混合物在40°C温育16小时。利用Iml氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。12将样品重新溶解在200μ1氯仿甲醇O1)中，然后通过HPTLC分析(按照实施例1中的教导)。为了证实固醇的形成，还可以利用植物固醇为对照物，通过GLC(按照实施例1中的教导)分析样品。利用感兴趣的酶处理固醇葡糖苷时由固醇葡糖苷形成的游离固醇证实了所述酶能够裂解固醇葡糖苷和/或酰化固醇葡糖苷的糖苷键，并且能够用在本发明中。在一个实施方式中，本发明使用的“糖苷酶”包括“葡糖苷酶”。本发明使用的术语“葡糖苷酶”表示能够进行以下反应(其中固醇葡糖苷为酰化或未酰化的形式)的酶在一个实施方式中，合适地，所述酶可以为葡糖苷酶。在一个实施方式中，所述酶可以为糖苷酶(如葡糖苷酶)或淀粉葡糖苷酶。在一个实施方式中，用于本发明的酶可以为β-糖苷酶(如β-葡糖苷酶)。合适地，如果所述酶为β-糖苷酶(如β-葡糖苷酶)，则所述酶可以为以下酶中的一种或多种固醇基-β-葡糖苷酶(Ε.C.3.2.1.104)；1，3-β-葡糖苷酶(Ε.C.3.2.1.58)和/或葡聚糖1，4β-葡糖苷酶(Ε.C.3.2.1.74)。在另一个实施方式中，所述糖苷酶为淀粉葡糖苷酶(Ε.C.3.2.1.3(根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会在1992年酶的命名和分类会议上的建议的酶命名法))。淀粉葡糖苷酶(EC.3.2.1.3)是高果糖玉米糖浆(HFCS)制造商使用的一种重要的工业用酶。在本发明中，淀粉葡糖苷酶还可以指葡聚糖1，4-α-葡糖苷。用于本发明的酶可以水解液化淀粉中的1，4-α键和1，6_α键和/或β-键。在利用例如淀粉葡糖苷酶水解的过程中，以逐步的方式将葡萄糖单元从底物分子的非还原末端除去。水解速度取决于键的类型以及链长度，即水解1，4_α键比水解1，6_α键容易，并且麦芽三糖和麦芽糖的断裂速度小于更长链的寡糖。作为用于本发明的酶的主要活性或副活性，其可以裂解固醇糖苷的糖苷键。用于本发明的一个合适的酶可以为真菌的淀粉葡糖苷酶，如可获自(获自)真菌黑曲霉(Aspergillusniger)菌株的淀粉葡糖苷酶。适合本发明应用的酶可以为天然存在的(和任选分离的)酶或经过基因修饰的酶。糖苷酶(或适合本发明应用的酶)的最佳pH可以为约3.0-约7.0，优选约4.0-7.0，最佳温度为约55°C-约80°C，合适地为约75°C。β-谷固醇(豆固-5-烯-30-醇)在一个实施方式中，合适的淀粉葡糖苷酶可以为AMG8000(可获自DaniscoA/S-Denmark)0一些酶组合物(例如果胶酶组合物固体GrindamylCal50)可以具有糖苷酶活性(即能够裂解固醇糖苷的糖苷键)。此类酶组合物的糖苷酶活性可以为副活性(次于主要(在此处为果胶酶)活性的活性)。因此，在一个实施方式中，合适地，具有糖苷酶活性(即能够裂解固醇糖苷的糖苷键)的酶可以为果胶酶组合物。在一个实施方式中，所述具有糖苷酶活性的果胶酶可以为GrindamylCa150。所述用于本发明的酶(例如葡糖苷酶)可以以每千克油约0.Img-约50mg酶蛋白的剂量用于本发明，优选以每千克油约Img-约IOmg酶蛋白的剂量用于本发明。脱胶食用油精炼的目的是除去影响质量(例如味道、气味和外观)和耐储性的不期望的杂质。由于所述杂质(游离脂肪酸、金属离子、颜色化合物、香料、胶等)的多样性，通常采用一系列的化学和物理性质的工艺进行精炼。传统使用两种工艺用于油的脱胶，即物理脱胶工艺和化学脱胶工艺。在所谓的化学精炼中，通过利用大大过量的NaOH进行初始处理除去几乎所有的游离脂肪酸量。同时，磷脂的含量也降低至通常低于IOppm的磷水平。随后对油进行漂白和除臭。所谓的物理精炼通常由水脱胶步骤和随后的酸脱胶、中和、漂白、汽提(以除去游离脂肪酸和除臭)组成。与在物理精炼过程中使用酸脱胶不同，开发了使用酶促脱胶。所述酶促脱胶步骤是基于使用胰磷脂酶而开发的。由于该酶是不洁净的(non-kosher)，因此磷脂酶最终被微生物磷脂酶Al(LecitaseUltra-Novozymes,Denmark)代替(OilMillGazetteer,Vol111July2005pp2_4)。所述酶促步骤与所述化学或物理脱胶步骤相比具有几个优点，包括节省成本、产率高和对环境更加友好。所述酶促油脱胶步骤基于向已进行水脱胶的油中添加磷脂酶。在W02006/008508中教导了脂质酰基基转移酶在食用油的酶促脱胶中的应用。WO2006/008508教导了向水脱胶的油中添加脂质酰基基转移酶或者向原油中添加脂质酰基基转移酶而无需使油经历水脱胶步骤。“水脱胶的油”通常可以通过常规的“水脱胶步骤”而获得，该步骤包括将1-2%w/w的热软水和温(70°C-90°C)原油(A0CS对脂和油的加工的介绍-表8-脱胶步骤-http//www,aocs.orR/meetinRs/education/mod3sample.pdf)。经验规贝Ij是向原油中力口入的水量通常约等于原油中的磷脂量。通常的处理时间为30-60分钟。所述水脱胶步骤除去了在水合时在油中变得不溶的磷脂和粘胶。所述水合磷脂和胶可以通过沉淀、过滤或离心(离心为更常用的操作)而从油中分离。所述水-脱胶步骤的主要目的是从油中分离水合磷脂。上述将热水混合在油中在本发明中应被广义理解为根据本领域标准的水-脱胶方法将含水溶液混合入油中。传统的水脱胶步骤中将磷脂的主要部分去除在重的胶相中。在水脱胶步骤结束时，将油相与胶相分离。胶相虽然可以进一步加工成商品，但其主要被视为油精炼的副产品(bi-product)0具有商业重要性的是油相。然而，由于磷脂可以为良好的乳化剂，因此在水脱胶过程中不可避免地损失一些油。本发明(例如添加一种或多种酶以除去固醇糖苷)可以与脱胶(例如化学脱胶、水脱胶或酶促脱胶)组合使用。为除去固醇糖苷所添加的所述一种或多种酶可以在脱胶步骤前、过程中或之后加入。与其它酶的组合合适地，本发明使用的酶(例如糖苷酶)可以与另外的酶组合使用。在一个实施方式中，合适地，本发明使用的酶(例如糖苷酶)可以与以下酶中的一种或多种组合使用具有脂质酰基转移酶活性的酶(E.C.2.3.1.4；具有糖脂酶(glycolipase)活性的酶(E.C.3.1.1.26)，具有磷脂酶A2活性的酶(E.C.3.1.1.4)，具有磷脂酶Al活性的酶(E.C.3.1.1.32)。合适地，具有这些活性的酶是本领域熟知的，例如包括以下脂肪酶磷脂酶AlLECITASEULTRA(NovozymesA/S,Denmark)，磷脂酶A2(例如磷脂酶A2，来自Biocatalysts的LIP0M0D22L,来自Genencor的LIP0MAX和LysoMaxPLA2)，LIPOLASE(NovozymesA/S,Denmark)。在一些实施方式中，将用于本发明的酶(例如糖苷酶)和脂质酰基转移酶和/或磷脂酶(如磷脂酶Al、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)组合可能是有益的。分离一方面，本发明使用的酶为回收的/分离的酶。因此，所述酶可以是分离的形式。术语“分离的”表示序列或蛋白至少基本不含至少一种其它组分，其中所述序列或蛋白与所述其它组分本质上天然相关且天然存在。纯化一方面，本发明使用的酶可以为纯化的形式。术语“纯化的”表示所述序列处于相对纯的状态，例如至少约51%的纯度，或者至少约75%，或者至少约80%，或者至少约90%的纯度，或者至少约95%的纯度或者至少约98%的纯度。下文将仅以示例的方式参考以下附图和实施例对本发明进行描述。图1表示与1)水、2)GrindamylCa150,3)AMG8000(DaniscoA/S)—起温育的固醇糖苷(SG)的HPTLC结果。实施例1利用酶除去/降解固醇糖苷材料固醇葡糖苷，98%，来自Matreya，Pennsylvania。酶果胶酶GrindamylCal50(货号1222616)淀粉葡糖苷酶AMG8000(货号1205013)HPTLC点样器(Applicator)CAMAG点样器AST4。HPTLC板20XIOcm(Merckno.1.05641)使用前通过将色谱板在烤箱中于160°C干燥20-30分钟活化色谱板。点样使用AST4点样器将8.0μ1溶解在氯仿甲醇O1)的萃取脂质加到HPTLC板上。还向HPTLC板上加入0.1μ1、0·3μ1、0·5μ1、0·8μ1、1.5μ1已知浓度的标准组分的标准溶液。运行缓冲液1:Ρ-醚甲基叔丁醚(MTBE)乙酸(50501)点样/洗脱时间12分钟运行缓冲液4氯仿甲醇水(65254)展开7cm，利用自动展开室ADC2。衍生化液体(Derivatizationfluid)含6%乙酸铜的16%H3PO4洗脱后，将色谱板在烤箱于160°C干燥10分钟，冷却并浸入显色液体中，然后在160°C再干燥5分钟。通过视觉评价色谱板。GLC分析PerkinElmerAutosystem9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱12.5mX0.25mmIDXO.1μ膜厚度5%苯甲基硅酮(phenyl-methyl-silicone)(CPSil8CB来自Chrompack)。载气氦注射器PSSI冷分流注射(最初温度50°C加热到385°C)，体积1.0μ1检测器FID:395°C炉程序(自2003年10月30日开始使用)123炉温度，V.90280350等温线，时间，分钟.1010温度比，°C/min.154样品制备将萃取的样品溶解于含有0.5mg/ml内标十七烷的0.5ml庚烷吡啶(21)中。将300μ1的样品溶液移到钳口瓶(crimpvial)中，添加300μIMSTFA(N-甲基N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))，60°C反应20分钟。计算通过纯化的参考物质确定固醇的反应因子。方法和结果利用以下步骤制备固醇葡糖苷底物在7ml微量玻璃瓶中称量1.Omg固醇葡糖苷；加入10μ199%的乙醇；加入200μ150mMHEPES缓冲液，pH7；加入含0.4%TritonX100的300μ1IOmMHEPES缓冲液。通过在40°C搅拌30分钟分散固醇葡糖苷。利用表1列出的多种酶按照以下方法处理5X100μ1固醇葡糖苷底物的样品。表116样品号_固醇葡糖苷底物水GrindamylCa150AMG8000，10%，在水中μμ1100100100μ110将100μ1固醇葡糖苷底物转移到Eppendorf试管中并置于40°C的振荡孵箱中。加入酶或水，并将反应混合物在40°C温育16小时。利用Iml氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。将样品重新溶解在200μ1氯仿甲醇O1)中，然后通过HPTLC分析。TLC板的图示于图1。图1的TLC色谱表明，果胶酶(GrindamylCa150)和淀粉葡糖苷酶(AMG8000)能够产生保留时间与固醇相等的组分，这表明这些酶将固醇葡糖苷降解。为了证实固醇的形成，还利用植物固醇为对照物质通过GLC对样品进行分析。GLC分析证实了游离固醇的形成，结果示于表2。表2固醇的GLC分析(基于固醇葡糖苷的量的百分数)样品号酶处理固醇(％)GLC分析结果(表幻证实了利用果胶酶或淀粉葡糖苷酶处理固醇葡糖苷时由固醇葡糖苷形成游离固醇。上面说明书中提及的所有公开的内容包含在本文中作为参考。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，本发明方法和系统的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说是清楚的。尽管根据优选的具体实施方案对本发明进行了描述，但是应理解，本发明权利要求保护的范围不应该过度限于这些特殊的具体实施方案。事实上，对于生物化学领域和生物工程学领域或相关领域的普通技术人员是显而易见的实现发明的所述方式的各种修饰都意图包含在权利要求的保护范围内。权利要求1.降低油或脂和/或生物燃料中的固醇糖苷的量的方法，所述方法包括将一种或多种酶和包含固醇糖苷的油或脂混合；从而使所述一种或多种酶降解所述固醇糖苷。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种酶包括糖苷酶。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述一种或多种酶包括淀粉葡糖苷酶和/或β-葡糖苷酶。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述油为植物油。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述油选自菜籽油、芥花籽油、大豆油、米糠油、棕榈油、玉米油、棉籽油、向日葵油、红花油、旱金莲籽油、芥菜籽油、橄榄油、芝麻油、花生油、巴巴苏坚果油、蓖麻油、棕榈仁油、低芥子酸菜籽油、羽扇豆油、麻风树油、椰子油、亚麻籽油、月见草油、霍霍巴油、非洲酪脂树坚果油或亚麻荠油。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物燃料为生物柴油。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括脱胶(优选酶促脱胶)步骤。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述固醇糖苷在所述脱胶步骤之前、过程中或之后被降解。9.如权利要求7或8所述的方法，其中，在脱胶步骤过程中将所述一种或多种酶与所述油或脂混合。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括酯交换(优选酶促酯交换)步骤。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括离心步骤。12.—种或多种酶在油或脂中用于降低固醇糖苷的量的应用。13.如权利要求12所述的应用，其中，至少除去所述油或脂中的20%、50%、80%的固醇糖苷。14.如权利要求12或13所述的应用，其中，所述一种或多种酶包括糖苷酶。15.如权利要求12-14中任一项所述的应用，其中，所述一种或多种酶包括淀粉葡糖苷酶和/或β-葡糖苷酶。16.如权利要求11-14中任一项所述的应用，其中，所述油为植物油。17.如权利要求16所述的应用，其中，所述油为大豆油。18.如权利要求12-17中任一项所述的应用，其中，所述生物燃料为生物柴油。19.通过权利要求1-11中任一项所述的方法或者权利要求12-18中任一项所述的应用可获得(优选获得)的油或脂或生物燃料。20.油或脂或生物燃料，其中，所述油或脂和/或生物燃料与没有经过根据权利要求1-21中任一项所述的方法或者权利要求12-18中任一项所述的应用的酶处理的相当的油或脂和/或生物燃料相比，具有降低的固醇糖苷量。21.包含一种或多种糖苷酶的酶组合物，其用于生产生物燃料。22.参考实施例和附图基本如本文定义的方法。23.参考实施例和附图基本如由本文定义的应用。24.参考实施例和附图基本如本文定义的油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料。25.酶组合物，其包含一种或多种参考实施例和附图基本如本文定义的以下酶能够水解固醇糖苷中糖苷键的酶、糖苷酶、β-葡糖苷酶或淀粉葡糖苷酶。全文摘要本发明涉及降低油或脂(例如生物燃料底物)和/或生物燃料中的固醇糖苷的量的方法，所述方法包括将一种或多种酶和包含固醇糖苷的油或脂混合；从而使所述一种或多种酶降解所述固醇糖苷。所述一种或多种酶优选是能够水解固醇糖苷中的糖苷键的酶。合适地，所述酶可以为糖苷酶和/或β-葡糖苷酶和/或淀粉葡糖苷酶。文档编号C07J17/00GK102083995SQ200980125292公开日2011年6月1日申请日期2009年7月8日优先权日2008年7月9日发明者约恩·博尔奇·瑟申请人:丹尼斯科公司