专利名称：免疫结合剂的溶解性优化的利记博彩app
免疫结合剂的溶解性优化相关申请本申请要求于2008年6月25日提交的、名称为“SolubilityOptimization of Immunobinders” 的 US 61/075，692 的优先权。
背景技术：
已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗 剂。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增 加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fc效应子功能的不存在、和由较短的 全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它 们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗 体更容易产生。一个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构 域与重链可变结构域(Vh)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的 可变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立 的重组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致 蛋白质的弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性。例如，Nieba, L.等人(Prot. Eng. (1997) 10 =435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变 的scFv在细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未 显著改变。此外，在他们的公开物中，他们明确地陈述，他们未观察到改造的scFv的天然蛋 白质状态的任何溶解性的提高，如通过PEG沉淀法所测定的。其中对scFv内的特定氨基酸 残基进行定点诱变的其他研究也已得到报告(参见例如，Tan，P. H.等人(1988)Biophys. J. 75:1473-1482 ；Worn，Α.和 Pluckthun, Α. (1998)Biochem. 37 :13120-13127 ；Worn，Α.和 Pluckthun，A. (1999) Biochem. 38 :8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸 残基基于其在scFv结构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区(OTR)移植到已证实具有 有利性质的 scFv 的构架区内(Jung, S.和 Pluckthun, Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)。 所得到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。改造scFv以改善溶解性和其他功能性质中的进展在例如Worn，A.和Pluckthun， A. O001)J.Mol. Biol. 305 :989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计免疫结合剂 (immunobinder)，特别是具有优良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他 类型的抗体从而赋予改善的溶解性一尤其是天然蛋白质的溶解性的方法。发明概述本发明提供了在可变重链区VH中包含溶解性增强基序的免疫结合剂以及改造免 疫结合剂例如scFv抗体以赋予改善的溶解性的方法。在特定的实施方案中，本发明的方法 包括用赋予改善的溶解性的优选氨基酸残基置换免疫结合剂的重链可变区和/或轻链可 变区的序列内的对于溶解性潜在有问题的氨基酸。例如，在某些优选实施方案中，用亲水性残基置换疏水性残基。优选地，提供的免疫结合剂，在本发明的改造方法中使用的或由本发明的改造方 法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域 抗体(例如Dab)和纳米抗体(Nanobody)也可以根据所述方法进行改造。本发明还包括 根据改造方法制备的免疫结合剂，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合 物。在一个方面，本发明提供了免疫结合剂，所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、 103和144 (AHo编号)中包含下列溶解性增强基序之一(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸⑶；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸⑶；和(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸⑴；或(al)重链氨基酸位置12处的丝氨酸⑶；(bl)重链氨基酸位置103处的苏氨酸⑴；和(cl)重链氨基酸位置144处的丝氨酸⑶；或(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸⑶；(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸⑴；和(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或(a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸⑶；和(c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸⑶。在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，免疫结合剂包含(i)重链 可变区或其片段，其中重链可变区包含Vh构架残基和/或(ii)轻链可变区或其片段，其中 轻链可变区包含\构架残基，所述方法包括A)选择Vh构架残基、\构架残基或Vh和\构架残基中的至少两个氨基酸位置以 用于突变；和B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，其中，如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置在Vh构架残基中，那么置换 在选自12、103和144(根据AHo编号约定)的一个或多个重链氨基酸位置上，和/或其中，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在\构架残基中，那么置换在 选自15、52和147(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和 106)的轻链氨基酸位置上。在下文中进一步详细描述选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置以及在选择 的位置处插入的氨基酸残基。下文中所示的氨基酸位置编号使用AHo编号系统；使用Kabat 编号系统的相应位置在本文中进一步描述，并且AHo和Kabat编号系统的转换表在下文的 发明详述中阐述。使用标准单字母缩写代码阐述氨基酸残基。令人惊讶地发现，在指定的位置上指定的突变的存在增加了免疫结合剂的总体溶 解性而不对蛋白质的其他功能性质产生负面影响。例如，在scFv的VH中3个增强溶解性 的突变V12S、L144S和V103T组合的情况下，发现所述置换占整个scFv的溶解性的约60%。 这与现有技术中陈述的增加免疫结合剂的表达产量的尝试不同。例如，US 6，815，540描述通过减少链内结构域间界面区域中的疏水性对免疫结合剂进行改进。为了所述目的，鉴定 了重链可变构架中的16个位置，所述位置可单独地用选自10个氨基酸的一个或多个氨基 酸置换。发现产生的突变体的表达产量增加。此外，相同的研究组于1999年，即所提及的 美国专利的优先权日期后3年，发表了论文(参见Jung，S.，Honegger, A.和Pluckthun， Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)，该论文陈述，已在几个研究中报导用更加亲水的残基置 换疏水性表面残基提高了产量。根据该作者，产量的增加归因于正确折叠与错误折叠材料 的聚集之间的改善的动力学分配，同时天然蛋白质的溶解性不受影响，其热力学稳定性也 未受到显著影响。因此，对于本领域技术人员来说很显然的是，PlUckthim等人所提及的溶 解性参数只涉及可溶性表达而非天然蛋白质的总体溶解性。附图概述当考虑本文的下列详细描述时，本发明将得到更好的理解，并且除上文所述的那 些外的目的将变得显然。此类描述参考附图，其中
图1描述了野生型ESBA105 (E105)和其溶解性变体的PEG沉淀溶解性曲线。图2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性变体的热变性曲线图，如在广泛温 度范围Q5-96°C )下的热攻击后测量的。图3描述了 SDS-PAGE凝胶，其显示了在热胁迫条件下温育2周后各种ESBA105溶 解性突变体的降解行为。图4描述了 EP43max和其优化的变体的热变性曲线，如通过FIlR分析测定的。图5描述了 578min-max和578min_max_DHP的热稳定性，如通过FT-IR测量的。图6a和6b说明了通过硫酸铵沉淀测量的578min_max和578min_max_DHP的溶解性。发明详述本发明涉及用于增加免疫结合剂的溶解性的方法。更具体地，本发明公开了通过 在免疫结合剂中引入改善免疫结合剂的溶解性的氨基酸置换来优化免疫结合剂的方法。本 发明还涉及根据本发明的方法产生的经改造的免疫结合剂例如scFv。为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。除非另外指出，本文中使用的所 有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然 与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下 面描述了适当的方法和材料。本文中提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考资料以 它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外， 材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。本文中使用的术语“抗体”是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是 完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结 构域，Fv (Skerra A.和 Pluckthun，Α. (1988) Science 240 :1038-41)、scFv (Bird, R. Ε.等 人(1988) Science 242 :423-26 ；Huston, J. S.等人(1988 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-83), Fab, (Fab' ) 2、或本领域技术人员熟知的其他片段。本文中使用的术语“抗体构架(antibody framework) ”或“构架”是指可变结构 域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环的支架(Kabat，E.A.等人，(1991) Sequences of proteins ofimmunological interest. NIH Publication 91—3242)。
本文中使用的“抗体⑶R”或“⑶R”是指抗体的互补决定区，其如Kabat Ε. A.等人， (1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest. NIH Publication 91-3242) 定义的由抗原结合环组成。抗体Fv片段的两个可变结构域中的每一个包含例如3个CDR。术语“单链抗体”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变区(Vh)和 抗体轻链可变区的分子。此类scFv分子可具有一般结构=NH2-V^接头-Vh-COOH或 NH2-Vh-接头-Vl-C00H。如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序 列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如 果两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖 氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两 个序列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果 两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列 CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个 序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例 如Align程序(DNAstar, Inc.)方便地进行的Needleman等(I97O)J. Mol. Biol. 48 :443-453 的方法来提供。“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是 进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保 守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化 学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的” 序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间 的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置的数目除以进行 比较的位置的数目再乘以因子100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配 以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80%的正相似性。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少两个，优选更多的进行比对的氨 基酸序列的矩阵产生的氨基酸序列(允许在比对中出现缺口)，其使得可能确定各位置上 出现频率最高的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置上出现频率最高的氨基酸的序列。 如果两个或更多个氨基酸等同地出现在单个位置上，那么共有序列包括两个或所有此类氨 基酸。可在不同水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水 平、具有缺口的多个残基水平等上展示保守性或变异性。残基可展示相同残基的保守性或 可在种类水平上保守。氨基酸种类的实例包括具有下列的氨基酸种类极性的但不带电荷 的侧链或R基团(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基团(赖氨酸、精 氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基团(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基团(丙氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸种类(半胱氨 酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他种类对于本领域技术人员来说是已知的并且可使用结构测定法 或其他数据来定义以估量可置换性。在该意义上，可置换的氨基酸可以指可在该位置上进 行置换并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，将认识到，相同种类的氨基酸在它们的生物物理性质上可具有一定程度的不同。例如，将认识到，某些疏水性R基团(例如，丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸)比其他疏水 性R基团(例如，缬氨酸或亮氨酸)更加亲水(即，具有更高的亲水性或更低的疏水性)。 相对亲水性或疏水性可使用本领域公知的方法(参见，例如，Rose等人，Science, 229 834-838(1985)和 Cornette 等人，J Mol. Biol, 195 :659-685(1987))来测定。如本文中所使用的，当一个氨基酸序列(例如，第一 ￥11或八序列)与一个或多个 另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个VH或VL序列)比对时，可将一个序列 (例如，第一 Vh或\序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位 置”相比较。如本文中所使用的，“相应位置”表示当对序列进行最优比对时，即当序列进行 比对以获得最高百分数同一性或百分数相似性时进行比较的序列中的等同位置。如本文中所使用的，术语“抗体数据库”是指两个或更多个抗体氨基酸序列(“多 个”序列)的集合，通常是指数十个、数百个或甚至数千个抗体氨基酸序列的集合。抗体数 据库可存储例如抗体Vh区、抗体\区或两者的集合的氨基酸序列，或可存储由Vh和\区域 组成的scFv序列的集合。优选，可将数据库存储在可检索的、固定的介质中，例如计算机上 可检索的计算机程序中。在一个实施方案中，抗体数据库是包含或由种系抗体序列组成的 数据库。在另一个实施方案中，抗体数据库是包含或由成熟(即，表达的)抗体序列组成的 数据库(例如，成熟抗体序列的Kabat数据库，例如KBD数据库)。在另一个实施方案中，抗 体数据库包含或由功能性选择的序列(例如，根据QC测定选择的序列)组成。术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例 如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。 免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限 于(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通 过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有 铰链区的一部分的 Fab (参见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul 编辑，3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI结构域组成的Fd片段；(ν)包含抗体的单臂的\和Vh结构域的Fv片 段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)，其由Vh 或 Vl 结构域组成，Camelid(参见 Hamers-Casterman，等人，Nature 363 :446-448(1993) 和 Dumoulin 等人，Protein Sciencell :500-515(2002))或 Shark 抗体(例如，shark Ig-NARs Nanobodie S )；和(Vii)纳米抗体(Nanobody)，包含单个可变结构域和两个 恒定结构域的重链可变区。如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功 效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽 (例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是稳定性(例如，热稳定性)。 在另一个实施方案中，功能性质是溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功 能性质是聚集行为。在另一个实施方案中，功能性质是蛋白质表达(例如，在原核细胞中)。 在另一个实施方案中，功能性质是在相应的纯化方法中内含体溶解后的重折叠效率。在某 些实施方案中，抗原结合亲和力不是期望提高的功能性质。在另一个实施方案中，功能性质 的提高或改善不牵涉抗原结合亲和力的显著改变。术语“溶解性”，如本文中所使用的，是指天然蛋白质，即单体、非聚集的和 功能性免疫结合剂的溶解性。“增加的溶解性”意指天然蛋白质的溶解性的提高，其优选通过下列方法中的至少一个方法测定PEG沉淀法、硫酸铵沉淀法、重折叠得率 或本领域技术人员已知的任何其他测定溶解性的方法。PEG沉淀法是如Atha等人 在〃 Mechanism ofPrecipitation of Proteins by Polyethylene Glycols" , JBC,256 12108-12117(1981)中描述的方法。可以例如如下进行硫酸铵沉淀法制备20mg/ml蛋白 质溶液的10 μ 1等分，向每一个所述等分中加入10 μ 1不同饱和度(例如35% ,33^^31%、 ^^^25^^20^^0 15%)的(NH4)2SO4溶液，然后涡旋5秒并在室温下温育30分钟。在以 6000rpm于4°C离心30分钟后，测定上清液中的蛋白质浓度。在该方法中，不同蛋白质的比 较物(comparator)是V50值，其是50%的蛋白质沉淀时所处的(NH4) 2S04饱和度的百分数。 根据上清液中测定的可溶性蛋白质对应用的(NH4)2SO4饱和度的百分数的曲线测定V50。重 折叠得率相应于在相应制造/纯化方法中从溶解的内含体获得的正确折叠的蛋白质的百 分数。本文中使用的术语溶解性不是指可溶性表达。具有提高的溶解性的免疫结合剂在第一方面，提供免疫结合剂，其在重链氨基酸位置12、103和144 (AHo编号)中 包含下列溶解性增强基序之一(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸⑶；和(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸⑴；或(al)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(bl)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和(cl)重链氨基酸位置144处的丝氨酸⑶；或(a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸⑴；和(c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸⑴；或(a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸⑶；和(c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸⑶；或令人惊讶地发现，在指定位置上指定的氨基酸的存在增加了完整免疫结合剂的总 体溶解性。例如，在scFv的VH中3个溶解性增强突变V12S、L144S和V103T组合的情况下， 发现所述置换占完整scFv的溶解性的大约60%。因为疏水斑块在所有免疫结合剂的可变 结构域中是保守的，因此一个或多个指定位置上的置换可用于提高任何免疫结合剂的溶解 性。免疫结合剂优选是scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab片段、Dab或纳米抗体。在优选实施方案中，免疫结合剂还包含选自下列的一个或多个氨基酸(a)轻链 氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)、(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)、(c)重链氨基 酸位置43处的精氨酸(R)、(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)和(e)重链氨基酸位置 78处的丙氨酸(A)。一个或多个指定的氨基酸在相应位置上的存在赋予免疫结合剂增强的 稳定性。本文中指定的氨基酸可存在于天然发生的免疫结合剂或其衍生物中，或免疫结合 剂可被改造而掺入一个或多个上述氨基酸。
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在优选实施方案中，本文中公开的免疫结合剂特异性结合人TNF α或人VEGF。具有提高的溶解性的免疫结合剂的改造如实施例中详细描述的，本文中描述的基于序列的方法已成功用于鉴定赋予提高 的溶解性的特定氨基酸残基置换。实施例列出了在免疫结合剂(例如，scFv)的VH区内和 任选地VL区中在确定的氨基酸位置处的示例性和优选氨基酸置换。示例性置换包括氨基 酸位置处有问题的氨基酸残基(例如，暴露于溶剂的疏水性残基)的置换(更亲水并且在 数据库(例如，成熟抗体(KDB)数据库)中以更高的频率发生)。特别优选的置换是比有问 题的残基更亲水的最频繁发生的残基。在其他实施方案中，更加亲水的氨基酸选自丙氨酸 (A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。因此，本发明提供了其中将一个或多个特定氨基酸置换引入免疫结合剂例如scFv 抗体内的改造方法。此种置换可以使用标准分子生物学方法例如定点诱变、PCR介导的诱 变等来进行。如实施例中所示，下列氨基酸位置已被鉴定为有问题的氨基酸(即，所谓的“疏水 斑块”)以用于在指定的Vh或\序列中进行改造Vh 氨基酸位置 2、4、5、12、103 和 144 ；和Vl 氨基酸位置15,52和147。使用的编号是AHo编号系统；将AHo编号转换成Kabat系统编号的转换表示于表 1禾口 2中。令人惊讶地发现，VH位置12、103、144(根据AHo编号系统)中的两个或更多个位 置处的置换影响整个免疫结合剂的总体溶解性。因为疏水斑块在所有免疫结合剂的可变结 构域中是保守的，因此至少两个在指定的位置处的置换可用于提高任何免疫结合剂的溶解 性。在一个实施方案中，本发明提供了改造免疫结合剂例如scFv抗体的方法，其中在 一个或多个上述鉴定的氨基酸位置处产生至少两个氨基酸置换，从而产生免疫结合剂的变 异(即，突变)形式。因此，在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，所述方法包括A)在Vh区、八区或Vh和\区内选择至少两个氨基酸位置用于突变；和B)突变选择用于突变的至少两个氨基酸位置，其中如果选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置位于中，那么置换是选自 12、103和144(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置11、89和108) 的至少两个重链氨基酸位置，和/或其中如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在&区中，那么置换在选自15、 52和147(根据AHo编号约定；在使用Kabat编号的情况下，氨基酸位置15、44和106)的 轻链氨基酸位置处。在某些实施方案中，氨基酸位置被疏水性氨基酸(例如，亮氨酸(L)或缬氨酸(V)) 占据。在一个实施方案中，重链氨基酸位置12处的氨基酸是缬氨酸(V)。在另一个实施方 案中，重链氨基酸位置103处的氨基酸是缬氨酸(V)。在另一个实施方案中，重链氨基酸位 置144处的氨基酸是亮氨酸(L)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置15处的氨基酸是 缬氨酸(V)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置52处的氨基酸是苯丙氨酸(F)。在另一个实施方案中，轻链氨基酸位置147处的氨基酸是缬氨酸(V)。优选，突变是用更亲水的氨基酸置换选择的氨基酸位置处的氨基酸。在其他实施 方案中，更亲水的氨基酸选自丝氨酸( 或苏氨酸(T)。在某些实施方案中，所述方法包括a)在免疫结合剂中选择至少两个氨基酸位置 用于突变；和b)突变选择用于突变的至少两个氨基酸位置，其中突变包括选自下列的至少 两个置换(i)重链氨基酸位置12 (使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置11) 处的丝氨酸⑶；(ii)重链氨基酸位置103 (使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置89) 处的丝氨酸⑶或苏氨酸⑴；和(iii)重链氨基酸位置144(使用AHo编号)(在使用Kabat编号的情况下，位置 108)处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。在非常优选的实施方案中，重链氨基酸位置12、103和144中的至少一个是苏氨酸 ⑴。在其他实施方案中，突变包括在轻链氨基酸位置15 (使用AHo或Kabat编号)处 使用苏氨酸(T)的置换和/或在轻链氨基酸位置147 (使用AHo编号)(在使用Kabat编号 约定的情况下，位置106)处使用丙氨酸(A)的置换。在其他实施方案中，突变导致溶解性增加至少2倍(例如，溶解性增加2倍、2. 5 倍、3倍、3. 5倍、4倍或更多倍)。在另一个实施方案中，免疫结合剂的热稳定性、重折叠、表达产量、聚集和/或结 合活性未受到突变的不利影响。在某些实施方案中，突变还包括一个或多个选自下列的在氨基酸位置(AHo编号 约定)处的稳定性突变(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D) ； (b)轻链氨基酸位置83 处的谷氨酸(E) ； (c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(I ) ； (d)重链氨基酸位置67处的亮氨 酸(L)；和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。已证明此类突变对免疫结合剂的稳定 性具有影响。在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的免疫结合剂。在某些示例性实施方案中，根据本发明的方法改造的免疫结合剂是本领域公认的 免疫结合剂(其结合具有治疗重要性的靶抗原)或包含来源于具有治疗重要性的免疫结 合剂的可变区(VL和/或VH区)或一个或多个CDR(例如，CDRLU CDRL2、CDRL3、CDRHU CDRH2和/或CDRH3)的免疫结合剂。例如，目前由FDA或其他管理机构批准的免疫结合剂 可以根据本发明的方法进行改造。更具体而言，这些示例性免疫结合剂包括但不限于，抗 CD3 抗体例如莫罗单抗(Orthoclone 0KT3 Johnson&Johnson, Brunswick, NJ;参见 Arakawa 等人 J. Biochem，(1996) 120 :657-662 ；Kung 和 Goldstein 等人，Science (1979)， 206 =347-349)、抗 CDll 抗体例如依法珠单抗(Raptiva , Genentech, South San Francisco, CA)、抗 CD20 抗体例如利妥昔单抗(Ri tUXan /Mabthera , Genentech， South San Francisco，CA)、托西莫单抗(Bexxar ,GlaxoSmithKline,London)或替伊莫 单抗(Zeval in , Biogen I dec, Cambridge ΜΑ)(参见美国专利 5，736，137 ；6, 455, 043 ； 和 6，682，734)、抗0)25(11^21^)抗体例如达克珠单抗(Zenapax , Roche，Basel，Switzerland)或巴利昔单抗(Simulect , Novartis, Basel, Switzerland)、抗 CD33 抗体例如吉妥珠单抗(Mylotarg ，Wyeth，Madison, NJ-参见美国专利5，714，350和 6，350, 861)、抗 CD52 抗体例如阿仑珠单抗(Campath , Millennium Pharmacueticals, Cambridge, ΜΑ)、抗 GpIIb/glla 抗体例如阿昔单抗(ReoPro ，Centocor，Horsham, PA)、 抗TNF α抗体例如英利昔单抗(Remi cade ,Centocor，Horsham, PA)或阿达木单抗 (Humi ra , Abbott, AbbottPark，IL-参见美国专利 6，258，562)、抗 IgE 抗体例如奥马 珠单抗(Xolair , Genentech，South San Francisco，CA)、抗 RSV 抗体例如帕利珠单抗 (Synag iS ，Medimmune，Gaithersburg, MD-参见美国专利 5,824，307)、抗 EpCAM 抗体 例如依决洛单抗(Panorex ,Centocor)、抗EGFR抗体例如西妥昔单抗(Erbitux , ImcloneSystems, New York, NY)或中白木单抗(VeCt ibix , Amgen, ThousandOaks, CA)、 抗HER2/neu抗体例如曲妥珠单抗(Hercept in , Genentech)、抗α 4整联蛋白抗体例 如那他珠单抗(Tysabri ,Biogenidec)、抗C5抗体例如依库珠单抗(Soliris , AlexionPharmaceuticals, Chesire, CT)和抗 VEGF 抗体例如贝伐珠单抗(Avast in , Genentech-参见美国专利 6,884,879)或雷珠单抗(Lucent i S , Genentech)。在某些示例性实施方案中，根据本发明的方法改造的免疫结合剂是上述本领域公 认的免疫结合剂。在优选实施方案中，免疫结合剂是scFv抗体。在其他实施方案中，免疫 结合剂是例如全长免疫球蛋白、Dab、纳米抗体或Fab片段。尽管描述了前述内容，但在多种实施方案中，某些免疫结合剂被排除用于本发明 的改造方法和/或被排除成为通过改造方法产生的免疫结合剂组合物。例如，在多种实施 方案中，存在附带条件，即免疫结合剂不是PCT公开号WO 2006/131013和WO 2008/006235 中公开的任何scFv抗体或其变体，例如，PCT公开号WO 2006/131013和W02008/006235中 公开的ESBA105或其变体，所述专利各自的内容明确地通过引用合并入本文。优选，本文中公开的、用于本文中公开的方法的或通过本文中公开的方法产生的 免疫结合剂分别是scFv抗体，但也包括其他免疫结合剂，例如全长免疫球蛋白、Fab片段或 本文中描述的任何其他类型的免疫结合剂(例如Dab或纳米抗体)。在优选实施方案中，本文中公开的、用于本文中公开的方法的或通过本文中公开 的方法产生的免疫结合剂分别特异性结合人TNF α或人VEGF。本发明还包括包含本文中公开的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。scFv组合物和制剂本发明的另一个方面涉及按照本发明的方法制备的scFv组合物。因此，本发明提 供了经改造的scFv组合物，其中与原始的目的scFv相比，已将一个或多个溶解性增强突变 导入氨基酸序列，其中突变已被导入疏水氨基酸残基的位置。在一个实施方案中，scFv已 进行了改造，从而包含一个突变的氨基酸位置(例如，一个构架位置)。在其他实施方案中， scFv已进行了改造，从而包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个突变的氨基酸位置(例如， 构架位置)。在某些实施方案中，突变还包括于2008年6月25日提交的、名称为“Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodieswith Improved Functional Properties”的 PCT 申请 PCT/CH2008/000285 或 2008 年 3 月 12 日提交的、名称为“MethodsofModifying Antibodies, and Modified Antibodies with ImprovedFunctional !Properties”的美国临时申请号系列号61/069，056(两者通过引用合并入本文)中所述的 一个或多个稳定性突变。例如，免疫结合剂还可包含选自下列的在氨基酸位置(AHo编号约 定)处的置换(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D) ； (b)轻链氨基酸位置83处的谷氨 酸(E) ； (c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R) ； (d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)； 和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。一个或多个在指定位置处的突变对整个免疫结 合剂的总体溶解性具有影响。在其他实施方案中，突变还包括下列稳定性突变(AHo编号约 定)(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸⑶；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)； (c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R) ； (d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和(e)重 链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。本发明的另一个方面涉及本发明的SCFv组合物的药物制剂。此类制剂通常包含 scFv组合物和药学上可接受的载体。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理 上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优 选，载体适合于例如静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱、表皮施用(例如，通过注射或输注)、 或局部施用(例如，至眼或皮肤)。取决于施用途径，可将scFv包被在材料中以保护化合物 免受酸的作用和可使化合物失活的其他天然条件的损害。本发明的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐” 是指保持亲本化合物期望的生物学活性并且不提供任何不想要的毒理学效应的盐(参见 例如，Berge，S. Μ.等人(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加 成盐。酸加成盐包括从无毒无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸(phosphoric)、硫酸(sulfuric)、 氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸(phosphorous)等衍生的盐，以及从无毒有机酸例如脂肪族一羧酸 和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的盐。碱 加成盐包括从碱土金属例如钠、钾、镁、钙等衍生的盐，以及从无毒有机胺例如N，N' - 二苄 基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的盐。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧 化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸 钠(sodium metabisulfite)、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁 羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α -生育酚等；和(3)金属螯合 剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本发明的药物组合物的适当的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多 元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)和其适当的混合物，植物油例如橄榄油，和可注射 的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过 维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持恰当的流动性。此类组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌方法 (同上)和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、 山梨酸等来确保防止微生物的存在。也可期望将等渗剂例如糖、氯化钠等包含入组合物。 此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来获得可注射药物形式的延长吸 收。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射液或
13分散体的无菌粉剂。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域内是已知的。除非 任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则预期其在本发明的药物组合物中的用途。 还可将补充的活性化合物掺入组合物。治疗性组合物通常必须是无菌的并且在生产和贮存的条件下是稳定的。可将组合 物配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是包含例如 水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适当的混合物的溶剂或分 散介质。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持需要的颗粒大小 和通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂， 例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例 如单硬脂酸盐和明胶来获得可注射组合物的延长的吸收。无菌注射液可通过将活性化合物以需要的量与上面例举的成分的一种或组合一 起掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微过滤(如果需要的话)来制备。通常，通过将活性化 合物掺入包含基本分散介质和需要的来自上面列举的成分的其他成分的无菌媒介物来制 备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，制备的优选方法是从之前无菌过 滤的溶液产生包含活性成分和任何额外的期望的成分的粉剂的真空干燥和冷冻干燥(冻 干法(Iyophilization)) ο可与载体材料组合从而产生单个剂型的活性成分的量将随正在治疗的受试者以 及施用的特定模式的变化而变化。可与载体材料组合从而产生单个剂型的活性成分的量 通常是产生治疗效果的组合物的量。一般地，除百分之百外，该量将在大约0. 01 %至大约 99 %的活性成分，优选大约0. 1 %至大约70 %，最优选大约1 %至大约30 %的活性成分的范 围内(与药学上可接受的载体组合)。调整给药方案以提供最佳的期望的应答(例如，治疗应答)。例如，可施用单个大 丸剂，可在一段时间内施用几份分开的剂量或可根据治疗状况的紧急性的需要，按比例减 少或增加剂量。特别有利地以单位剂型(dosage unit form)配制胃肠外组合物以便施用和 保持剂量均一。本文中使用的单位剂型是指适合用作用于待治疗的受试者的单份剂量的物 理上分开的单位；各单位包含经计算与需要的药物载体一起产生期望的治疗效果的预先确 定量的活性化合物。本发明的单位剂型的规格(specification)受制于和直接取决于(a) 活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果，和(b)配制用于治疗个体的敏感性的此 类活性化合物的领域中固有的限制。抗体位置编号系统提供了用于鉴定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的两个不同编号系 统的换算表。Kabat编号系统进一步描述于Kabat等人(Kakit，E. Α.，等人(1991) kquences of Proteins of Immunologicallnterest,第5版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。AHo 编号系统进一步描述于 Honegger，A.和 Pluck thun, Α. (2001) J. Mol. Biol. 309 :657-670)。重链可变区编号表1 重链可变结构域中残基位置的换算表
权利要求
1.一种免疫结合剂，其包含重链氨基酸位置12、103和144 (AHo编号)中的下列溶解性 增强基序之一(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或 (al)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)； (bl)重链氨基酸位置103的苏氨酸(T)；和 (cl)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或 (a2)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)； (b2)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和 (c2)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或 (a3)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)； (b3)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和 (c3)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)。
2.权利要求1的免疫结合剂，其还包含(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和/或(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。
3.增强免疫结合剂的溶解性的方法，所述免疫结合剂包含重链可变(Vh)区或其片段， 所述方法包括A)在Vh区中选择至少两个氨基酸位置用于突变；和B)突变选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置，其中所述至少两个氨基酸位置选自由12、103和144(根据AHo编号约定)组成的重链 氨基酸位置，并且突变包括用亲水性氨基酸置换所选择的氨基酸位置处的氨基酸。
4.权利要求3的方法，其中所述亲水性氨基酸是(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸⑶；(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸( 或苏氨酸(T)；和/或(c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸( 或苏氨酸(T)。
5.权利要求3或4的方法，其中选择用于突变的氨基酸位置处的氨基酸是疏水性氨基酸。
6.权利要求5的方法，其中所述疏水性氨基酸是亮氨酸(L)或缬氨酸(V)。
7.权利要求3至6的任一项的方法，其中(a)重链氨基酸位置12处的选择用于突变的氨基酸是缬氨酸(V)；(b)重链氨基酸位置103处的选择用于突变的氨基酸是缬氨酸(V)；和(c)重链氨基酸位置144处的选择用于突变的氨基酸是亮氨酸(L)。
8.权利要求3至7的任一项的方法，其中免疫结合剂的热稳定性、重折叠、表达产量、聚 集和/或结合活性未受到突变的不利影响。
9.权利要求3至8的任一项的方法，其中所述突变导致溶解性增加至少2倍。
10.权利要求3至9的任一项的方法，其中所述突变还包括在选自下列的氨基酸位置 (AHo编号约定)处引入一个或多个突变的步骤(a)轻链氨基酸位置31处的天冬氨酸(D)；(b)轻链氨基酸位置83处的谷氨酸(E)；(c)重链氨基酸位置43处的精氨酸(R)；(d)重链氨基酸位置67处的亮氨酸(L)；和(e)重链氨基酸位置78处的丙氨酸(A)。
11.根据权利要求3至10的任一项的方法制备的免疫结合剂。
12.权利要求1、2或11的任一项的免疫结合剂，其为scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab 片段、Dab或纳米抗体。
13.权利要求1、2、11或12的任一项的免疫结合剂，其中所述免疫结合剂特异性结合人 TNFa 或人 VEGF。
14.包含权利要求1、2、11、12或14的任一项的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组 合物。
全文摘要
本发明提供了使用基于序列的分析和合理的策略来提高免疫结合剂，特别是单链抗体(scFv)的溶解性的方法。本发明提供了改造免疫结合剂，特别是scFv的方法，其中用通过分析选择的稳定scFv序列的数据库而鉴定的亲水性残基进行一个或多个置换。本发明还提供了根据本发明的改造方法制备的具有优化的溶解性的免疫结合剂。
文档编号C07K16/22GK102076715SQ200980123815
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者D·厄里什, L·波拉斯 申请人:艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司