吞噬细胞的功能评价方法

专利名称：吞噬细胞的功能评价方法
技术领域：
本发明涉及用于吞噬细胞功能评价的新方法、与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾 病的检测方法。
背景技术：
吞噬细胞是具有吞噬活性的细胞的总称。大致分为在生物体内主要发挥吞噬作用 的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞之类的专职吞噬细胞(professional phagocyte) 和根据情况发挥吞噬活性的非专职吞噬细胞(amateur phagocyte) 0非专职吞噬细胞包括 脑的小胶质细胞、肝脏的枯否氏细胞、精巢的塞尔托利细胞等。白细胞是指血液中包含的细胞成分，主要由粒细胞(约60% )、淋巴细胞(约 25%)、单核细胞(约5%)构成。粒细胞进一步分类为嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱 性粒细胞，数量上嗜中性粒细胞最多，嗜中性粒细胞占白细胞的几乎一半。另外，单核细胞 在各组织中游走成为巨噬细胞。白细胞包含大量的吞噬细胞，因为分离容易，所以适合用作 吞噬细胞源。 吞噬是针对细菌·真菌等微生物的进入而最早启动的重要生物体防御机制之一。 吞噬经过吞噬细胞引起的异物的识别、异物的摄入、吞噬体的形成、吞噬体内的异物消化、 消化后的物质的吸收或排出这样连续的阶段。吞噬不仅针对细菌 真菌等外来异物而发生， 也与炎症部位的自身组织残渣或代谢的自身细胞之类来自自身的无用物质的除去有关。吞 噬细胞不只是将吞噬的物质在细胞内消化，有时也随着吞噬，将活性氧或蛋白质分解酶释 放到细胞外。由此能够在局部有效地杀菌或组织消化，另一方面，有时自身组织也会被过度 的吞噬反应破坏。例如在风湿性关节炎(rheumatoid arthritis :RA)的病变部确认了过度 吞噬自身免疫复合体的细胞(RA细胞)，已知由RA细胞释放出的蛋白质分解酶破坏组织，参 与关节炎的进行。作为测定吞噬细胞的吞噬功能的方法，已知下述方法使吞噬细胞与胶乳粒子接 触，通过血细胞计数器或显微镜计数被摄入细胞内的胶乳粒子的方法；使吞噬细胞吞噬施 加了荧光标记的吞噬物质(大肠杆菌、酵母聚糖等)，检测被摄入细胞内的量的方法；使其 吞噬活菌，然后通过培养确认残留的活菌数的方法；检测吞噬时释放的活性氧引起的发光 的方法等。已知⑶14分子是被鉴定为在单核细胞的膜上表达的分化标记物之一的糖蛋白 质，具有作为LPS(脂多糖)的受体的功能(非专利文献1)。CD14分子中存在表达于细胞 表面的膜结合型⑶14(mCD14)和可溶型⑶14 (s⑶14) 2种。作为s⑶14，已知具有约55kDa、 约49kDa分子量的分子种类的存在，认为是随着由肝脏的分泌和单核细胞的活化mCD14被 酶切断而产生的(非专利文献2 4)。报道了下述情况，即分子量约55kDa和约49kDa的s⑶14(以下称为“高分子量 s⑶14”)在败血症(SEPSIS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、 全身性红斑狼疮(SLE)等多种疾病的患者血中显示高值。因此，认为上述s⑶14不是疾病特异性的标记物(非专利文献5 6)。另一方面，作为在败血症患者中血中浓度特征性上升的、新s⑶14的分子种类，报 道了存在s⑶14-ST (可溶性⑶14抗原亚型)。s⑶14-ST特征为在s⑶14中于非还原条件下在SDS-PAGE中泳动至分子量 13士2kDa，且保持⑶14的N端部。与高分子量s⑶14相比，具有C端侧大量缺失的氨基酸 序列，与高分子量sCD14不同，不具有LPS结合能力。另外，因为SCD14-ST显示与高分子量 s⑶14不同的免疫原性，所以可以使用抗体区分两者。s⑶14-ST在败血症患者中血中浓度 特异性上升(专利文献1)。另外，有报告称即使与难以与败血症相区分的、显示全身性炎症 反应(SIRS)的患者进行比较，在败血症患者的血中也显示高值，认为s⑶14-ST是败血症的 特异性诊断标记物(非专利文献7)。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开W02005/108429号公报非专利文献非专利文献1 :Wright 等，Science，249 1431-1433，1990 年__专禾Ij文献 2 :Bazil 及 Strominger，Journal of Immunology, 147 1567-1574, 1991 年非专利文献 3 :Bufler 等，European Journal of Immunology, 25 604-610,1995
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发明内容
发明所要解决的课题现有的吞噬细胞的吞 噬能力的测定方法需要吞噬物质的事前标记操作、用于确认 吞噬后残留的活菌的培养、用显微镜检测等费时费工的操作以及血细胞计数器、显微镜之 类专门的装置，希望开发出更简便的新测定方法。虽然只要能够测定随着吞噬而由吞噬细 胞释放出的液性因子，就能够得到更简便并且定量的测定法，但因为细胞因子也因吞噬刺 激以外的各种免疫激活刺激而产生，所以不适合作为吞噬特异性的标记物。另外，考虑到活 性氧也因各种刺激而产生、并且在短时间内消失，因而也不适合作为吞噬特异性的标记物， 有必须即时进行测定的限制。在与局部的吞噬反应相关联的疾病(例如风湿性关节炎等)中，只要能够通过测 定体液等试样中的标记物分子来测算吞噬反应的程度，就有助于疾病的诊断。此时，测定试 样中的液性因子是简便的，但吞噬特异性并且具有适于测定的稳定性的液性因子目前尚属 未知。
用于解决课题的手段公知s⑶14-ST是在败血症患者血浆中上升的疾病标记物，但其产生机制尚不明 了。在这种状况下，本发明人发现内毒素引发兔败血症模型动物的血中s⑶14-ST不上升， 但在通过活菌感染制作的兔败血症模型动物(CLP(盲肠浆膜剥离)模型)中却上升。由该 实验事实，得知对SCD14-ST的产生来说，仅内毒素导致的白细胞活化并不充分，重要的是 白细胞引起的细菌的吞噬过程。因此，在体外详细研究各种白细胞刺激物质和SCD14-ST产 生量的关联性时，发现s⑶14-ST只在添加使白细胞发生吞噬活动的物质时产生，其通过添 加阻碍吞噬的物质而降低。进而，发明人发现在兔关节炎模型动物中随着关节炎的发病，关 节液中的s⑶14-ST上升。因此，s⑶14-ST是对吞噬反应为特异性、并且具有适于测定的稳定性的液性因子。S卩，本发明提供吞噬细胞功能评价的新方法。(1-1)吞噬细胞的功能评价方法，其特征在于，测定由吞噬细胞产生的s⑶14-ST。

(1-2)如上述(1-1)所述的方法，其中，吞噬细胞的功能为吞噬能力。(1-3)如上述(1-1)或(1-2)所述的方法，其特征在于，包含使吞噬物质接触吞噬 细胞的工序。(1-4)吞噬细胞的功能评价方法，其特征在于，包含下述工序1)使吞噬细胞与吞噬物质接触的工序，2)对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST进行测定的工序，和3)将测定值与标准值比较，而对吞噬细胞的吞噬活动的有无和/或程度进行判定 的工序。(1-5)如上述(1-1) (1-4)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞是嗜中性粒 细胞、粒细胞和/或白细胞。(1-6)如上述(1-1) (1-4)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞是粒细胞，吞 噬细胞的功能是吞噬能力。另外，本发明是用于评价含有s⑶14-ST的吞噬细胞的功能的标记物。另外，本发明提供利用对来自受试体的吞噬细胞的功能进行评价的、各种检测 评 价方法。(2-1)方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的伴随吞噬细胞功能异常的疾 病的检测方法，其特征在于，包含1)通过上述(1-1) (1-6)中的任一项所述的方法，而对来自受试体的吞噬细胞 的功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值进行比较的工序，和3)根据来自受试体的吞噬细胞的功能与正常值相比为高值或低值而对疾病的有 无和/或程度进行判定的工序。(2-2)方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的免疫功能的评价方法，其特征 在于，包含1)通过上述(1-1) (1-6)中的任一项所述的方法而对来自受试体的吞噬细胞的 功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值进行比较的工序，和
3)根据来自受试体的吞噬细胞的功能与正常值相比为高值或低值而对免疫功能的程度进行判定的工序。(2-3)方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的药剂效果的评价方法，其特征 在于，包含1)通过上述(1-1) (1-6)中的任一项所述的方法而对药剂给予中和/或药剂给 予后的来自受试体的吞噬细胞的功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值和/或药剂给予前的评价结果进行比较的工序，和3)对药剂的给予所致的来自受试体的吞噬细胞的功能的变化的有无和/或程度 进行判定的工序。(2-4)方法，其是评价移植用吞噬细胞的品质的方法，其特征在于，包含1)通过上述(1-1) (1-6)中的任一项所述的方法而对移植用吞噬细胞的功能进 行评价的工序，2)将评价的结果与基准值进行比较的工序，和3)对移植用吞噬细胞的功能是否满足基准值进行判定的工序。(2-5)如上述(2-1) (2-4)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞是嗜中性粒 细胞、粒细胞和/或白细胞。(2-6)如上述(2-1) (2-5)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞的功能是吞 噬能力。(2-7)如上述(2-1) (2-4)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞是粒细胞，吞 噬细胞的功能是吞噬能力。另外，本发明提供吞噬功能调节物质的筛选方法。(3-1)吞噬功能调节物质的筛选方法，其特征在于，包含下述工序1)使吞噬细胞与待检物质接触的工序，2)对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST进行测定的工序，和3)评价待检物质对吞噬细胞引起的吞噬能力的效果的工序。(3-2)如上述(3-1)所述的方法，其特征在于，在吞噬物质的存在下使吞噬细胞与 待检物质接触。(3-3)如上述(3-1) (3-2)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞是嗜中性粒 细胞、粒细胞和/或白细胞。另外，本发明提供与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病的检测方法。(4-1)与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病的检测方法，其特征在于，包含下述工 序1)对来自受试体的试样(血液除外)中所包含的s⑶14-ST进行测定的工序，2)将测定的值与正常值进行比较的工序，和3)对试样中的s⑶14-ST的量与正常值相比是否为高值进行判定的工序。(4-2)如上述(4-1)所述的方法，其特征在于，在试样中添加吞噬物质后，对 SCD14-ST进行测定。(4-3)如上述(4-1)或(4-2)所述的方法，其中，与吞噬细胞引起的吞噬相关联的 疾病为风湿性关节炎，试样为关节液。
(4-4)如上述(4-1)或(4-2)所述的方法，其中，与吞噬细胞引起的吞噬相关联的 疾病为乳腺炎，试样为乳汁。(4-5)如上述(4-1) (4-4)中的任一项所述的方法，其中，吞噬细胞为嗜中性粒 细胞、粒细胞和/或白细胞。发明效果根据本发明，通过对伴随吞噬而从吞噬细胞中释放出的液性因子即SCD14-ST进 行测定，能够特异性并且简便地测定吞噬细胞的功能。另外，可以使用该测定体系进行吞噬 功能调节物质的筛选。进而，可以特异性并且简便地检测与吞噬细胞引起的吞噬相关的疾病。


[图1]表示实施例3所述的s⑶14-ST测定体系中的、重组体兔s⑶14-ST的用量 依赖性的反应性。横轴表示重组体SCD14-ST浓度(pg/mL)，纵轴表示吸光度。[图2]表示实施例4所述的LPS负荷兔败血症模型中的、LPS给予前后的血中 s⑶14-ST的测定结果。纵轴表示血中s⑶14-ST浓度(pg/mL)。[图3]表示实施例4所述的利用活菌感染制作的兔败血症模型中的、手术前后的 血中s⑶14-ST的测定结果。纵轴表示血中SCD14-ST浓度(pg/mL)。[图4]表示实施例5所述的、将兔粒细胞用各种白细胞刺激剂刺激时的SCD14-ST 产生情况。[图5]表示实施例5所述的、将兔粒细胞用各种白细胞刺激剂刺激时的高分子量 sCD14产生情况。[图6]表示实施例5所述的、吞噬抑制剂对将兔粒细胞用吞噬物质刺激时的 SCD14-ST产生的效果。[图7]表示实施例6所述的、兔关节炎模型的关节清洗液中的SCD14-ST的测定结^ ο[图8]表示实施例7所述的、将人粒细胞用各种白细胞刺激剂刺激时的SCD14-ST
产生情况。[图9]表示实施例7所述的、吞噬抑制剂对将人粒细胞用吞噬物质刺激时的 SCD14-ST产生的效果。
具体实施例方式1. SCD14-ST (可溶性 CD14 抗原亚型)本发明基于吞噬细胞在吞噬外来微生物或异物、进行消化的过程中产生s⑶14-ST 的发现。s⑶14-ST的特征在于，在s⑶14中于非还原条件下在SDS-PAGE中泳动至分子量 13 士 2kDa处，且保持⑶14的N端部的氨基酸序列。另外，s⑶14-ST显示与高分子量s⑶14不 同的免疫原性。例如人高分子量s⑶14被3C10抗体(ATCC TIB-228)所识别，但人s⑶14-ST 不与3C10抗体结合。另一方面，也存在特异性识别s⑶14-ST、不识别高分子量s⑶14的抗体。这类抗体 是以SCD14-ST的特定部位的肽为抗原决定部位的肽抗体。特定部位是CD14的二次结构中的 β3 禾口 β4 之间的区域(Kim 等，Journal of Biological Chemistry,280 11347-11351, 2005年)。具体而言，在人⑶14(序列编号1)中为第36 79的氨基酸序列，在兔⑶14(序 列编号2)中为第38 81的氨基酸序列，在小鼠CD14(序列编号3)中为第36 79的氨基 酸序列，在牛⑶14(序列编号4)中为第36 77的氨基酸序列。以该区域中的、包含连续的 8个以上氨基酸的序列的肽为抗原，制作抗体。包含人CD14的第53 68的16个氨基酸的 肽、包含兔⑶14的第40 59的20个氨基酸的肽为适宜的例子。高分子量s⑶14在β 3 β 4的区域(包含β 3-α 2-α 3-β 4)中具有β折叠结构或α螺旋结构，但s⑶14-ST与高 分子量SCD14相比具有C端侧大量缺失的序列，所以在β3 β 4的区域无法维持本来的 立体结构，认为两者立体结构不同使得抗体的识别性产生不同。因此，s⑶14-ST的特征在于，在非还原条件下在SDS-PAGE中泳动至分子量 13士2kDa处，且保持⑶14的N端部的氨基酸序列，此外还可以通过特定的免疫原性而具有 特征。特定的免疫原性是指能够被以包含⑶14的β3 β 4区域中的连续的8个以上氨 基酸的序列的肽为抗原制作的抗体所识别。另外，SCD14-ST是在活菌感染导致的败血症或 败血症模型中血中浓度特异性上升的因子。例如人SCD14-ST的特征在于，在非还原条件下 在SDS-PAGE中泳动至分子量13 士 2kDa处，在N末端序列具有序列号1所述的氨基酸序列的 第1 第8的序列，且特异性结合在与包含序列号1所述的氨基酸序列的第53 第68的 16个氨基酸残基的肽结合的抗体上。进而，能够使其具有以下特征中的任意一个以上特 异性结合在与包含序列号1所述的氨基酸序列的第17 第26的肽结合的抗体上、不结合 在3C10抗体上、不结合在MEM-18抗体上、不具有LPS结合能力、可以由人血清得到、以及、 是在败血症患者中血中浓度特异性上升的因子。因为s⑶14-ST保持⑶14的N端部的氨基酸序列，所以分离s⑶14-ST而解析N端 的氨基酸序列时，可以确认具有与CD14的N端部相同的氨基酸序列。只要至少从N端开始 第1 第8的氨基酸序列相同即可。例如，如果为人则可以确认在N端保有序列号1的氨 基酸序列的第1 第8的序列。如果是兔，则在N端保有序列号2的氨基酸序列的第1 第8的序列，如果是小鼠，则在N端保有序列号3的氨基酸序列的第1 第8的序列，如果 是牛，则在N端保有序列号4的氨基酸序列的第1 第8的序列。2.吞噬细胞的功能评价方法本发明中的吞噬细胞只要是来自哺乳类的、具有吞噬活性的细胞，就没有特别限 定，适宜的是嗜中性粒细胞。从制备的容易性方面考虑，作为包含嗜中性粒细胞的试样，可 以使用白细胞或粒细胞。也可以是具有分化成粒细胞的功能的经分离的细胞株，作为例子， 可以举出HL-60。作为哺乳类，可以举出人、兔、小鼠、大鼠、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫等。吞噬细胞可以由血液、组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘 液、鼻涕、痰、尿、腹水、羊水、精液等体液等制备。另外，还可以由将鼻腔、支气管、肺、皮肤、 腹腔、各种脏器、关节、骨等清洗后得到的清洗液制备。此外，也可以由皮肤、肺、肾、粘膜等 组织制备吞噬细胞。由生物体制备吞噬细胞时，可以仅严密地分离吞噬细胞进行使用，也可以制备含 吞噬细胞的馏分进行使用。例如将由血液制备的白细胞、由血液制备的粒细胞、由腹腔清洗 液制备的粒细胞等用作本发明的方法中使用的吞噬细胞。
吞噬细胞的功能是吞噬细胞保有的生理功能。本发明中，以吞噬能力为吞噬细胞 的活性指标，而对吞噬细胞的功能进行评价。吞噬细胞除吞噬能力以外，还兼具细胞因子产 生能力或游走能力等各种功能，但吞噬细胞共通的功能为吞噬能力。因此，吞噬细胞作为细 胞是否具有正常的功能优选以吞噬能力为指标。另外，因为吞噬细胞在多数情况下作为免 疫细胞在生物体内发挥免疫功能，所以评价吞噬细胞的吞噬能力与评价吞噬细胞的免疫功 能相关联。即，本发明的优选方式之一是嗜中性粒细胞、粒细胞和/或白细胞的吞噬能力的 测定方法。另外，本发明的其他优选方式之一为利用嗜中性粒细胞、粒细胞和/或白细胞的 吞噬能力的测定的免疫功能的评价方法。本发明的吞噬细胞的功能评价方法的特征在于，对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST 进行测定。s⑶14-ST作为用于评价吞噬细胞的功能的标记物有用。吞噬细胞随着吞噬活动 而产生s⑶14-ST。吞噬细胞的吞噬活动从吞噬细胞接触吞噬物质开始。吞噬物质使吞噬 细胞发生吞噬活动，此处所称吞噬活动至少包含吞噬细胞引起的吞噬物质的摄入(吞噬作 用)、以及、被摄入的物质在细胞内的消化过程。作为被吞噬细胞摄入·消化的吞噬物质的 具体例，可以举出细菌·真菌等菌体、酵母聚糖等。另一方面，微珠·胶乳珠之类即使被摄 入也不被消化的物质不属于本发明中的吞噬物质。s⑶14-ST的测定针对含有吞噬细胞的溶液或该溶液的上清液进行。此处所称溶液 是指培养基、细胞分馏液、细胞分析用溶液、生理盐水、体液等。在由生物体制备吞噬细胞的 过程中，吞噬细胞已经对内源性的吞噬物质进行吞噬活动的情况下，可以通 过对制备的含 吞噬细胞的溶液或其上清液进行直接测定来评价吞噬细胞的功能。使吞噬物质与吞噬细胞接触时，只要在含有吞噬细胞的溶液中添加吞噬物质即 可。或者也可以在表面结合了吞噬物质的容器中，添加含有吞噬细胞的溶液。从操作的容 易性方面考虑，吞噬物质优选使用酵母聚糖。s⑶14-ST的测定只要是能够检测s⑶14-ST的体系即可，没有特别限定，优选通过 使用了与SCD14-ST特异性结合的抗体的免疫学测定体系进行测定。免疫学测定体系优选 从直接吸附法、夹层法、凝集法、固相结合法或溶液反应法等中选择。特别优选的方法为夹 层法(夹层免疫测定法)。夹层免疫测定法是通过使用识别测定蛋白质的不同部位的2种以上抗体，形成抗 体-抗原-抗体复合体来进行测定的方法。夹层免疫测定法可以利用公知技术。对于测定 法的原理、应用及改良方法，例如记载在石川荣治著《超高感度酵素免疫測定法》、学会出版 中心(1993年)、松桥直等编著《免疫測定法O新0活用事例i診断試薬·治療薬開発 O応用》、经营教育出版(1985年)、石川荣治等编《酵素免疫測定法》(第3版)、医学书院 (1987 年)中。与s⑶14-ST特异性结合的抗体是与包含⑶14的二次结构中的β 3和β 4之间的 区域中的、连续的8个以上氨基酸的序列的肽结合的抗体。这类抗体的例子可以举出国际 公开W02005/108429号公报中记载的S68抗体、本说明书实施例1中记载的F1301-9-1抗 体等。使用夹层免疫测定法时，还需要另一种抗体，但只要是与SCD14-ST结合的抗体即可， 不特别要求有特异性。也可以使用识别高分子量s⑶14和s⑶14-ST两者的抗体。这类抗 体的例子可以举出国际公开W02005/108429号公报中记载的Fl 106-13-3抗体或F1031-8-3抗体、本说明书实施例2中记载的F1258-7-2抗体等。这些抗体可以是多克隆抗体，也可以 是单克隆抗体，没有特别限定。使用夹层免疫测定法时，优选单克隆抗体。另外，也可以是 该单克隆抗体的片段。此处所称抗体的片段是该单克隆抗体的Fab、Fab'或F(ab' )2中 的任一者。在免疫学测定体系中，形成SCD14-ST和抗体的复合体后，根据标记检测所形成的 复合体，由此测定SCD14-ST的存在。标记只要使用过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β -D-半乳 糖苷酶、氧化酶或尿酸酶等酶、吖啶锡或其衍生物、水母发光蛋白或其变异体等化学发光物 质、FITC、铕(Eu)或钐(Sm)等镧系元素等荧光物质、色素、胶体金、着色胶乳或同位素即可。 将化学发光物质、荧光物质、着色标记或同位素用作标记时，可以通过对应于该标记的测定 机器进行光学测定。将色素、胶体金或着色胶乳用作标记，以利用免疫色谱法或直流法的试 剂盒进行测定时，可以通过目测进行测定。免疫学测定体系也可以以试剂盒的形态提供。试剂盒以特异性结合在SCD14-ST 上的抗体为必需要素，此外还包含在形成s⑶14-ST和抗体的复合体后用于根据标记检测 所形成的复合体的构成要素。例如，可以包含使抗体固相化的不溶性载体(塑料板、胶乳粒 子等)、过氧化物酶等标记酶、胶体金等标记物质、四甲基联苯胺(TMB)等发色物质、用于提 高检测灵敏度的生物素-链霉素抗生物素蛋白等特异结合物质、封闭剂、稀释液、清洗液、 标准物质等。定性和/或定量测定含有吞噬细胞的溶液或该溶液的上清液中的SCD14-ST。将测 定的结果与标准值比较，而对SCD14-ST的存在的有无和/或量进行判断。根据SCD14-ST存 在的有无和/或量，而对吞噬细胞的吞噬活动的有无和/或程度进行判定。标准值可以根 据测定目的适当确定，例如以不含吞噬细胞的溶液、接触吞噬物质前的溶液或这些溶液的 上清液的测定值为阴性标准值。判定试样的测定值是否比阴 性标准值高，而对吞噬细胞的 吞噬能力进行评价。另外，作为标准值，也可以使用由SCD14-ST的标准物质的测定值求出 的标准曲线。通过将试样的测定值与标准曲线进行比较，定量试样中的SCD14-ST来评价吞 噬细胞的吞噬能力。可以以供分析的吞噬细胞的数量和/或每单位时间的SCD14-ST产生 量的标准值为指标，对试样中的吞噬细胞的功能的高低、活化的程度等进行评价。SCD14-ST 的标准物质可以使用由血液精制的s⑶14-ST、将吞噬细胞因吞噬刺激而产生的s⑶14-ST 精制得到的物质、重组体s⑶14-ST、肽合成的s⑶14-ST等。s⑶14-ST的精制法、重组体的 制造法记载在国际公开W02005/108429号公报中。3.利用对来自受试体的吞噬细胞的功能进行评价的、各种检测·评价方法使用上述“2.吞噬细胞的功能评价方法”的项目中说明的方法，对来自受试体的吞 噬细胞的功能进行评价，由此能够进行以下检测·评价。Α)可以检测·评价受试体是否罹患伴随吞噬细胞功能异常的疾病、疾病的进行度 和/或疾病的严重程度。B)可以检测·评价受试体的免疫功能的降低、亢进等变化或异常的有无和/或程度。C)可以通过评价药剂给予中和/或药剂给予后来自受试体的吞噬细胞的功能来 检测·评价药剂的效果。D)将吞噬细胞用于再生医疗时，可以作为细胞的品质评价的指标。
进行伴随吞噬细胞功能异常的疾病的检测·评价时，只要至少包含使用上述 “2.吞噬细胞的功能评价方法”的项目中说明的方法，而对来自受试体的吞噬细胞的功能进 行评价的工序即可，可以进一步包含将评价的结果与正常值进行比较的工序以及根据来自 受试体的吞噬细胞的功能与正常值相比为高值或低值而对疾病的有无和/或程度进行判 定的工序。此处，正常值可以使用通过预先求出来自没有罹患疾病的受试体、即正常受试体 的吞噬细胞的功能的测定结果，取该测定结果的平均值或范围等进行了标准化的值。比较 试样的测定值和正常值时，可以仅直接比较高低，也可以以正常受试体的平均值士2SD或 士 3SD为临界值，试样的测定值比临界值高或低时，判断存在吞噬细胞功能异常。另外，也可 以根据测定值的大·小的程度评价疾病的进行度和/或疾病的重症度。作为伴随吞噬细胞功能异常的疾病，例如可以举出尿毒症、血清调理素活性降低、 补体缺乏症、先天性吞噬能力无能综合症、慢性肉芽肿、髓过氧化物酶缺乏症、白血病、恶性 淋巴瘤、细菌性心内膜炎、糖尿病、肝硬化等。例如慢性肉芽肿是在嗜中性粒细胞的活性氧 的产生方面具有缺陷，因此是反复发生严重的细菌或真菌感染的先天性吞噬细胞功能异常 症。来自慢性肉芽肿患者的嗜中性粒细胞具有吞噬作用(异物摄入)，但不具有消化功能。 因此，通过利用胶乳珠摄入的检测无法检测出异常，但如果是以SCD14-ST产生为指标的吞 噬能力评价，则能够检测吞噬细胞功能异常。进行免疫功能的评价方法时，以进行前述伴随吞噬细胞功能异常的疾病的检 测·评价的情况为基准。吞噬细胞的功能、特别是吞噬是在生物体的免疫应答中最早启动 的重要生物体防御机制，吞噬细胞的功能异常即与免疫功能的异常相关。吞噬细胞的功能 异常也可以换言之为免疫功能。进行药剂效果的检测·评价时，只要至少包含对于药剂给予中和/或药剂给予后 的来自受试体的吞噬细胞，使用上述“2.吞噬细胞的功能评价方法”中的项目中说明的方 法，对吞噬细胞的功能进行评价的工序即可，进而可以包含将评价的结果与正常值和/或 药剂给予前的评价结果进行比较的工序、以及对药剂的给予所致的来自受试体的吞噬细胞 功能变化的有无和/或程度进行判定的工序。此处所称正常值是测定来自正常受试体的吞 噬细胞的功能的结果，如上述说明所述。给予免疫抑制剂、免疫激活剂、抗癌剂等时，可以通过检测药剂给予中和/或药剂 给予后的吞噬细胞功能的变化，来确认药剂是否有效地发挥作用、或药剂导致的副作用以 何种程度发生，能够得到对药剂选择或给予量的有用指标。另外，也可以以吞噬细胞的功能 变化的程度、即SCD14-ST产生量的变化的大·小为指标，评价药剂效果的程度。例如可以 在给予G-CSF前后，比较末梢血中的嗜中性粒细胞的吞噬能力，而对正常功能的嗜中性粒 细胞因给予G-CSF增加了何种程度进行评价。将吞噬细胞用于再生医疗时，进行细胞的品质评价的情况下，可以通过以 s⑶14-ST产生为指标测定所用吞噬细胞的吞噬能力，而对作为细胞是否具有正常的功能、 和/或、细胞的活性进行评价。此处所称再生医疗可以举出将来自自身的白细胞等在体外 培养·处理后，返回本人的自体细胞移植；以及将来自正常人志愿者的白细胞等移植给患 者的异体细胞移植等。制备移植用细胞后，为了检测该细胞是否保有一定的品质，可以使用 “2.吞噬细胞的功能评价方法”的项目中说明的方法。将制备的细胞的功能与基准值比较，如果满足基准值，则判断为能够使用的品质。基准值可以根据再生医疗的目的进行适当设 定，通常只要与正常吞噬细胞的吞噬能力进行比较即可。比基准值低时，可以判断在制备的 过程中丧失吞噬细胞的功能或细胞的活性，所以是不适合移植的品质。4.吞噬功能调节物质的筛选方法可以使用上述“2.吞噬细胞的功能评价方法”的项目中说明的方法，进行吞噬功 能调节物质的筛选。即，本发明提供特征在于包含下述工序的、吞噬功能调节物质的筛选方法。1)使吞噬细胞与待检物质接触的工序、2)对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST进行测定的工序、以及3)评价待检物质对吞噬细胞的吞噬能力的效果的工序。 需要说明的是，1)使吞噬细胞与待检物质接触的工序时，可以在吞噬物质的存在 下，使吞噬细胞与待检物质接触。吞噬功能调节物质是促进或抑制吞噬细胞的吞噬活动的物质。例如以已知的吞噬 功能抑制物质、即渥曼青霉素(Wortomanin)或细胞松弛素D (Cytochalasin D)为待检物 质，使其与吞噬细胞接触，测定由吞噬细胞产生的s⑶14-ST时，s⑶14-ST的产生量因待检 物质的添加而减少，可以确认吞噬抑制效果。同样地，可以以希望检验吞噬功能调节活性的 物质为待检物质，使其与吞噬细胞接触，以SCD14-ST的产生量为指标，评价对吞噬能力的 效果。5.与吞噬关联的疾病的检测方法本发明还提供与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病的检测方法。该检测方法测 定来自受试体的试样中包含的SCD14-ST，将该测定值与正常值进行比较，判定该试样中的 SCD14-ST的量与正常值相比是否为高值，可以检测受试体是否罹患与吞噬细胞引起的吞噬 相关联的疾病、疾病的进行度和/或疾病的严重程度。作为受试体，只要是哺乳类即可，没有特别限定，可以以人、猴、大鼠、小鼠、兔、牛、 猪、绵羊、山羊、马、狗或猫等哺乳类为对象。与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病是在患部发生由吞噬细胞引起的吞噬活动 的疾病。特别是发生伴随局部自身免疫反应或感染的吞噬的疾病。例如，作为例子，可以举 出自身免疫疾病、风湿性关节炎、乳腺炎、痛风、肾小球肾炎、溃疡性大肠炎、地中海热、中耳 炎、鼻炎、肺炎、结核、膀胱炎、羊水感染症或脓精液症等局部疾病。但本发明中排除伴随全 身性感染的疾病、败血症。作为试样，可以使用组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘 液、鼻涕、痰、尿、腹水、羊水、精液等体液、以及将鼻腔、支气管、肺、皮肤、腹腔、各种脏器、关 节、骨等清洗后的清洗液。但本发明中血液除外。s⑶14-ST的测定方法以前述2.吞噬细胞的功能评价方法中记载的方法为基准。作为正常值，可以使用通过预先求出来自没有罹患疾病的受试体、即正常受试体 的试样的测定结果，取该测定结果的平均值或范围等进行了标准化的值。来自正常受试体 的试样的测定值与测定体系的背景值大致同等时，可以使用通过设定测定体系中的背景值 的平均值或范围等进行了标准化的值。测定体系中的背景值是指不将试样而是将缓冲液或 分析溶液等添加到测定体系中时的测定值。比较试样的测定值和正常值时，可以直接比较高低，也可以以正常受试体的平均值+2SD或+3SD为临界值，试样的测定值比临界值高时，判断为阳性。另外，测定值越大，判断疾病的进行度和/或疾病的严重程度越高。试样中可以包含也可以不包含吞噬细胞。可以直接测定试样中的s⑶14-ST，评价 生物体内的吞噬程度、即疾病的有无和/或程度。理由之一是，在生物体内吞噬细胞进行吞 噬活动结果产生的s⑶14-ST存在于试样中。例如在关节炎模型动物中，可以通过测定关节 液或关节清洗液中的SCD14-ST，而诊断伴随关节处的炎症的疾病，具体为风湿性关节炎、变 形性关节症、肩周炎等。理由之一是能够检测关节液或关节清洗液中的SCD14-ST浓度上 升。另一方面，也可以检测作为试样的体液或组织清洗液中的吞噬细胞的有无和/或 量而对疾病的有无和/或程度进行评价。此时，只要在试样中添加吞噬物质，测定所产生的 s⑶14-ST即可。例如可以在乳汁中添加吞噬物质，测定所产生的s⑶14-ST，进行乳腺炎的 诊断。特别是对牛乳腺炎的检测有用。以上列举适宜的实施方式进行了说明，但本发明并不限于上述实施方式，当然可 以在不脱离本发明主旨的范围内由具有本发明所属技术领域的常识的人进行各种变更及 修正。实施例(实施例1)制作以合成肽为抗原的F1301-9-1抗体I-(I)制备作为抗原的肽为了使包含序列号5中记载的序列(相当于兔⑶14氨基酸序列的从40位 59位 的序列)的肽在N末端介由SH基而与载体蛋白结合，故在N末端插入半胱氨酸，使用肽合 成机ABI433A(Applied Biosystems)进行合成。通过常规方法进行精制，得到2 3mg精 制肽。1-(2)使用合成肽制备肽载体蛋白将I-(I)中制备的肽用蒸馏水溶解成10mg/mL，与10mg/mL的Imject Maleimide Activated Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH) (PIERCE)等量混合，在室温下反应 2 小时， 由此将肽和载体蛋白结合(以下记为序列号5的肽-KLH)。另外，将I-(I)中制备的肽 MM^yKMM！^ 10mg/mL, % 10mg/mL ^ Imject Maleimide Activated Bovine Serum Albumin(BSA) (PIERCE)等量混合，在室温下反应2小时，由此将肽和载体蛋白结合(记为序 列号5的肽-BSA)。1-(3)制作以合成肽为抗原的杂交瘤克隆为了制作对I-(I)中制备的肽的单克隆抗体，使用序列号5的肽-KLH将大鼠免 疫。即，将序列号5的肽-KLH各100 μ g用100 μ L的生理盐水稀释后，与100 μ L的弗氏完 全佐剂(DIFCO)等量混合。以每只各100 μ L将其给予8周龄雌性Wistar rat (日本SLC) 的足垫内。11日后，将IOOyg序列号5的肽-KLH用200 μ L的生理盐水稀释，再次给予足 垫内。进而，在3日后，由肠骨淋巴节分离淋巴细胞，将得到的淋巴细胞与Sp2/0-Agl4(ATCC CRL-1581)混合后，使用聚乙二醇，按安东民卫·千叶丈/著《単々口一 >抗体実験操作入 門》(讲谈社)中记载的方法进行细胞融合。由HAT培养基选择杂交瘤，1周后用ELISA法 选定产生目标抗体的杂交瘤。即，用0.076M磷酸缓冲液(pH7.4)(以下记载为D-PBS)将 序列号5的肽-BSA稀释至10 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到酶标板(Maxisorb、Nunc)中。在4°C下反应一夜后，用离子交换水清洗5次。在各孔中添加100 μ L包含2% Stabilgurd的 D-PBS (ρΗ7. 4)，进行封闭。然后，在各孔中添加杂交瘤的培养上清液，使其在37°C下反应1 小时后，用含0. 05% Tween20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白 抗体(DAKO)用含10%兔血清的D-PBS (pH7. 4)稀释至1000倍，在各孔中添加50 μ L。在 37°C下反应1小时后，同样地清洗3次。将TMB溶液(BioFX)添加到各孔中，在室温下反应 10分钟后，用0. 5M硫酸溶液终止反应。用平板分光光度计(NJ-2100、日本Intermed)测定 450nm的吸光度。选择确认了吸光度上升的孔的细胞，通过极限稀释法进行克隆。11日后 同样地进行筛选，得到产生与序列号5的肽反应的抗体的克隆F1301-9-1。1-(4)由杂交瘤培养上清液精制抗体

将1-(3)中得到的克隆F1301-9-1用SFM培养基(GIBCO)以3L规模进行培养。将 该培养上清液供于0.45 μ m的过滤器，除去细胞后，供于Protein G柱。然后，将吸附馏分 用酸洗脱，立刻添加1/10倍量的IM Tris-HCl (pH8. 0)，由此进行中和。将洗脱液用超滤膜 在生理盐水中进行缓冲液交换，得到精制抗体。(实施例2)以合成肽为抗原制作F1258-7-2抗体2-(1)制备作为抗原的肽为了使包含序列号6中记载的序列(相当于兔⑶14氨基酸序列的1位 30位的 序列)的肽在N末端介由SH基而与载体蛋白结合，故在N末端插入半胱氨酸，使用肽合成 机ABI433A (Applied Biosystems)进行合成。通过常规方法进行精制，得到2 3mg精制 肽。2-(2)使用合成肽制备肽载体蛋白基于1-⑵中记载的方法，制备序列号6的肽-KLH及序列号6的肽-BSA。2-(3)以合成肽为抗原制作杂交瘤克隆基于1_(3)中记载的方法，得到产生对2_(2)中制备的序列号6的肽的单克隆抗 体的克隆F1258-7-2。2-(4)由杂交瘤培养上清液精制抗体基于1-(4)中记载的方法，由对2_(3)中制备的序列号6的肽的杂交瘤克隆的培 养上清液精制单克隆抗体。(实施例3)制作兔s⑶14-ST测定体系为了制作能够特异性检测兔SCD14-ST的体系，使用实施例1_(4)、2_(4)中记载的 抗体制作夹层ELISA体系。3_(1)制作 F1258-7-2 的 Fab' -HRP为了制作F1258-7-2抗体的F(ab' )2，将实施例2_(4)中得到的精制F1258-7-2 抗体用P印sin处理。即，将精制F1258-7-2抗体在包含2M尿素的IOOmM乙酸缓冲液 (PH4.4)中进行缓冲液交换后，添加P印sin (Boehringer)至抗体酶=30 1(重量比)， 在37°C下反应6小时。在反应结束时添加IMTris缓冲液(pH8. 0)，使pH恢复至中性附 近。然后，进行F(ab' )2的精制。S卩，为了除去Fc部位和P印sin的目的，将经P印sin处 理的抗体供于Pros印G(Millipore),将吸附馏分进行酸洗脱。进而，通过将该吸附馏分 供于Superdex200 (Amersham)，除去未切断的抗体，得到F1258-7-2的F(ab' )2。将精制 后的F (ab ‘ ) 2供于SDS-PAGE以确认纯度，使用以牛血清IgG为标准品的Protein AssayDye Reagent(Bio-Rad)进行蛋白定量。接下来将得到的F1258-7-2F(ab ‘ )2抗体使用 Peroxidase Labeling Kit SH(同仁化学)进行部分还原，将存在于铰链部分的半胱氨酸残 基进行 Peroxidase 标记，由此制作 F1258_7_2Fab ‘ -HRP。3- (2)制作兔 SCD14-ST 夹层 ELISA 体系制作作为固相抗体使用实施例1_(4)中得到的F1301-9-1抗体、作为标记抗体 使用实施例3-(1)中制作的F1258-7-2 Fab' -HRP抗体的2步夹层ELISA体系。S卩，将 F1301-9-1抗体用D-PBS(pH7. 4)稀释至10μ g/mL，在酶标板(Maxisorb、Nunc)的各孔内添 加50yL。在4°C下反应一夜后，用离子交换水清洗5次。在各孔中添加200 μ L包含5% StabilGuard(SurModics)和 0. Tween20 的 D_PBS(pH7. 4)进行封闭。然后，将包含 5% 的正常兔血清(使用兔⑶14亲和抗体柱除去了可溶型⑶14抗原的血清)、1% BSA、0. 1% Tween20的150mM磷酸缓冲液(ρΗ6. 0)作为稀释液，将试样进行稀释制备，每孔添加50 μ L， 在25°C下反应3小时。反应结束后，用包含0.05% Tween20的生理盐水清洗5次。用包含 4%大鼠血清、0. 05% Tween20 的 75mM 磷酸缓冲液(pH6. 4)稀释 F1258-7-2 Fab' -HRP，在 各孔中添加50 μ L。在25°C下反应2小时后，同样地清洗5次。将四甲基联苯胺溶液(TMB、 BioFX)添加到各孔中，室温下反应15分钟。用0. 5M硫酸溶液终止反应，用平板分光光度计 (NJ-2100、日本Intermed)测定450nm的吸光度。作为标准物质，使用重组体兔s⑶14-ST。重组体兔s⑶14-ST的制作基于国际公 开W02005/108429号公报中记载的方法进行。即，制作在兔⑶14的第66个氨基酸序列后 导入了凝血酶切断位点的质粒，使用COS细胞，使其一过性地表达于培养上清液中。精制培 养上清液中的s⑶14后，用凝血酶切断，用凝胶过滤色谱精制重组体兔s⑶14-ST。制作的夹层ELISA体系如图1所示用量依赖性地检测重组体s⑶14-ST。(实施例4)用兔动物模型研究s⑶14-ST的产生4-(1)制作LPS负荷兔败血症模型LPS负荷兔败血症模型通过以10 μ g/kg的用量对新西兰白兔(1.8-2. 6kg、北山 labes)耳静脉内给予 LPS(Salmoella Minnesota Re595、SIGMA)进行制作。在 LPS 给予前 及给予1. 5小时后由耳廓动脉进行采血(加柠檬酸的血)。4- (2)制作兔活菌感染模型(CLP模型)兔CLP(盲肠结扎穿孔，cecal ligation and puncture)模型是对新西兰白 兔(1.8-2. 6kg、北山labes)进行外科手术制作的。即，将禁食一夜的动物耳静脉内给予 0. 35mg/kg Domitor (盐酸美托咪啶、明治制果)及5mg/kg动物用Ketalar (氯胺酮、三 共)，进行全身麻醉。切开腹部，将盲肠取出腹腔外后，将回盲部的下游用缝合线阻断，用眼 科剪切开约2cm宽的2处。边将盲肠用镊子压着，确认盲肠内容物从穿刺孔出来后，将盲肠 放回腹腔内，将腹膜及皮肤用缝合线缝合。合腹后，皮下给予50mL/kg生理盐水。另外，以 0. 35mg/kg耳静脉内给予Antisedan (盐酸阿替美唑、明治制果)，完成手术。在CLP模型制 作的手术前及手术2小时后由耳廓动脉进行采血(加柠檬酸的血)。4-(3)测定兔败血症模型的血中s⑶14-ST通过离心由实施例4_(1)和4-(2)中采集的血液制备血浆，基于实施例3-(2)所 述的方法测定s⑶14-ST。结果示于图2及图3。LPS负荷败血症模型没有确认血中s⑶14-ST 的上升(图2)。另一方面，活菌感染导致的败血症模型中观察到血中SCD14-ST的上升(图3)。另外，活菌感染导致的败血症模型的血中sCD14-ST的上升能在手术(感染)后2小 时检测到，确认了与IL-6或d- 二聚体等其他标记物相比，是在感染早期能够检测到的标记 物。由此，对于SCD14-ST产生，认为仅内毒素所致的白细胞活化并不充分，必要的是作为对 感染的最早免疫应答的白细胞导致的细菌的吞噬活动。(实施例5)使用兔腹腔渗出粒细胞的吞噬实验5-(1)采集兔腹腔渗出粒细胞将糖原用生理盐水溶解至0. 1%。将其150mL给予1. 64-1. 92kg雄性新西兰白色 兔(北山labes)的腹腔内。在给予16小时后，通过过度麻醉将兔安乐死后，用生理盐水清 洗腹腔内，采集粒细胞。5-⑵通过各种刺激剂产生SCD14-ST在粒细胞内添加各种白细胞刺激剂，评价SCD14-ST的产生量。即将实施例5_(1) 中采集的兔腹腔渗出粒细胞混悬在包含2%正常兔血清、2mM GlutaminUOmM HEPES的HBSS 缓冲液(GIBC0 14025)(以下称为细胞分析缓冲液)中使细胞浓度为1 X 107Cells/mL，在96 孔培养平板(Nunclon Surf ace. Nunc)的各孔中添加100 μ L。然后将各种刺激剂用细胞分 析缓冲液制备成目标浓度的3倍，在各孔中添加50 μ L。在37°C下培养2小时后，通过离心 采集上清液，在实施例3-(2)的测定体系中测定SCD14-ST。结果示于图4。引发白细胞所 致的吞噬·消化的刺激剂(大肠杆菌菌体或酵母聚糖)确认了 SCD14-ST的上升。另一方 面，LPS、PMA(佛波醇肉豆蔻酯乙酸酯、phorbol myristate acetate)、fMLP(甲酰甲硫氨酰 亮氨酰苯丙氨酸、formyl methionyl leucyl phenylalanine)等不引起吞噬的刺激剂没有 确认s⑶14-ST的上升。另外，发生吞噬但不被消化的微珠也没有确认s⑶14-ST的上升。进 而，使用高分子量sCD14测定用试剂盒(R&D)测定高分子量sCD14的产生时，如图5所示， 确认了 LPS或PMA所致的刺激使得高分子量s⑶14的产生上升。这表示s⑶14-ST和高分 子量s⑶14产生机制不同。5- (3)各种抑制剂对产生s⑶14-ST的作用实施例5_(2)中暗示兔s⑶14-ST的产生与粒细胞的吞噬活动有关。因此使用各 种吞噬抑制剂研究s⑶14-ST的产生和吞噬的关系。即，将实施例5-(1)中采集的兔腹腔 渗出粒细胞悬浮在细胞分析缓冲液中使细胞浓度为lX107Cells/mL，在48孔培养平板(48 Well Cell Culture cluster,Corning)的各孔内添加200 μ L。然后在各孔中添加100 μ L 将各种抑制剂用细胞分析缓冲液制备成目标浓度的3倍得到的液体。在37°C下反应30分钟 后，添加大肠杆菌至粒细胞的20倍量(大肠杆菌以1菌落形成单元为1个进行添加)。在 37°C下培养2小时后，通过离心采集上清液，使用实施例3-(2)的测定体系测定s⑶14-ST。 结果示于图6。抑制吞噬中的膜交通的PI3激酶抑制剂Wortomanin、通过使细胞骨架改性 抑制吞噬的肌动蛋白的脱聚合剂Cytochalasin D抑制了兔s⑶14-ST的产生。(实施例6)测定兔关节炎模型的关节液中的s⑶14-ST6-(1)甲基化BSA的制备将Ig BSA (SIGMA)溶解在 IOOmL 含 4% Paraformaldehyde 的 D-PBS (ρΗ7· 4)中，使 用碱将PH调整为8. 5后，在室温下反应1小时。然后，添加80mg硼氢化钠，在4°C下进行2 小时还原反应后，使用超滤膜，在D-PBS (pH7. 4)中进行缓冲液交换。6-⑵用ELISA确认免疫反应
采用ELISA法进行对抗原的免疫反应的确认。即，将甲基化BSA用D-PBS(pH7. 4) 稀释至10 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到酶标板(Maxisorp、Nunc)中。在37°C下反应1小时 后，用离子交换水清洗5次，在各孔中添加100 μ L包含5% StabilGuard(SurModics)的 D-PBS(ρΗ7. 4)，进行封闭。然后，将供于实施例6-(3)的试验的各兔的血液样品(血清)用 包含 1% StabilGuard(SurModics)的 D-PBS (ρΗ7. 4)稀释，在各 Well 中添加 100 μ L0 使其 在室温下反应1小时后，用包含0. 05% Teen20的生理盐水清洗5次。然后，将过氧化物酶 标记抗兔免疫球蛋白抗体(DAK0、P448)用含5%山羊血清的D-PBS稀释至1000倍，在各孔 中添加50 μ L0室温下反应1小时后，同样地清洗5次，将TMB溶液(BioFX)添加到各孔中。 室温下反应10分钟后，用0. 5Μ硫酸溶液终止反应，用平板分光光度计(MultiScan JX、大日 本制药)测定450nm的吸光度。6-(3)测定兔关节炎模型中的s⑶14-ST将SOOyL(Smg)实施例6_(1)中制备的甲基化BSA和500 μ L弗氏完全佐剂 (DIFCO)混合，将其给予10-11周龄雄性新西兰白色兔(北山labes)的背部皮下、后肢足底 部、大腿部肌肉内(以下记为抗原致敏组)。另外，同时对相同数量的兔给予没有加入甲基 化BSA的溶剂(以下记为溶剂对照组)。2周后，将500 μ L(5mg)甲基化BSA和500 μ L弗氏不 完全佐剂(DIFCO)混合，对抗原致敏组进行再致敏。需要说明的是，对溶剂对照组同样地给 予没有添加甲基化BSA的溶剂。进而，在1周后由兔耳动脉采血，通过实施例6- (2)的ELISA 法测定血中抗体效价，确认抗原致敏组中致敏成立。然后，将甲基化BSA用D-PBS (ρΗ7. 4) 制备成5mg/mL，将ImL给予抗原致敏组的膝关节腔内，诱发关节炎。同时对溶剂对照组将 I mL D-PBS(pH7. 4)给予膝关节腔内。在诱发4日后和10日后采集两组的膝关节腔内清洗 液，进行s⑶14-ST的测定，通过涂片分析血球组分。同时由耳廓动脉进行采血(加柠檬酸 的血)，测定血中的SCD14-ST。在涂片试样中，确认了抗原致敏组中大量粒细胞的聚集。另 夕卜，将膝关节腔内清洗液供于实施例3-(2)所述的SCD14-ST测定体系时，如图7所示，抗原 致敏组在抗原致敏后的4日后及10日后确认了 s⑶14-ST的上升。需要说明的是，10日后 也显示高值意味SCD14-ST因伴随关节炎的对自身组织的过度免疫反应导致的吞噬活动而 产生。另一方面，两组均没有确认血中s⑶14-ST的上升。(实施例7)伴随来自人的吞噬细胞的吞噬活动的s⑶14-ST产生7-(1)制备人末梢血粒细胞利用由正常人采集的末梢血，通过使用比重d = 1.077和(1= 1.119 二层的比重 离心法制备粒细胞馏分。7-(2)通过粒细胞的吞噬活动产生s⑶14-ST在粒细胞中添加各种白细胞刺激剂，评价s⑶14-ST的产生量。即，将实施例7_(1) 中采集的人末梢血粒细胞悬浮在包含10%正常人血清、2mM GlutaminUOmM HEPESUOng/ ml G-CSF 的 RPMI1640 培养基(SIGMA R8758)中，使细胞浓度为 0. 5X 107Cells/mL。以 100 μ L将其添加到96孔培养平板(Nunclon Surface、Nunc)的各孔中，在5%二氧化碳存 在下于37°C培养一夜。然后，将各种刺激剂用包含10%正常人血清、2mM GlutaminUOmM HEPES的HBSS缓冲液制备成1. 5倍浓度，以200 μ L添加到各孔中。在37°C下培养2小时后， 通过离心采集上清液，测定人s⑶14-ST。人s⑶14-ST的测定使用国际公开W02005/108429 号公报的实施例7-(3)中记载的测定试剂盒。即，特异性识别人SCD14-ST的、包含与包含人CD14的第53 68的氨基酸序列的肽结合的抗体(S68抗体)的夹层测定试剂盒。为了 制成夹层测定体系，作为另一种抗体，使用将与包含人CD14的第17 26的氨基酸序列的 肽结合的抗体(F1106-13-3)进行了过氧化物酶标记得到的抗体。如图8所示，与实施例5 同样地用吞噬刺激剂(大肠杆菌菌体或酵母聚糖)时确认了 SCD14-ST的上升，而用LPS或 微珠时没有确认到s⑶14-ST的上升。 7-(3)吞噬抑制剂对产生s⑶14-ST的作用研究吞噬抑制剂对人粒细胞导致的s⑶14-ST产生的作用。即，与实施例7-(2)同 样地将人末梢血粒细胞用96孔培养平板培养一夜。然后，将各种吞噬抑制剂用包含10% 正常人血清、2mM GlutaminUOmM HEPES的HBSS缓冲液制备成3倍浓度，以100 μ L添加到 各孔中。在37°C下培养1小时后，添加大肠杆菌至粒细胞的30倍量(大肠杆菌以1菌落 形成单元为1个进行添加)。在37°C下培养2小时后，通过离心采集上清液，使用国际公开 W02005/108429号公报的实施例7-(3)中记载的测定试剂盒，测定人sCD14_ST。结果，如图 9所示，与实施例5-(3)同样地，ffortomanin, Cytochalasin D抑制了 sCD14_ST的产生。7-(4)使用HL-60细胞的吞噬实验将HL-60细胞在DMSO存在下进行培养，使其分化成粒细胞，供于与实施例7-(2) 同样的实验。与实施例7-(2)同样地添加酵母聚糖或大肠杆菌时确认了 SCD14-ST的产生。需要说明的是，上述实施例为本发明的一个适宜的实施例，但并不限定其范围，在 不脱离本发明的主旨的范围内可以实施各种变形。
权利要求
1.吞噬细胞的功能评价方法，其特征在于，包含下述工序1)使吞噬细胞与吞噬物质接触的工序，2)对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST进行测定的工序，和3)将试样的测定值与标准值比较，而对吞噬细胞的吞噬活动的有无和/或程度进行判 定的工序。
2.方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的伴随吞噬细胞功能异常的疾病的检测 方法，其特征在于，包含1)通过权利要求1所述的方法而对来自受试体的吞噬细胞的功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值进行比较的工序，和3)根据来自受试体的吞噬细胞的功能与正常值相比为高值或低值而对疾病的有无和 /或程度进行判定的工序。
3.方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的免疫功能的评价方法，其特征在于，包含1)通过权利要求1所述的方法而对来自受试体的吞噬细胞的功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值进行比较的工序，和3)根据来自受试体的吞噬细胞的功能与正常值相比为高值或低值而对免疫功能的程 度进行判定的工序。
4.方法，其是利用对吞噬细胞的功能进行评价的药剂效果的评价方法，其特征在于，包含1)通过权利要求1所述的方法而对药剂给予中和/或药剂给予后的来自受试体的吞噬 细胞的功能进行评价的工序，2)将评价的结果与正常值和/或药剂给予前的评价结果进行比较的工序，和3)对药剂的给予所致的来自受试体的吞噬细胞的功能的变化的有无和/或程度进行 判定的工序。
5.吞噬功能调节物质的筛选方法，其特征在于，包含下述工序1)使吞噬细胞与待检物质接触的工序，2)对由吞噬细胞产生的s⑶14-ST进行测定的工序，和3)评价待检物质对吞噬细胞的吞噬能力的效果的工序。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在吞噬物质的存在下，使吞噬细胞与待检物 质接触。
7.与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病的检测方法，其特征在于，包含下述工序1)对来自受试体的试样(血液除外)中所包含的SCD14-ST进行测定的工序，2)将测定的值与正常值进行比较的工序，和3)对试样中的SCD14-ST的量与正常值相比是否为高值进行判定的工序。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在试样中添加吞噬物质后，对SCD14-ST进行 测定。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病为风湿性 关节炎，试样为关节液。
10.如权利要求7或8所述的方法，其中，与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病为乳腺炎，试样为乳汁。
11.用于评价含有S⑶14-ST的吞噬细胞的功能的标记物。
全文摘要
提供测定因吞噬细胞引起的吞噬活动而特异性产生的、具有适于测定的稳定性的液性因子sCD14-ST的、新颖且简便的吞噬细胞功能评价方法以及与吞噬细胞引起的吞噬相关联的疾病的检测方法。
文档编号C07K14/705GK102037359SQ20098011879
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年5月23日
发明者内藤克纪 申请人:持田制药株式会社