专利名称：：优化的串连细胞因子及其在诱导多能性干细胞中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
的干细胞研究，具体涉及串连的密码子优化的人源细胞因子，并将该细胞因子用于iPS细胞(inducedPluripotentStemcells)的诱导的技术。
背景技术：
：iPS(inducedPluripotentStemcells)技术作为一个新兴的技术解决了胚胎干细胞的来源的限制，并绕开了伦理的约束，为再生医学研究的提供了新的希望。早期的iPS使用0ct3/4，Klf4，Sox2与Myc组合或0ct3/4，Klf4，Nanog与Lin28组合。为了简化试验操作，提高iPS效率以及提高iPS的安全性，人们对iPS诱导技术方面进行了诸多改进，主要可以分为以下几个方面1)减少细胞因子个数。Myc和Klf有导致细胞癌变的特性，使用较少的细胞因子将会有更高的安全性。实验证明可以使用0ct3/4和Klf4(Kim，J.B.etal，Pluripotentstemcellsinducedfromadultneuralstemcellsbyr印rogrammingwithtwofactors.Nature454(2008)，646-50.该文献中文名为，使用两个重编程细胞因子从小鼠神经干细胞中诱导多能干细胞。)，或者单独使用0ct3/4诱导出iPS(Kim，J.B.，etal.0ct4-inducedpluripotencyinadultneuralstemcells.Cell136(2009)，411-9.该文献中文名为，0ct4在成体神经干细胞中诱导的多能性。)2)使用同一载体表达多个诱导因子。在做iPS诱导的过程中，同时转染或者感染多个诱导因子在实验操作上比较繁琐，特别使用质粒进行转染。多个研究小组使用串联的基因进行iPS诱导(Carey，B.W.，etal.R印rogrammingofmurineandhumansomaticcellsusingasinglepolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，157-62.该文献中文名为，用单个多顺反子载体重编程小鼠和人体细胞。Gonzalez,F.，etal.Generationofmouse—inducedpluripotentstemcellsbytransientexpressionofasinglenonviralpolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，8918-22.该文献中文名为，通过瞬时表达一个单个非病毒多顺反子载体来产生小鼠的iPS细胞。)。3)使用安全的非整合诱导方式。如腺病毒，质粒，和蛋白形式的外源诱导因子。由于腺病毒载体不整合到细胞的基因组并具有感染多种细胞的能力，人们用腺病毒进行iPS诱导，但是此种方法得到的iPS诱导效率较低(Stadtfeld，M.，etal.Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science322(2008)，945-9.该文献中文名为，产生非病毒整合的iPS细胞。)。这可能是由于腺病毒携带了太多的病毒基因所致。为了避免外源的细胞因子整合到细胞的基因组，人们也采取了多次转染质粒的方法来获得iPS细胞(0kita，K.，etal.Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science322(2008)，949-53.该文献中文名为，使用非病毒载体产生小鼠iPS细胞。)。为了彻底避免核酸引入，人们也开发了通过直接在细胞培养基中加入细胞因子蛋白来诱导iPS(Kim，D.，etal.Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsbydirectdeliveryofr印rogrammingproteins.CellStemCell4(2009)，472-6.该文献中文名为，直接使用重编程蛋白产生人iPS细胞。Li，W.，etal.Generationofratandhumaninducedpluripotentstemcellsbycombininggeneticr印rogrammingandchemicalinhibitors.CellStemCell4(2009)，16_9.该文献中文名为，综合使用基因重编程蛋白和化学抑制物产生大鼠和人iPS细胞。)，但是遇到同样的问题iPS细胞的诱导效率较低。4)结合辅助手段提高iPS效率。化学小分子药物丙戊酸(valproicacid(VPA))可以提高0ct3/4禾口Sox2的诱导效率(Huangfu，D.，etal.Inductionofpluripotentstemcellsbydefinedfactorsisgreatlyimprovedbysmall—moleculecompounds.NatBiotechnol26(2008)，795-7.该文献中文名为，小分子化合物可以大大提高固定因子的多能干细胞诱导过程。)使用MicroRNA也可以提高iPS的诱导效率(Judsonetal.，Embryonicstemcell—specificmicroRNAspromoteinducedpluripotency.NatBiotechnol27(2009)，459-61.该文献中文名为，胚胎干细胞特异的microRNA提高诱导效率。)。由此可见，iPS诱导技术呈现出多样性的特征。高效的iPS诱导系统是可以减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。在同一个质粒上表达多个基因的策略有多种1)使用多个启动子，每个启动子启动独立的编码框。这个策略的缺陷是由于不同启动子的启动能力不同，并且重复串联的相同启动子之间的相互干扰导致两个启动子的表达效率都降低。2)在一个启动子内部使用内部核糖体进入位点(IRES)元件表达两个基因。IRES容易导致串联的表达框中的第二个基因表达水平低于第一个基因。3)在融合蛋白的连接位点引入蛋白酶切位点，利用细胞内的蛋白酶将串联蛋白切割成单个的功能蛋白，但是细胞内的蛋白酶酶切不充分，这个策略是最不常用。能够在蛋白水平实现自我剪切的蛋白酶元件的发现为串联基因的发现提供了新的可能性。研究表明，一些正链病毒的基因组编码一个全长的融合蛋白，该融合蛋白没有活性。其中有一段2A短肽(18-22氨基酸)可以在融合蛋白中自我切割，产生单个独立的蛋白(参见如下文献SzymczakAL，WorkmanCJ，WangY，VignaliKM，DilioglouS，VaninEF，VignaliDA(2004)Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle'self-cleaving'2Ap印tide-basedretroviralvector.Naturebiotechnology22:589-594;该文献中文名为使用单个基于2A短肽'自剪切'的逆转录病毒载体可以在体内矫正多基因缺陷)。通过串联的2A序列可以实现多个基因的同时表达，其特点为，1)串联基因由同一个启动子转录产生单个长片段信使RNA(mRNA)用于表达融合蛋白，2)融合蛋白高效自我切割，切割后的蛋白可以行使其独立的功能，3)串联基因等物质的量表达，前后两个蛋白的表达量一致。
发明内容为了提高iPS的诱导效率，本发明提供了一种优化的串连细胞因子并将该细胞因子用于诱导iPS中。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。本发明所采用的细胞因子包含0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt，所述0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt的基因序列分另U如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。本发明使用人源0ct4，Sox2和Klf4基因，在优化的过程使用了人偏好的密码子，并去掉了潜在的内含子和外显子位点，我们称之为0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。优选的，所述0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因连接顺序由5'端到3'端依次为0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。优选的，所述优化的串连细胞因子还含有串联片段，所述串联片段为2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2所示。所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。所述优化的串连细胞因子为0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(命名为OKSopt)。其中，所述0ct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQIDNO:6、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:4禾PSEQIDNO:8所示。本发明还提供了一种将上述优化的串连细胞因子应用在诱导多能性干细胞中的方法。作为实验的对照，我们构建了基因子编码没有修改的原始基因序列，并且其连接方式与优化的序列保持一致，0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2命名为(OKS(N))。为了验证优化的OKS在iPS诱导方面的效率提高效果，我们选择相应的表达载体来携带这三个串联基因。优选的，选择逆转录病毒载体，特别是pMXs载体用于携带优化的串联基因，这是因为逆转录病毒载体可以在诱导了iPS细胞后可以有效的沉默。携带OKSopt的载体也包括腺病毒载体、慢病毒载体和质粒等其它多种形式的载体。本发明使用的构建的串联OKSopt序列可以提高iPS的诱导效率，高效的iPS诱导系统是可以减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。本发明使用的串联OKSopt序列可以潜在的应用于人，猴，猪，马，牛，羊，狗，小鼠，大鼠等诸多种属哺乳动物原代细胞的iPS细胞诱导。图1是本发明中的串联三个因子的酶切鉴定图；图2是本发明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)酶切鉴定图；图3是本发明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)质粒包装成为逆转录病毒后的表达鉴定图；图4是本发明所得到的iPS效率差异的统计图。具体实施例方式下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1:优化的诱导因子基因序列的获得根据人偏好的密码子编码，我们对四个细胞因子的编码序列进行了统计分析，在进行基因优化的同时，我们也去除了基因内部可能的内含子剪接位点，这个可以最大程度的保持mRNA的完整性，提高蛋白的表达水平。原始的编码序列与优化后的编码序列的差异见表l，表1所示为本发明中优化后与优化前序列使用的密码子差异比较。表1优化前后密码子差异分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>优化基因的序列见序列表，优化序列在商业化公司合成。连接到pMD18T-simple载体(TaKaRa公司，大连)上pT-0ct4opt-F2A-P2A，pT-Klf4opt，pT-Sox2opt。实施例2:密码子未优化细胞因子的T载体构建以0ct4(NCBI登录号为NM_002701.4)基因为模板，以h0ct4(1+20)HS与h0ct4(1077-22)BEI为引物，进行PCR，Tm=63°C;以Klf4(NCBI登录号为NM_004235.4)基因为模板，以hKlf4(l+20)HS与hKlf4(1410-25)BEI为引物，进行PCR，Tm=63°C;Sox2(NCBI登录号为NMJ)03106.2)基因为模板，以hSox2(1+25)HS与hSox2(951-22)BEI为引物，进行PCR，Tm=63°C。引物名称引物序列h0ct4(l+20)HSGGAaagctactagtATGGCGGGACACCTGGCTTCh0ct4(1077-22)BEIGATgaattctttaggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGCCChKlf4(l+20)HSGGAaagcttactagtATGGCTGTCAGCGACGCGCThKlf4(1410-25)BEIGATgaattctttaggatccAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGhSox2(l+25)HSGGAaagcttactagtATGTACAACATGATGGAGACGGAGChSox2(951-22)BEIGATgaattctttaggatccCATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG在构建过程中使用了复能公司高保真PCR反应试剂。引物序列如上。PCR反应体系的配制(50iU):Buffer(5X):10ii110XMgS04母液5iUd證(10ilM)1模板100ng引物(20iiM):0.5iU/条Ultr即fuTaq酶2UH20S50iilPCR反应条件步骤198°Clmin步骤298。C10sec步骤3Tm63。C30sec步骤472。C30sec步骤5回到步骤2共28个循环步骤672。C7min步骤616。ClhPCR产物经过纯化后，插入到pMD18T-simple载体(TaKaRa公司，大连)中，分别得到pT-0ct4，pT-Klf4与pT-Sox2。实施例3:串联因子的质粒构建优化OKSopt序列的构建按如下步骤进行步骤1:pT-0ct4opt-F2A-P2A经过Spel和BamHI酶切，回收质粒骨架，pT-Klf4opt也经Spel和BamHI酶切，得到Klf4opt基因片段，连接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A。步骤2:此质粒进一步经过NheI和EcoRI酶切，回收质粒骨架，pT-Sox2opt同样经过Nhel和EcoRI得到Sox2opt基因片段，连接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(简写pT-0KSopt)，酶切结果见图1，预期酶切后，得到的片段大小分别为3644bp，1760bp，932bp。图1中#1和#2分别为构建的两个独立的pT-0KSopt质粒克隆，由图1中#1和#2可知，酶切结果与预期一致，初步鉴定质粒构建正确。非优化hu0KS序列的构建步骤1:pT-0ct4opt-F2A-P2A经过Xbal和BglII酶切，回收质粒骨架，pT-0ct4也经Spel和BamHI酶切，得到0ct4基因片段，连接得到pT-0ct4-F2A-P2A。步骤2:pT-0ct4-F2A-P2A经过Spel和BamHI酶切，回收质粒骨架，pT-Klf4也经Spel和BamHI酶切，得到Klf4基因片段，连接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A。步骤3:此质粒进一步经过Nhel和EcoRI酶切，回收质粒骨架，pT_Sox2同样经过Spel和EcoRI得到Sox2基因片段，连接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2(N)(简写pT-0KS(N))。其酶切结果见图l，预期酶切后，得到的片段大小分别为3644bp，1760bp和932bp。图1中#7和#8分别为两个独立的pT-0KS(N)质粒克隆，由图1中#7和#8可知，酶切结果与预期一致，初步鉴定质粒构建正确。实施例4:逆转录病毒载体pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)的构建逆转录病毒载体质粒pMXs-Flag(Addgene公司)经过PmeI单酶切，酶切产物经过去磷酸化处理(NEB公司，具体参照说明书)。质粒骨架采用琼脂糖凝胶电泳回收。pT-0KSopt和pT-0KS(N)分别经EcoRV酶切，所得0KSopt和0KS(N)片段采用琼脂糖凝胶电泳回收，分别插入到线性化的平端pMX载体骨架，分别得到上述pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)质粒。图2A是pMXs-0KSopt的酶切图，pMXs-0KSopt经过BglII酶切后的预期片段大小为6791bp、1495bp，pMXs-0KSopt经过BamHI酶切的预期片段大小为5678bp、2608bp;由图2A可见，#2号克隆的样品酶切鉴定结果与预期结果一致，初步确定，pMXs-0KSopt质粒构建成功。图2B是pMXs-0KS(N)的酶切图，pMXs-0KS(N)经过HindIII和EcoRI酶切后，预期片段大小为4664bp、2588bp、921bp、116bp，pMXs-0KS(N)经过BamHI酶切的预期片段大小为4661、2596、1032bp;由图2B可见，#2，4，6为三管独立的pMXs-0KS(N)克隆样品，同时进行酶切，其酶切鉴定结果与预期结果一致，初步确定，pMXs-OKS(N)质粒构建成功。实施例5:逆转录病毒的包装与基因表达鉴定与小鼠iPS的诱导逆转录病毒的包装在293细胞中进行，按照标准的磷酸钙转染的方法得到，参见《分子克隆实验指南(第三版)》第16章。包装的病毒按照相同的剂量感染MEF小鼠胚胎成纤维细胞，48小时后，收集细胞。基因表达进行WesternBlot鉴定。使用抗0ct4和抗Sox2的抗体可以检测到基因的表达，结果见图3，图3是pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)质粒包装成为逆转录病毒后的表达鉴定图，图3中左边的图是检测0ct4的表达的比较结果图，右边的图是检测Sox2的表达的比较结果图。由图3可见，优化的0ct4和Sox2比非优化的0ct4和Sox2表达水平稍高。MEF小鼠成纤维细胞的iPS诱导操作参照文献(QinD，LiW，etal.DirectgenerationofES—likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.CellRes.17(2007):959-62.该文献中文名为，使用0ct4/Sox2/Myc/Klf4直接从未修饰的小鼠胚胎成纤维细胞中直接产生干细胞样细胞。)。iPS实验过程联合使用了表达Myc(Addgene公司)的逆转录病毒。得到的iPS克隆经过计数，其实验结果见图4，图4是iPS效率差异的统计图，该图表明优化的OKS可以明显地提高iPS效率。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表〈160>8〈210>1〈211>29〈212>F2APRT〈400>1ArgSerLyslieValAlaProValLysGinThrLeuAsnPheAspLeu151015LeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGlyPro25〈210>1〈211>22〈212>P2APRT〈400>2GlySerGlyAlaThrAsnPheSerLeuLeuLysGinAlaGlyAspVal151015GluGluAsnProGlyPro0089]200090]〈210>10091]〈211>870092]〈212>F2ADNA0093]〈400>30094]agatcteagattgtggcccctgtg朋gC3g0095]ggcgatgtggagtccaaccctggcccc0096]〈210>10097]〈211>660098]〈212>P2ADNA0099]〈400>40100]ggatccggcgccaccaacttctccctgctg0101]gggccc0102]〈210>10103]〈211>12860104]〈212>Hu0ct4opt-F2A-P2ADNA0105]〈400>50106]gatetc朋gctttctegaatggctggccat0107]cctggaggtgg￡lggCg￡ltggccctggaggt0108]tggctgtccttccagggcccccctggcggc0109]tctgaggtctggggcatccccccatgccct0110]tectgtggccctc朋gtgggagtgggactg0111]cctgagggcgaggctggcgtgggCgtggElg0112]tgC3C3gtg3cccctggcgctgtg朋gctg0113]gagtcccagg3C3tC朋ggCcctgcag朋g0114]C3g朋g3gg3tcaccctgggctecacccag0115]tttggc朋ggtcttctcccagaccaccatc0116]朋g朋catgtgcaagctgaggcccctgctg0117]gag朋cctgc郷卿tttgcaaggctgag0118]acctccattgag朋ccgcgtg郷ggc雄0119]cccaccctgcagcaaatctcccacattgcc0120]agggtctggttctgcaacagg3ggC卿3g0121]3ggg3gg3Ctttgaggctgctggctcccca0122]gcccctggcccccactttggcacccctggc0123]tcctctgtgccattccctgagggcg郷cc0124]tcccccatgcactccaacagatctaagatt0125]gacctgctgaagctggctggcgatgtggag0126]ggcgccaccaacttctccctgctgaagcag0127]gctagctaaagaattctaaagatatcaccctgaactttgacctgctg朋gctggct6087aagcaggctggcgatgtggaggag朋ccct6066ctggcctctgactttgccttctctcctcct60cctgaacctggCtgggtggElccccaggacc120cctggcattggccctggcgtgggccctggc180cctccatetgagttctgtggcggcatggcc240gtgccccagggcggcctggagacctcccag300tccaactctgatggcgcctcccctgagcca360g卿3gg卿agctggagcag朋ccctgag420gagctggagcagtttgccaagctgctg朋g■gctgatgtgggcctgaccctgggcgtgctg540tgcaggtttgaggccctgcagctgtccttc600C卿3gtgggtgg郷郷ctgac朋c朋t660accctggtgc3ggCC3gg朋g郷El卿gg720ctggag朋cctgttcctgcagtgccccaag780cagcagctgggcctggagaaggEltgtggtg840ggC3卿ggtcctcctctgactetgcccag■ttctctggcggccctgtctccttccccctg960tetggctccccccacttcacagccctgtec1020ttcccccctgtctctgtgaccaccctgggc1080gtggcccctgtg朋gcagaccctgaacttt1140tccaaccctggccccactegtgccggatcc1200gctggcgatgccctgggccc126012860128]〈210>10129]〈211>10800130]〈212〉Hu0ct4optDNA0131]〈400>60132]atggctggccatctggcctctgactttgcc0133]ggccctggaggtcctgaacctggctgggtg0134]ccccctggcggccctggcattggccctggc0135]cccccatgccctcctccatetgagttctgt0136]gg3gtggg3Ctggtgccccagggcggcctg0137]gtgggcgtggagtccaactctgatggcgcc0138]gctgtg朋gctggagaaggag朋gCtggElg0139]gccctgcaga郷ElgCtggElgcagtttgcc0140]ggctecacccaggctgatgtgggcctgacc0141]C3g3CC3CC3tctgcaggtttgaggccctg0142]aggcccctgctgC卿3gtgggtgg郷3g0143]tgc朋ggctgagaccctggtgcaggccagg0144]gtg3ggggC33CCtgg3g朋cctgttcctg0145]tcccacattgcccagcagctgggCCtggElg0146]gtcctcctct0147]gctggctccccattctctggcggccctgtc0148]ggcacccctggctetggctccccccacttc0149]g郷gcg郷ccttcccccctgtctctgtg0150]〈210>10151]〈211>14380152]〈212〉HuKlf4optDNA0153]〈400>70154]aagcttectegtetggctgtctctgatgcc0155]ggccctgctggC3ggg卿3gaccctgagg0156]gaggagctgtcccacatgaagaggctgccc0157]gctgctgccacagtggccacagacctggag0158]tccaacctggcccccctgccC￡lgg￡lggg￡lg0159]gacttcatcctgtccaactccctgacccat0160]tcctctgcctctgcctcctcctcctcctcc0161]tccacctgctccttcaccteccccatcagg0162]ggc織ggcggcggcctgctgtetggcagg0163]aacctggctg3C3tC朋tg3tgtctcccca0164]cctgagctggaccctgtctecatccccccc0165]3tgggC朋gtttgtgctgaaggcctccctg0166]tctgtgatctctgtctccaagggctcccctttctctcctcctcctggaggtggaggcgat60g3CCCC3gg3cctggctgtccttccagggc120gtgggccctggctctgaggtctggggcatc180ggCggCEltggcctectgtggccctcaagtg240gagacctcccagcctgagggcgaggctggc300tcccctgagccatgcacagtgacccctggc360cagaaccctg3gg3gtCCC3ggacatc朋g420朋gctgctga3gC3g朋g3ggatcaccctg■ctgggcgtgctgtttggcaaggtcttctcc540cagctgtccttc朋g朋catgtgc朋gctg600gctgac朋caatgag朋cctgcaggagatt660朋gagg朋gaggacctccattgag朋ccgc720cagtgccccaagcccaccctgC3gC3朋tC780朋gg3tgtggtgagggtctggttctgcaac840gactetgccc卿ggg郷Elctttgaggct■tccttccccctggcccctggcccccacttt960acagccctgtactcctctgtgccattccct1020accaccctgggctcccccatgcactccaac1080ctgctgccatccttctccacctttgcctct60caggctggcgccccc朋c朋C3ggtgg郷120cctgtgctgcctggcaggccatetgacctg180tctggcggcgctggcgctgcctgtggcggc2403C3g3gg3gttcaatgacctgctggacctg300ccccctgagtctgtggctgccacagtctcc360ccatcctcctctggccctgcctctgcccca420gctggc朋tgaccctggcgtggcccctggc■gagtctgcccCCCCCCCC3Ccgccccattc540tctggcggctttgtggctgagctgctgagg600cagcagccccagccccctggcggcggcctg660tctgcccctggctctgagtetggctcccca720gatggctcccatcctgtggtggtggcccca780tec皿tggcggcccccccaggacctgcccc皿gatc皿gcaggaggctgtctcctcctgc840acccatctgggcgctggcccccccctgtcc皿tggCC3C3ggcctgctgcccatgacttc■cccctgggcaggcagctgccatccaggacc3CCCCC3CCCtgggcctggagg郷tgctg960tcctccagggactgccatcctgccctgcccctgccccctggcttccatccccatcctggc1020ccc皿ctecccatccttcctgcctgaccagatgcagccccaggtgccccccctgcactac1080C3gg3gCtg3tgccccctggctcctgcatgcctgaggagccc皿gccc皿gaggggcagg1140aggtcctggcCC3gg朋g3ggacagccacccacacctgtgactetgctggctgtggc皿g12003cctecacc3agtcctcccatctgaaggcccatctgaggaCCC3C3C3ggCg3g皿gCC31260teccactgtg3Ctggg3tggctgtggctggaagtttgccaggtctgatgagctgaccagg1320cactec3gg33gC3C3C3ggccacaggccattccagtgcc3g皿gtgtg3cagggccttc1380tccaggtctgaccatctggccctgcacatgttggatccteaagaattc1438〈210〉1〈211〉973〈212〉HuSox2optDNA〈400〉8aagcttgctegcatgtec皿ratgatggagagccccctggcccccagcag60acctctggcggcggcggcggC皿CtCC3C3gctgctgctgctggcggc皿CC3g皿g皿C120tcccctgacagggtga卿ggcccatgaatgccttcatggtctggtcraggggcc卿gg180CCC3gg3g皿ccccaagatgcacaactctg3皿tctcc皿gaggctgggc240gctgagtggaagctgctgtctrattgatg3ggcc皿gagg300ctgagggcccggagcatcctgactec皿gt3C3ggCCC3gg3gg皿g3CC360皿gaccctgatg皿g朋ggacaagtecaccctgcctggcggcctgctggcccctggcggc420aactccatggcctctggcgtgggcgtgggcgctggcctgggcgctggcgtg雄c卿gg480atggactcctatgcccacatg皿tggctggtccaatggctcctectccatgatgcaggac540cagctgggct3CCCCC3gC3tcctggcctgaatgcccatggcgctgcccagatgcagccc600atgcaccgctatgatgtctctgccctgcagtecaactccatgacctcctcccagacctec660atg皿tggctcccccacctectccatgtcctectcccagcagggcacccctggcatggcc720ctgggctccatgggctctgtggtg皿gtctgaggcctcctcctccccccctgtggtgacc780tcctcctcccactcccgcgccccatgccaggctggcgacctgagggacatgatctccatg840tecctgcctggcgctgaggtgcctgagcctgctgccccatccaggctgcacatgtcccag■cacteccagtctggccctgtgcctggcacagccatcaatggcaccctgcccctgtcccac960atgte朋g朋ttc9730199]〈210>10200]〈211>340201]〈212>h0ct4(l+20)HS0202]〈400>90203]ggaaagctactagtatggcgggacacctggcttc0204]〈210>10205]〈211>41〈212>h0ct4(1077-22)BEI〈400>10gatgaattctttaggatccgtttgaatgcatggg卿gccc〈210>1〈211>35〈212>hKlf4(l+20)HS〈400>11gga朋gcttectagtetggctgtcagcgacgcgct〈210>1〈211>44〈212>hKlf4(1410-25)BEI〈400>12gatgaattctttaggatccaaaatgcctcttcatgtgtaaggcg〈210>1〈211>40〈212>hSox2(l+25)HS〈400〉13gg朋3gcttactagtatgteg卿CggElgC〈210>1〈211>41〈212>hSox2(951-22)BEI〈400>14gatgaattctttaggatcccatgtgtg卿ggggC3gtgtg权利要求一种优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子包含Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt，所述Oct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因序列分别如SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO8所示。2.根据权利要求l所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因连接顺序由5，端到3，端依次为0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt。3.根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子还含有串联片段，所述串联片段为2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。4.根据权利要求3所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。5.根据权利要求1所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述优化的串连细胞因子为0ct4opt_F2A_Klf4opt_P2A_Sox2opt。6.根据权利要求5所述的优化的串连细胞因子，其特征在于，所述0ct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQIDNO:6、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8所示。7.权利要求l-6之一所述的优化的串连细胞因子在诱导多能性干细胞中的应用，其特征在于，所述优化的串连细胞因子选用逆转录病毒载体作为其载体。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述逆转录病毒载体为pMXs载体。全文摘要本发明提供了一种优化的串连细胞因子及其将该细胞因子应用在诱导多能性干细胞中的方法。该细胞因子为Oct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2opt，其中，Oct4、F2A、Klf4、P2A和Sox2opt的基因序列分别如SEQIDNO6、SEQIDNO3和SEQIDNO7、SEQIDNO4和SEQIDNO8所示。F2A和P2A的基因序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。pMXs载体用于携带优化的串联基因。本发明使用的构建的串联细胞因子可以提高iPS的诱导效率，进而减少样本细胞的用量，简化实验操作，提高成功率，更加有利于iPS细胞在临床上的应用。文档编号C07K14/52GK101709084SQ20091019419公开日2010年5月19日申请日期2009年11月26日优先权日2009年11月26日发明者冯立强,李锋,秦大江,米盖尔·埃斯特班,裴端卿,谢海军,陈凌,陈捷凯申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院