专利名称：一种植物耐铅蛋白及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一个植物耐铅相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉
及利用该基因增强植物对铅毒害耐受的方法。
二背景技术：
重金属污染问题是当今世界所面临的重要难题之一。由于人类对重金属的开采、 冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如镉、铅、汞、钴等进入大气、水、土壤 中，引起严重的环境污染。重金属，特别是镉、铅、汞、铬等具有显著的生物毒性。它们在水 体中不能被微生物降解，而只能发生各种形态相互转化和分散、富集过程(即迁移)，并经 过食物链为人体摄取和积累。进入人体的重金属，尤其是有害的重金属，有的会在人体内积 累和浓縮，如果超过人体所能耐受的限度，可造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等 危害。所以提高作物对重金属的耐受和降低对重金属的吸收已经成为关系民生的大事，已 成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是 当前生命科学研究的热点。 拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究 领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其 它植物研究。因此，对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的 产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南 芥测序数据库(www.arabidopsis.org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是 国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3 亿个碱基对，2. 9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能 已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，发现了一些与植物相关的耐受重金属基因 的功能，如AtATM3， ACBP， AtPDRl， AtPDR12等。 面对日益严重的环境污染问题，寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的 功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥数据库公布的基因组序 列，MYB61(Atlg09540)是一个与气孔调节和种子黏液排出密切相关的基因，是拟南芥MYB 转录因子家族中的成员。申请人发现铅处理MYB61基因敲除植株表现为对铅耐受，这表明 该基因涉及铅耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，研究结果表明MYB61基因功能 缺失可以导致拟南芥中铅离子转运蛋白AtPDR12编码基因的表达增加从而使植株体内的 铅含量下降，进而表现对铅耐受。
三
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物耐铅及降低植物铅吸收的相关蛋白及其 编码基因。本发明所提供的植物耐铅及降低植物铅吸收相关蛋白的编码基因，名为 MYB61(AT1G09540)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列 之一的蛋白质
(1)序列表中的SEQ ID No :2 ; (2)将序列表中SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且与植物耐铅相关的蛋白质。
序列表中的序列2由366个氨基酸残基组成。 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基
酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 MYB61的编码基因也属于本发明的保护范围。MYB61的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一 ； (1)序列表中SEQ ID No :1的DNA序列; (2)编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸； (3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No :1限定的DNA序列杂交的核甘酸序 列； (4)与序列表中SEQ ID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。 序列表中的序列1由1498个碱基组成，其开放阅读框架(0RF)为自5'端第175 位至1275位碱基，编码序列SEQ ID No :2的蛋白质。 含有本发明MYB61的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增 MYB61中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物耐铅及降低植物中铅含量 的方法。 本发明所提供的增强植物耐铅及降低植物中铅含量的方法，是抑制植物中的上述 植物耐铅及降低植物中铅含量相关蛋白编码基因的表达。 抑制植物中的上述植物耐铅相关蛋白编码基因MYB61的表达可通过多种方法实 现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基 因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制MYB61表 达均可。 利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为耐铅。
本发明的MYB61基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核 苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进 行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素 酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可 以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪 草或苜宿等。携带有本发明MYB61基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物经组织培育成植株。 本发明的植物耐铅相关蛋白及其编码基因可为农作物耐铅育种和降低农作物中 的铅含量提供基因与技术的支持(保障)。 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
4四
图1为突变体myb61-l与野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有铅的 培养基上在正常光照培养条件下竖直2周的比较照片(A 1/2MS;B 500iiM Pb(N03)2;C 750 ii MPb (N03) 2 ;D根长;E鲜重)。 图2为突变体myb61-l和野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有铅的培 养基上在正常光照培养条件下竖直3周的比较照片(A 1/2MS;B 0.8mM Pb(N03)2)。
图3为突变体myb61-l和野生型植株在0. 5mM铅处理条件下铅含量的比较。
图4为突变体myb61-l和野生型植株在MS和0. 5mM铅处理条件下相关基因的表 达水平。
五具体实施例方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1 、 MYB61及其编码基因的获得 以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提 取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条 链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应20 iU反应体系，内含10 X PCR 缓冲液2iil，dNTPs(10mM)混合物0. 4 yl，引物1和引物2各2 yl， Tag酶(5U/yl) 0. 2 yl ， 其余加双蒸水至20 ii 1 。其中，引物1 :F 5， ATGGGGAGACATTCTTGCTGTTACA3，;引物2 :R 5' CTAAAGGGACTGACCAAAAGAGACG3'。在Life Express基因扩增仪上扩增先94。C预变性 5min，再94。C 30sec，55。C 30sec，72。C 60sec，共计35个循环，最后72。C延伸10min，将获得 的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体，得到含 有目的片段的载体pT-MYB61，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中 序列SEQ ID No :1的DNA序列，为MYB61的cDNA基因，由1498个碱基组成，其编码序列为 自5'端第175位碱基到第1275位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No :2的氨基酸残 基序列的蛋白质。 实施例2、培育耐铅的拟南芥 1 、 MYB61基因被敲除的纯合突变体MYB61的获得 从美国拟南芥种质资源中心获得了 T-DNA插入突变体种子(SALK_106556 ;
http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject type = germplasm&id =
4626493)。为鉴定MYB61基因被敲除的纯合突变体，播种SALK_106556种子并提 取单株植株DNA，以此为模板，用3对引物对其进行PCR扩增。其中，引物lLBbl : 5， -GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，，引物2 :MYB61-LP 5' -GAAATTTAAATTTGGCTCTGTTTG-3，， 引物3 :MYB61-RP 5'-TTCACTCTGCTCGATGATTCC-3'。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果， 获得MYB61基因被敲除的纯合突变体myb61-l。从表型来看，该突变体与野生型(WT)植株 在正常生长条件下没有显著差异(图1A)，用该基因的cDNA序列构建35S强动子的过表达 载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型，在铅胁迫条件下也恢复了野 生型植株症状，证实了该基因确实控制铅耐受性。
2、myb61-l与野生型植株的耐铅性比较
将野生型(WT)与myb61-l同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加铅和 不加铅的固体培养基，垂直培养或者水平培养置于22t:恒温光照(光周期为16小时光照， 8小时黑暗)培养。培养14天后，可以观察到在正常培养基上生长的WT和myb61-l在 表型、鲜重、根长方面均无显著差异。在植株直接点种或者移栽后在含有镉的培养基上培 养，myb61-l都表现出明显的铅耐受性状。在500iiM Pb (N03) 2， 750 y M Pb(N0》J办迫下， myb61-l的鲜重和根长明显比WT高。上述结果表明，myb61-l较WT明显耐受铅毒害。
3、myb61-l与野生型植株的铅积累比较 对铅处理的WT和myb61-l植株体内的铅含量进行测定，发现myb61-1植株体内铅 积累明显低于WT。 4、铅胁迫下myb61-l与野生型植株相关基因表达比较 对铅处理的WT和myb61-l植株体内的相关基因表达水平进行测定，发现myb61-1 植株体内AtPDR12基因的表达明显高于WT，而其他基因GSH1等的表达则没有明显差异，表 明myb61植株对铅积累可能与AtPDR12基因的激活有关。
序列表 序列表1 SEQ ID No :1 (Nucleotide Sequence, Sequence Length(bp) :1498)1TCATTATCTCTTCCTTTTTTTCATTAGATTCCATTAACCTTCAAAAGTTT51TTCTAATACATTCTCTCTGCTCACAACTTTTTTTTCTTTCAATACTTGTA101AAGAAAAAATAGAGCTTTCTTCTTCTTCTCTTTTACTGTTAGCTTTGCAC151AGCATTGCAGCTGTGAATAACTAAATGGGGAGACATTCTTGCTGTTACAA201ACAAAAGCTGAGGAAAGGGCTTTGGTCTCCTGAAGAAGACGAGAAGCTTC251TTACTCACATCACCAATCACGGCCATGGCTGCTGGAGCTCTGTCCCTAAA301CTCGCTGGTTTGCAGAGATGTGGGAAGAGTTGTCGACTAAGATGGATCAA351TTACTTGAGACCTGATTTAAAGAGAGGAGCTTTTTCTCCTGAAGAAGAGA401ATCTCATCGTCGAACTTCATGCCGTCCTTGGAAACAGATGGTCACAGATT451GCGTCAAGGCTTCCGGGTAGAACCGACAACGAGATCAAGAATCTATGGAA501CTCAAGCATCAAGAAGAAACTGAAACAAAGAGGCATTGACCCAAACACAC551ACAAGCCCATCTCTGAAGTTGAGAGTTTTAGCGACAAAGACAAACCAACA601ACAAGCAACAACAAAAGAAGCGGTAACGATCACAAGTCTCCTAGTTCCTC651TTCTGCGACTAACCAAGACTTCTTCCTCGAAAGGCCATCTGATTTATCCG701ACTACTTCGGATTTCAGAAGCTTAACTTCAACTCCAATCTAGGACTCTCT751GTTACAACTGATTCTTCACTCTGCTCGATGATTCCGCCGCAGTTTAGCCC801CGGGAACATGGTTGGTTCTGTCCTTCAGACACCAGTATGCGTAAAGCCCT851CGATTAGTCTTCCTCCCGACAACAACAGTTCGAGTCCTATCTCCGGAGGA901GATCATGTGAAATTGGCTGCACCAAACTGGGAATTTCAGACAAACAACAA951TAATACCTCAAATTTCTTCGACAATGGCGGATTCTCATGGTCTATCCCAA1001ATTCTTCTACTTCTTCTTCACAAGTCAAACCAAATCATAACTTCGAAGAA1051ATAAAATGGTCAGAGTATTTGAACACACCGTTCTTCATAGGGAGTACTGT1101ACAGAGTCAAACCTCTCAACCAATCTACATCAAATCAGAAACAGATTACT
1151TAGCCAATGTTTCAAACATGACAGATCCTTGGAGCCAAAACGAGAACTTG1201GGCACAACTGAAACTAGTGACGTGTTCTCCAAGGATCTTCAGAGAATGGC1251CGTCTCTTTTGGTCAGTCCCTTTAGCTTTTTTCTTTCTTTCTTTCTTATT1301TCTAACAGATGTAGAGAACATAAAGATATACAAATACATACAATGTCAAT1351ACGTACAGTGGATTTAAGTGTTCTGTATATTTCATGGGCGAGCTGTCTTT1401ATTTTTATGTTTATTTTTGAAGCGTGTTTTATACGTCAAAGATTCTTCTT1451TCTTTTGCAAAACCTTTCAGTATCATACTAAATACTTTTGTTTTTGTT序列表2 SEQ IDNo :21MGRHSCCYKQKLRKGLWSPEEDEKLLTHITNHGHGCWSSVPKLAGLQRCG51KSCRLRWINYLRPDLKRGAFSPEEENLIVELHAVLGNRWSQIASRLPGRT101DNEIKNLWNSSIKKKLKQRGIDPNTHKPISEVESFSDKDKPTTSNNKRSG151NDHKSPSSSSATNQDFFLERPSDLSDYFGFQKLNFNSNLGLSVTTDSSLC201SMIPPQFSPGNMVGSVLQTPVCVKPSISLPPDNNSSSPISGGDHVKLAAP251丽EFQTNNNNTSNFFDNGGFSWSIPNSSTSSSQVKPNHNFEEIKWSEYLN301TPFFIGSTVQSQTSQPIYIKSETDYLANVSNMTDPWSQNENLGTTETSDV351FSKDLQ薩VSFGQSL
权利要求
一种植物耐铅蛋白，其特征在于氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No2所示。
2. 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于SEQ ID No :2的氨基酸残基序列包括不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。
3. 由权利要求1所述的植物耐铅蛋白的编码基因，其特征在于选自下列核苷酸下列之一 (1) 序列表中SEQ ID No :1的DNA序列;(2) 编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸。
4. 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于在高严谨条件下与SEQ ID No:l限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于与SEQ ID No :1限定的DNA序列具有90 %以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6. 由权利要求3所述的编码基因增强植物耐铅与降低铅积累的方法，其特征在于抑制植物中耐铅与降低铅积累相关蛋白编码基因的表达。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于抑制植物中耐铅与降低铅积累相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者siRNA介导的基因沉默方法。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐铅蛋白及其编码基因与应用。植物耐铅蛋白是序列表中SEQIDNo2，其编码基因是序列表中SEQ ID No1DNA序列。本发明利用该耐铅蛋白的编码基因增强植物对铅的耐受性，为农作物耐铅育种和降低农作物的铅积累提供基因与技术支持。
文档编号C07K14/415GK101724030SQ20091018508
公开日2010年6月9日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者任永兵, 吕申超, 孙佳佳, 孙泽华, 宗凯, 文辰, 曹树青, 江力, 汪洋, 袁怀波 申请人:合肥工业大学