专利名称：一种提纯假单胞菌酸a的方法
技术领域：
本发明涉及一种提纯假单胞菌酸A的方法。
技术背景用假单胞菌菌株发酵，可合成以假单胞菌酸A为主的抗生素多化学成分，除假 单胞菌酸A外，其它成分用字母B-D命名[E.B. Chain, G. Mellows, J, Chem. Soc. Perkin Trans L 318(1977); J. P. Clayton et aL ， Tetrahedron Lett., 21,881(1980); P. J. 0. Hanlon， N. H. Rogers, J. Chem. Perkin Trans 1.2665(1983)]。假单胞菌酸A是一种氨基酰转氨酶抑制剂类抗生素，能特性地结 合到细菌的异亮氨酸转移RNA合成酶，从而能抑制细菌中含异亮氨酸蛋白质的合成; 对对抗各种革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌以 及甲莫西林耐性菌等，具有较高的医疗价值，早已被临床应用，其商品名为百多邦 或莫匹罗星软膏。以前，从液体混合物的抗生素复合成分中提取分离假单胞菌酸A基本有两种方 法，为液-液提取和液-固提取。液-液提取主要有德国专利(2227739)、比利时专利(870， 855)和美国专 利(4222942、 4289703和6254921)。这些专利是先用碱调节发酵液pH值，通过 离心、过滤等除去菌体等，然后再用酸调节pH值，用与水不溶或微溶的溶剂(如 甲基异丁基甲酮(MIBK))提取，往得到的提取液中再加入极性更小的溶剂沉淀结 晶。得到粗品后，再做成衍生物，色谱层析纯化获得成品。日本专利(52-70083) 先用液-液提取方法得到粗品，后用DEAE-S印hadex阴离子交换树脂交换，甲醇-氨 水解吸方法，再处理得到纯品。液-固提取主要为阿尔法马股份公司申请了一种提纯莫匹罗星的方法的国际 专利(W02006/087237)包括中国专利(200680005554.4)。该方法是通过调节发 酵液的pH值，用在10， 000g下(5°C)离心机离心分离获得清溶液，或用过滤/超 滤方法获得清溶液，再调节溶液的pH值，离心，得到凝胶状固体。液-液提取方法操作烦琐，需要大量有机溶剂，从生态、环保和经济角度方面 有缺陷；液-固提取比液-液提取有一定改善，但在工业规模方面有不少难度。4发明内容本发明的目的在于提供一种提纯假单胞菌酸A的方法，利用该方法提取到的假 单胞菌酸A的纯度达98%以上。本发明提供的提纯假单胞菌酸A的方法，包括以下步骤1) 吸附将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附；2) 解吸用溶剂从步骤l)的树脂上解吸出含有假单胞菌酸A的解吸液；3) 将步骤2)得到的含有假单胞菌酸A的解吸液处理，得到假单胞菌酸A。 上述步骤l)中的含有假单胞菌酸A的溶液是下述a) 、 b) 、 c)和d)物质中的任意一种a) 含有假单胞菌酸A的发酵液；b) 步骤a)的发酵液经过过滤或超滤得到的滤液；c) 步骤a)的发酵液经过离心得到的上清液；d) 含有假单胞菌酸A的水溶液。上述步骤l)中的树脂是大网格树脂(大孔吸附树脂)，如AB-8， S-8， SP825， DIAI0N HP20， DlOl， D141, ADS-4， DM-130。步骤l)中的吸附为静态吸附或动态吸附；所述静态吸附是所述a)物质与所 述树脂混合，进行吸附；所述动态吸附是所述b) 、 c)或d)物质流动通过所述树 脂，进行吸附。上述吸附的条件均为pH值是2.5-7.2，优选pH值是4.6-7.0。调节pH值的酸 可以是有机酸或无机酸，例如乙酸、丙酸、柠檬酸、盐酸或硫酸。所述步骤2)中的溶剂与所述步骤l)中的假单胞菌酸A的比例是(2. 5-5) ml: (20-25) mg，优选比例是(3-4) ml: (21-22) mg。所述步骤2)中每升的溶剂由以下组份组成200-700ml的水溶性有机溶剂、 10-100 g的盐，其余为水。所述水溶性有机溶剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的至少一种物质；所述盐选自氯 化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸铵、甲酸钠、甲 酸钾、甲酸铵、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至少一种物质。所述步骤3)中，解吸液的处理包括以下步骤I)将所述解吸液通过步骤①或②制备假单胞菌酸A的有机溶液①将所述解吸液先离心，再将离心的沉淀溶于有机溶剂，然后用干燥剂干燥，得到假单胞菌酸A的有机溶液；②将所述解吸液直接通过有机溶剂萃取，然后用干燥剂干燥，得到假单胞菌酸 A的有机溶液；II)结晶将步骤I)的假单胞菌酸A的有机溶液浓縮，然后搅拌或在4'C下 静置，使得假单胞菌酸A结晶出来，得到假单胞菌酸A。上述步骤I)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或甲基异丁基甲酮；所 述的干燥剂是无水硫酸钠；所述离心的条件是4000rpm-5000rpm的转速，25-30°C 的温度。上述步骤II)中的浓縮为减压浓縮，所述减压浓縮的条件是温度在48。C以下， 优选45。C以下，压强为-O. 1至-0. 05Mpa，优选为-O. 08MPa。在上述步骤I)之前，可将解吸液先进性浓縮，该浓縮为减压浓縮，所述减压 浓縮的条件为温度在48。C以下，优选45。C以下，压强为-0. 1至-O. 05MPa，优选 -0.08MPa;本发明的另一目的在于提供所述的提纯假单胞菌酸A的方法在制备抑制革兰氏 阳性菌的药物中的应用。采用本发明提供的方法提取到的假单胞菌酸A的回收率可达79%，纯度可达98% 以上。本发明用树脂提纯假单胞菌酸A (莫匹罗星)的方法在生态、环保、经济和 工业规模生产方面均有明显的优点。
图1是实施例1中的假单胞杆菌酸A晶体HPLC检测谱图，A:保留时间 7.812min的峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。 实施例l.提纯假单胞菌酸A一、将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附以及从树脂中解吸出 1、含有假单胞菌酸A的发酵液的制备将假单胞杆菌酸A的产生菌荧光假单胞杆菌尸./7wrew朋s接入含3. 5L无菌 种子培养基的5L种子罐中，然后在深层通气搅拌培养10-12h至菌体浓度达到0D60。nm6为4. 8-5. 2，然后在无菌条件下，将该种子培养液转入装有30L无菌发酵培养基的 50L发酵罐中，进行假单胞菌酸A发酵培养至96-110hr，发酵终期采用高效液相色 谱法(HPLC)测定发酵液中假单胞杆菌酸A含量(2300-2600mg/L)。其中所提到 HPLC检测条件为色谱柱Diamonsil C18 250X4. 6mm 5 u m ;检测器紫夕卜230nm; 流动相0.5% NH3H2P04/乙腈 (60: 40);流速1.0 ml/min;柱温25°C;进样 量20uL。除特殊说明外，以下所涉及的HPLC检测条件均与此相同。2、 吸附取上述所得发酵液(假单保杆菌酸A浓度为2439mg/L) 25L，用1M NaOH调节 pH到中性，高速低温离心机在4500rpm和25。C下离心20分钟得清液，残渣水洗后 弃去。清液用1M HC1调节pH到4. 0过AB-8树脂(已处理好，2. 2 L)柱吸附。 其中，AB-8树脂的预处理方法为按照生产厂提供的说明书要求处理。完毕，用去离 子水洗柱到流出液为近无色。3、 解吸用乙醇+盐+水组成的溶剂8.3 L (该8.3L溶剂中乙醇3320ml，氯化胺410g， 其余为水)从树脂上解吸出含假单胞菌酸A的解吸液，所用的乙醇+盐+水组成的溶 剂与假单保杆菌酸A的比例是3.0ml: 22mg。解吸指标经HPLC检测，收集到的解 吸液中的假单胞菌酸A含量达70%，回收假单胞菌酸A达90%。二、提纯得到假单胞菌酸A将步骤一得到的解吸液，在43'C左右，减压(-0.08 MPa)浓縮得到液态油状物。该油状物用高速低温离心机5000rpm、 25'C条件下离心20分钟，分去水液，得 到凝胶状固体。凝胶状固体用乙酸乙酯溶解，无水硫酸钠干燥。然后将干燥过的含假单胞菌酸A的乙酸乙酯溶液过滤，在43i:左右，减压 (-0.07MPa)浓縮至100ml。继续搅拌，析出沉淀。沉淀置4'C冰箱冷藏，过夜继 续结晶。过滤，滤饼用洗涤液[乙酸乙酯石油醚(8: 20)]洗涤，固体于45。C以 下真空干燥。母液浓縮至l/3后，置冰箱再次结晶。经HPLC检测，假单胞菌酸A 回收率达79%，含量达98. 2% (图l)。其中，回收率是用最后所得假单胞杆菌酸A 的总量除以发酵液中假单胞杆菌酸A的总量；对于发酵中假单胞杆菌酸A的总含量 可以通过假单胞杆菌酸A的浓度乘以所用发酵液的体积来计算得出。实施例2.提纯假单胞菌酸A一、 将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附以及从树脂中解吸出 将假单胞菌通过已知方法培养，得到含有假单胞菌酸A的发酵液。取发酵液(假单胞杆菌酸A浓度2510mg/L) 25L，用1M HC1调节pH到5. 0，加入SP825树脂(已 处理好，2.5L)，其中，SP825树脂的预处理方法为按照生产厂提供的说明书要求 处理。搅拌30分钟。水漂洗去残渣，用60目筛捞出树脂，装柱，以实施例l提供 的方法解吸，其中解吸用的溶剂为11.9 L的乙醇+盐+水组成的溶剂，该11.9L溶 剂中含有乙醇6000ml、 850g的乙酸钠，其余为水。该乙醇+盐+水组成的溶剂与假 单胞菌酸A的比例是4ml: 21mg。回收假单胞菌酸A约85%。二、 提纯得到假单胞菌酸A将步骤一得到的解吸液，在43'C左右，减压(-0. lMPa)浓縮得到液态油状物。 该液态油状物加入同体积的乙酸乙酯在提取器中提取二次，每次静置分层后分去水 相，合并乙酸乙酯提取液，弃水相。乙酸乙酯提取液用占其l/2体积的去离子水洗 二次，每次静置分层后分去水相，弃去。乙酸乙酯提取液用无水硫酸钠干燥。然后将干燥的乙酸乙酯溶液过滤，在43。C左右，减压(-0. lMPa)浓縮至100ml。 继续搅拌析出沉淀。沉淀置冰箱冷藏，过夜继续结晶。过滤，滤饼用洗涤液[乙酸 乙酯石油醚(8: 20)]洗涤，固体于45t:以下真空干燥。母液浓縮至l/3后，置 冰箱再次结晶。经HPLC检测，回收率达79.3%，含量为98.4%。实施例3.提纯假单胞菌酸A一、将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附以及从树脂中解吸出 将假单胞菌通过已知方法培养，得到含有假单胞菌酸A的发酵液。取发酵液(假 单胞杆菌酸A浓度2490mg/L, ) 25L,用1M NaOH调节pH到中性，高速低温离心机 离心(离心的转速和温度分别是5000rpm和25°C) 20分钟得清液，残渣水洗后弃 去。清液用1M HCl调节pH值到4.8，过D101树脂(已处理好，3.0 L)柱吸附。 完毕，用去离子水洗柱到流出液为近无色。用9. 9 L的丙酮+盐+水组成的溶剂解析，该9. 9L溶剂中含有3000ml丙酮、300g 的氯化钠，其余为水。该丙酮+盐+水组成的溶剂与假单胞菌酸A的比例是3.5ml: 22mg。解吸指标经HPLC检测，收集到的解吸液中的假单胞菌酸A含量在70。/。以上， 回收假单胞菌酸A达81呢。二、提纯得到假单胞菌酸A该步骤二与实施例1相同，经HPLC检测，回收率达78. 8%,含量为98. 1%。 实施例4.提纯假单胞菌酸A一、 将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附以及从树脂中解吸出 将假单胞菌通过已知方法培养，得到含有假单胞菌酸A的发酵液。取发酵液(假单胞杆菌酸A 2408mg/L) 25L，用1M HC1调节pH到4. 8，加入D101树脂(已处理 好，3.6 L)，搅拌30分钟。水漂洗去残渣，用60目筛捞出树脂，装柱，以实施 例1提供的方法解吸，回收假单胞菌酸A约85%。二、 提纯得到假单胞菌酸A该步骤二与实施例2相同，经HPLC检测，回收率达79. 1%，含量为98.21%。
权利要求
1、一种提纯假单胞菌酸A的方法，包括以下步骤1)吸附将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附；2)解吸用溶剂从步骤1)的树脂上解吸，得到含有假单胞菌酸A的解吸液；3)将步骤2)得到的含有假单胞菌酸A的解吸液处理，得到假单胞菌酸A。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的含有假单胞菌酸A的溶液是下述a) 、 b) 、 c)和d)中的任意一种a) 含有假单胞菌酸A的发酵液；b) 步骤a)的发酵液经过过滤或超滤得到的滤液；c) 步骤a)的发酵液经过离心得到的上清液；d) 含有假单胞菌酸A的水溶液。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤l)中的树脂是大网格树脂。
4、 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述吸附为静态吸附或动 态吸附；所述静态吸附是所述a)物质与所述树脂混合，进行吸附；所述动态吸附是 所述b) 、 c)或d)物质流动通过所述树脂，进行吸附。
5、 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述吸附的条件均为pH值 是2. 5-7.2，优选pH值是4. 6-7. 0。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的溶剂与所述步骤 1)中的假单胞菌酸A的比例是(2.5-5.0) ml: (20-25) mg，优选比例是(3-4) ml:(21-22) mg;所述步骤2)中每升的溶剂由以下组份组成200-700ml的水溶性有机 溶剂、10-100 g的盐和其余为水；所述水溶性有机溶剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的至 少一种物质；所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸 钙、硫酸铵、甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵中的至少一种物质。
7、 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，解吸液的 处理包括以下步骤I)将所述解吸液通过步骤①或②制备假单胞菌酸A的有机溶液① 将所述解吸液先离心，再将离心的沉淀溶于有机溶剂，然后用干燥剂干燥，得到假单胞菌酸A的有机溶液；② 将所述解吸液直接通过有机溶剂萃取，然后用干燥剂干燥，得到假单胞菌酸A 的有机溶液；II)结晶将步骤I)的假单胞菌酸A的有机溶液浓縮，然后搅拌或在4'C下静 置，使得假单胞菌酸A结晶出来，得到假单胞菌酸A。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤I)中的有机溶剂为乙酸 乙酯、乙酸丁酯或甲基异丁基甲酮；所述的干燥剂是无水硫酸钠；所述离心的条件是 20-3(TC的温度下，4000-5000rpm转速；所述步骤II)中的浓縮为减压浓縮，所述减 压浓縮的条件是温度在48。C以下，优选45。C以下，压强为-O. 1至-0. 05MPa，优选为 -0, 08MPa。
9、 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述步骤I)之前，解吸液先 进性浓縮，该浓縮为减压浓縮，所述减压浓縮的条件为温度在48"C以下，优选45'C 以下，压强为-0. 1至-0. 05MPa，优选为-0. 08MPa。
10、 权利要求1-9任一所述的提纯假单胞菌酸A的方法在制备抑制革兰氏阳性菌 的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种提纯假单胞菌酸A的方法。该方法包括以下步骤1)吸附将含有假单胞菌酸A的溶液用树脂吸附；2)解吸用溶剂从步骤1)的树脂上解吸出含有假单胞菌酸A的解吸液；3)将步骤2)得到的含有假单胞菌酸A的解吸液处理，得到假单胞菌酸A。采用本发明提供的方法提取到的假单胞菌酸A的回收率可达79％，纯度可达98％以上。本发明用树脂提纯假单胞菌酸A(莫匹罗星)的方法在生态、环保、经济和工业规模生产方面均有明显的优点。
文档编号C07D407/00GK101591333SQ20091008848
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者乔瑞颖, 王大然, 王雅婷 申请人:北京博尔莱生物技术有限公司