专利名称：：人禽流感特异性免疫球蛋白及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种人禽流感特异性免疫球蛋白，其制备方法、使用方法及用途。
背景技术：
：20世纪曾经出现过三次世界范围流感大流行。1918年"西班牙流感"是由H1N1亚型引起，造成全球死亡人数超过4000万，是人类历史上流感死亡病例最多的一次；1957年"亚洲流感"是由新出现的H2N2亚型引起，造成200多万人死亡；1968年H3N2亚型引起的"香港流感"造成全球死亡人数超过100万，H1N1和H3N2亚型流感病毒至今还在人类中流行。近年来，H5N1亚型在禽间引起流感暴发，也不断有高病死率的人感染病例发生，是公认的最有可能引起流感大流行的病毒亚型。H5N1是属于禽类的病毒，人感染H5N1俗称禽流感，禽流感人间感染与禽间疫情密切相关。1997年在香港发生人感染H5N1病毒时，禽间的高致病性H5N1疫情十分严重。当这种病毒变异而引起世界范围的暴发流行时，禽流感就演变为大流行流感。流感大流行的显著特征是快速传遍世界各地，通常在不到一年的时间使世界四分之一以上的人口患病，极高的致病性和极高的致死率，造成的经济损失和社会影响巨大。1997年在香港，18例中有6例死亡。2003年在香港再次出现2个H5N1感染病例，l例死亡。此后人类感染的个案数目不断上升，截止2008年4月30日，已有14个国家的382人感染H5N1，其中241例死亡，中国有30例，20例死亡，病死率超过60%。2003年底由东南亚开始再次持续暴发禽间H5N1感染，并蔓延到亚洲、欧洲、非洲。世界范围不断有人感染H5N1病例。世界卫生组织将流感流行程度分为6个级别，当前状况为3级(黄色预警),发生大流行的风险严重。当流感流行情况满足以下3个条件时，就会开始大流行新流感病毒亚型的出现、在受感染人群中引起严重病症以及在人间快速持续传播。H5N1病毒已经满足前2个条件，只欠缺人与人之间的有效和持续传播，一旦H5N1病毒演变为象常规流感病毒一样容易传播，流感大流行就开始了。一旦流行，会给社会和经济带来巨大的破坏，所以每个国家都要有所准备。流感是一种常见的急性呼吸道传染病，由流感病毒引起。流感病毒的最大特点是遗传变异性强，当高致病性的流感病毒新亚型出现后，因全体人群对其均无免疫力而暴发流行，可能引起世界性流感大流行。流感病毒属于正粘病毒科，共有A、B、C三型，中文称甲、乙、丙型，甲型是引起流感的主要型别，甲型病毒变异快，除感染人外，还感染马、猪、禽、海豹等动物，它的大量亚型在天然宿主鸟类中得到保存，形成多样化的基因池；这些特征使甲型流感病毒不断引起人类季节性流感流行，并不定期的导致人类流感大流行。流感病毒表面有血凝素H和神经氨酸酶N两种表面抗原。H又可分为Hl-H16，N可分为N1-N9。不同的血凝素和不同的神经氨酸酶可以配合成一个个具有不同抗原性和致病性的流感病毒，称之为流感病毒亚型。目前引起人类流行的甲型流感病毒属于Hl和H3亚型。流感病毒是带囊膜的RNA病毒，在复制过程中没有纠错机制，易发生复制错误，形成抗原漂移，从而形成基因略有不同的新病毒，人类以往的免疫对变化病毒引起的感染不具有保护性，由此引起流感季节性流行。流感病毒内部有8个RNA节段，在这种结构下，当宿主同时感染两种病毒时，易发生节段互换，形成抗原更换，从而形成人类不具备免疫力的新的病毒亚型，有可能引起大流行。流感病毒通过这两种变异机制形成短期和长期生存机制。世界各地的禽间流感主要由高致病性的H5、H7、H9亚型引起，近年来H5亚型较为活跃。在禽间流行导致人类感染甚至死亡的高致病性H5N1病毒已经演化为两个基因组，以越南株为代表的基因组1引起2004-2005年东南亚地带的人类感染，包括印尼株、青海株和安徽株在内的基因组2引起2005-2006年印尼、中东、欧洲和中国等地的人类感染。人感染高致病性禽流感后，起病急，早期表现类似普通流感。主要表现为发热，体温大多在39摄氏度以上，持续17天，一般为34天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、溪水样便等消化道症状。除了上述表现之外，几乎所有的病人都在临床上表现为肺炎，并会出现急性呼吸窘迫症，进而发展为呼吸衰竭、多脏器衰竭。严重的病例可导致死亡。与其他病毒性疾病一样，流感没有特效药可以治疗，因此预防十分重要。接种疫苗作为第一道防线，可以预防人类感染H5N1病毒，降低发病率，住院率和死亡率，减少禽流感大流行对社会的破坏。H5N1疫苗可以用于预防H5N1病毒引起的流感。疫苗被注入人体后，会刺激人体产生特异性抗体，抵抗相应流感病毒株的侵袭。季节性流感疫苗中不含有针对H5N1型流感病毒的抗原，不能用于预防H5N1感染。目前全球制备和进入临床试验的H5N1疫苗多采用最先分离出来的越南株。但当前主要引起人类H5N1感染的已经不是越南株，而且最终引起大流行流感的病毒株不确定，虽然试验证实越南株对其他株病毒有一定的交叉免疫，越南株仅仅是世界卫生组织建议临床试验的主要疫苗株。在中国，由北京科兴生物制品有限公司与中国疾病预防控制中心共同研制的大流行流感灭活疫苗于2008年4月获得国家食品药品监督管理局颁发的药品注册批件(国药准字S20080005)，商品名为盼尔来福(PanfluTM)。采用的越南株(NIBRG-14,A/VietNam/1194/2003(H5Nl)RG)是英国国家生物制品标准与控制研究所采用反向遗传技术制备，经世界卫生组织推荐的疫苗株。到目前为止，共有11个国家15个厂商的31个不同类型的原型疫苗(H5N1疫苗)向国际制药联合会备案并陆续进入临床研究阶段，这些疫苗多建立在生产企业已有的常规流感疫苗工艺基础上。大部分疫苗产品都处在临床研究阶段，有些已取得初步临床结果。巴斯德、葛兰素史克和诺华等公司的H5N1大流行流感疫苗获得了欧美国家政府的储备采购订单。日本已经公布为6000名医疗工作者进行接种的计划，一些国家也考虑为高危人群和医院军队等国家职能机构人员进行预防接种。中国政府已经有计划地对该疫苗进行储备。然而，大流感疫苗是在特殊情况下或给特殊人群接种，是一种新的疫苗，其安全性、免疫原性、免疫持久性等信息相对有限。2007年10月，WHO在日内瓦召开会议，对人用H5N1疫苗的使用和储备进行了讨论，认为大流感疫苗接种策略应同时考虑大流行发生前阶段的接种和大流行阶段的接种；流感大流行发生前阶段进行大流感疫苗接种的影响因素主要为是否有禽间流行和人间病例这个阶段接种疫苗可以限制动物源性造成的人类感染；虽然受试者接种疫苗后产生了特异性抗体，抗体水平达到了国际上公认的标准，但是疫苗的保护有效性只有在大流感来临，人们面对H5N1病毒侵袭时才能印证。当流感暴发流行，要分离毒株，确定型别，然后由世界卫生组织实验室构建一个用于疫苗生产的毒株，然后分发给生产企业按照原型疫苗的生产路线制备疫苗，通过审批和检定后在应用到大流感疫情防控上。人群接种疫苗还需要一段时间产生保护性抗体，这是一个耗时的过程，从疫情出现到疫苗上市前的时间里，如何能够保证医疗卫生人员、社会功能保障人员以及其他高危人群能够获得有效的保护是一个具有挑战意义的课题。按照传统的观点，接种疫苗是预防大流感流行的主要手段。许多国家的政府开始按照WHO推荐的毒株生产并储备"原型疫苗"。所谓"原型疫苗"是使用WHO推荐的流感毒株制备疫苗，对生产工艺过程、检定方法以及疫苗应用等方面进行验证，确保整体方案成熟可靠，当大流感流行时，只需再递交一个流行株变更申请，可以通过快速注册审批通道，加快疫苗上市速度，及时应对疫情，"原型疫苗"策略是专门针对禽流感爆发的应急方案。然而，这个方案还是存在一些不完美的地方。真正大流行来临的初期，即使使用WHO推荐的毒株制备疫苗也是有时间限制的，大流感爆发初期并无疫苗可用。爆发后WHO要依据全球流感监测网络的数据，重新分离病毒，然后对病毒进行检定、重配、扩增、分发；在疫苗株分发到生产厂商后，再经过生产、检定、报批、签发；最后接种到人群，还要经过一定时间人体才能产生有效保护性抗体。从确认疫情到有疫苗可用要经历大约5个月以上的时间，这段时间除了启动一些常规的重大公共安全预案以外，人们没有更有效的办法来应对危机，对此几乎只能束手无策。本发明是使用大流感H5N1病毒"原型疫苗"株制备疫苗，免疫志愿者，再采集志愿者血浆来制备的抗大流感病毒的静脉注射用特异性免疫球蛋白制品，在大流感流行时，只需更换WHO推荐的流行株即可制备出用于治疗大流感病毒感染者以及高危人群应急被动免疫的血液制品。在特殊情况下，针对大流感流行期间的疫情控制需要，在疫苗上市前采集自然感染者的血桨进行制备特免球蛋白的方法以及实施方案，用于最及时的病人治疗与健康人群和医护人员的被动免疫。
发明内容本发明提出了一个具有创新意义的"原型抗体"概念，并通过动物实验和国内病人临床救治实验得到了很好的验证。"原型抗体"的定义是使用WHO合作中心或WHO批准的实验室推荐的H5Nl疫苗株按照药监部门批准的工艺制备"原型疫苗"，再免疫健康志愿者，采集血衆，按照本发明的提供的技术路线制备出静脉注射用特异性免球蛋白，即"原型抗体"，用于大流感病毒感染者的治疗和疫情的防控，在大流行发生时，视疫情的需要既可以直接采集自然感染者的血清，也可以使用WHO新推荐的流行株免疫健康志愿者，采集血清，按照本发明的"原型抗体"的工艺路线制备特异性免疫球蛋白。本发明要解决的技术问题在于提供一种人禽流感特异性免疫球蛋白。本发明要解决的又一技术问题在于提供人禽流感特异性免疫球蛋白的制备方法。本发明要解决的又一技术问题在于提供一种药物组合物，其中包括人禽流感特异性免疫球蛋白以及药用载体和/或辅料。本发明要解决的再一技术问题在于提供人禽流感特异性免疫球蛋白制备在预防和/或治疗禽流感药物中的应用。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为本发明涉及一种以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株为免疫原制备的人禽流感特异性免疫球蛋白。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所获得的血浆，经硫酸铵盐析、溴化钾盐析和蔗糖密度梯度离心，分离提取后再经病毒灭活处理制备而成的特异性免疫球蛋白。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白还可以采用低温乙醇分离法，分离禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所获得的血浆，再经病毒灭活处理制备而成的特异性免疫球蛋白。本发明的另一优选方案为以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫哺乳动物来制备人禽流感特异性免疫球蛋白。其中，哺乳动物选自猪、牛或羊。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白是肌肉注射用的特异性免疫球蛋白。其中，本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白采用的分离提取方法为(1)将抗禽流感病毒血浆于04。C，1乂104转/分钟离心2040分钟；(2)在04。C温度条件下，取上清加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为4050%;搅拌1220小时后50008000转/分钟离心2050分钟，收集沉淀；(3)在04"温度条件下，将步骤(2)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000转/分钟离心2040分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.21.8mol/L，搅拌14小时后50008000转/分钟离心13小时；(4)重复步骤(3)的操作13次；(5)将步骤(4)的产物加入0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为810%、1216%、1822%、3540%，收集梯度离心产物；(6)超滤，采用0.200.25jLim的滤膜过滤。本发明采用的分离提取方法的优选方案为(1)将抗禽流感病毒血浆于04。C，1乂104转/分钟离心2535分钟；(2)在04。C温度条件下，取上清边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为50%;搅拌1518小时后6000转/分钟离心2535分钟，收集沉淀；(3)在04。C温度条件下，将步骤(2)得到的沉淀中加入体积为抗病毒血浆2540%的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000转/分钟离心2535分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.5mol/L，搅拌2~3小时后6000转/分钟离心2小时，收集沉淀；(4)重复步骤(3)的操作2次；(5)将步骤(4)的产物加入体积为抗病毒血浆2540%的0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为910%、1215%、1820%、3840%，收集产物；(6)超滤，采用0.200.24(im的滤膜过滤。本发明采用的病毒灭活处理采用巴氏消毒法病毒灭活，包括以下步骤将分离提取后的产物在pH5.0条件下6(TC灭活10小时。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白的制备方法包括以下步骤(1)用NIBRG-14病毒株接种培养病毒的组织，经培养、收获病毒液、灭活病毒和纯化后制成禽流感疫苗；(2)将制备的禽流感疫苗免疫接种供血浆者，在最后一次免疫后第06个月采血；(3)将抗禽流感病毒血浆于04'C，1乂104转/分钟离心2040分钟；(4)在04'C温度条件下，取上清加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为4050%;搅拌1220小时后50008000转/分钟离心2050分钟，收集沉淀；(5)在04'C温度条件下，将步骤(4)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后50008000转/分钟离心2040分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.21.8mol/L，搅拌14小时后50008000转/分钟离心13小时；(6)重复步骤(5)的操作13次；(7)取沉淀加入0.01mol/LPBS溶液吹溶；(8)将步骤(6)的产物进行蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为810%、1215%、1820%、3540%，收集梯度离心产物；(9)将梯度离心产物用0.01mol/LpH7.2的PBS溶液超滤，0.200.25nm的滤膜过滤；(10)将过滤后的产物在pH5.0条件下，60'C灭活10小时；(11)将灭活后的产物用O.Olmol/LpH7.2的PBS溶液进行超滤，得到禽流感免疫球蛋白原液。本发明制备方法的优选方案为培养病毒的组织选自鸡胚、非洲绿猴肾细胞、人胚肺二倍体细胞或地鼠肾细胞；优选为鸡胚；供血浆者优选为供血浆的人。本发明制备方法的另一优选方案为当大流感流行发生时，以世界卫生组织推荐的流行的人禽流感病毒株为免疫原，对供血浆者进行免疫，制备特异性免疫球蛋白；或者以世界卫生组织推荐的流行的人禽流感病毒株为免疫原，对哺乳动物进行免疫，制备特异性免疫球蛋白。其中，哺乳动物选自牛、猪或羊。本发明的另一优选方案为当大流感流行发生时，直接从自然感染者体内采集血浆，制备特异性免疫球蛋白。本发明的另一优选方案为在步骤(2)中对供血浆者免疫110次，每次免疫接种间隔735天；免疫接种供血浆者的疫苗中血凝素含量0.1100pg/ml;优选为7.520pg/ml。其中，在步骤(2)中，筛选人禽流感病毒血凝抑制抗体效价为大于1:10的血浆；优选血凝抑制抗体效价大于l:40的血浆。本发明还涉及一种药物组合物，含有有效剂量的人禽流感特异性免疫球蛋白和药学上可接受的载体和/或辅料。其中，药物组合物选自注射剂或冻干粉剂；药学上可接受的载体和/或辅料选自麦芽糖或蔗糖。本发明还涉及人禽流感特异性免疫球蛋白在制备预防和/或治疗禽流感药物中的应用。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白来源于人或者哺乳动物。本发明还涉及一种含有本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白的血浆或血清。在本发明中，为了表述方便，将血浆或特异性免疫球蛋白的血凝素抑制抗体(HI)效价的倒数，记为H5N1特异性免疫球蛋白效价，单位为SU/ml。例如将HI抗体1:40的H5N1血浆效价定义为40SU/ml。本发明的禽流感特异性免疫球蛋白治疗感染者的剂量为13200SU/kg;优选为80160SU/kg体重；用于被动免疫的剂量为13200SU/kg;优选为80160SU/kg体重。本发明所具备的技术优势为一、本发明纯化方法制备的人禽流感特异性免疫球蛋白原液的浓度高、活性高，其比活性，即单位蛋白浓度中的H5N1特异性免疫球蛋白的效价》22.8SU/mg，高于常规乙醇低温纯化法的18.0SU/mg左右。二、本发明纯化方法制备的人禽流感特异性免疫球蛋白原液的纯度更高，经HPLC检测，IgG纯度由常规乙醇低温纯化法的卯°%提高到99%。三、本发明提供的技术方案可以当其他亚型的大流感流行发生时，以世界卫生组织推荐的流行株为免疫原对供血浆者进行免疫，或者从自然感染者体内直接采集血浆，制备特异性免疫球蛋白。使从疫情出现到制备出临床可用的抗体可以在一个月内完成，并且注射到受种者体内立即起作用，既可用于高危人群预防又可以治疗危重感染者。本发明提供的制品可以作为政府应对大流感的储备，是应对大流感流行的一种有效策略。本发明的解决方案与目前国际上通行的储备"原型疫苗"的策略有着独特的共同的优越性。首先，可以采用自然感染者血浆的纯化制备特免球蛋白用于病人与特殊需要防护的人员的被动免疫，以最快的速度应对大流感疫情的流行；同时在疫苗用于人体后可以获得更大量的抗病毒血浆，制备除更多的特免球蛋白，用于更大人群的被动保护。因此，该方案是对目前全球应对禽流感"原型疫苗"策略的最好补充。具体实施例方式下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。1、制备禽流感疫苗采用世界卫生组织(WHO)推荐的并提供的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1))病毒株接种鸡胚，经培养、收获病毒液、灭活病毒和纯化后制成。在大流感流行发生时，如果WHO确认流行株非H5N1病毒亚型，则按照国家有关规定申请毒株变更，以WHO推荐并提供的，经国家药品管理部门批准的大流行流感病毒株来替代。疫苗0.5ml/瓶，含病毒血凝素10Mg。疫苗的制备流程为(1)取10日龄SPF级鸡胚，照检，挑选发育正常的胚，消毒；(2)将0.2ml的病毒液接种于鸡胚的尿囊腔，38t:孵化72小时；(3)将孵育好的鸡胚转移至4'C恒温箱中过夜；(4)收获尿囊液；(5)按h4000比例加入甲醛溶液，4"C灭活7天;(6)连续流离心，^104转/分钟，去除杂蛋白；(7)浓缩适当倍数，密度梯度离心；(8)收获抗原、除菌、稀释分装。2、抗禽流感血浆的采集(1)选择合格的血浆者健康供血浆者免疫接种前应检查项目包括对血桨进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，丙型肝炎病毒(HCV)抗体、梅毒、艾滋病毒(fflV)抗体、转氨酶检测，要求呈阴性；并检查血常规、肝功能、血压、心率、脉搏、身高、体重；(2)于上臂三角肌肌内注射，在第一针免疫后第14天验血，筛选出人禽流感H5N1病毒的HI抗体大于40SU/ml者，采血，分血浆，并将红细胞还输给体内；每个过程采血浆不超过580ml(不包括抗凝剂)。采血必须用无菌密闭系统，在洁净的环境中严格按照规程无菌操作；采血过程中应该及时将抗凝剂与全血混匀，血液应无凝块；单采浆术过程中，所用的器材如注射器，输血器材等均应为一次性的，用后销毁。供血浆者的两次采浆时间应间隔14天以上，每年采浆不超过12次。3、H5N1特异性免疫球蛋白纯化流程(1)将抗禽流感病毒血浆共3Xl(^ml于4。C，1乂104转/分钟离心30分钟；(2)在O'C条件下，取上清边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液，使硫铵的质量百分比浓度为50%;搅拌18小时后6000转/分钟离心30分钟，收集沉淀；(3)在(TC温度条件下，将步骤(2)得到的沉淀加入lX104ml的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000转/分钟离心30分钟，得到上清；在上清中添加溴化钾使浓度为1.5mol/L，搅拌2小时后6000转/分钟离心2小时，收集沉淀；(4)重复步骤(3)的操作2次；(5)将步骤(4)的产物加入lxl()4ml的0.01mol/LPBS吹溶；蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为10%、15%、20%、40%;(6)每100ml每管分段收集梯度离心样品，检测各收集样品的免疫球蛋白效价；混合ffl》50SU/ml的各管，将混合样品进行超滤，超滤液为0.01mol/LpH7.2的PBS溶液；样品首先浓縮至2000ml，超滤换液5次，最后浓縮至2000ml;采用0.22pim的滤膜过滤样品；(7)将过滤后产物用巴氏消毒法进行病毒灭活，调节pH5.0，60。C灭活IO小时；(8)将灭活产物用0.01mol/LpH7.2的PBS进行超滤换液6次，获得特异性免疫球蛋白原液；4、检验、分装(1)对原液进行各项指标检测测特免球蛋白效价，不小于4100SU/ml，蛋白浓度低于180mg/ml，比活性>22.8SU/mg;(2)加入麦芽糖做保护剂，使麦芽糖的质量百分比浓度为10%，按照4000SU/瓶和8000SU/瓶的规格无菌分装。于28'C保存。(3)质量检测-按照上述工艺制备3批肌内注射用大流感特异性免疫球蛋白，质检结果如下:表l:肌内注射用人禽流感特异性免疫球蛋白质检验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结论三批制品经检定判为合格实施例2H5N1免疫球蛋白对禽流感的预防效果实验1.实验动物选取40只雄性SPF级昆明鼠，体重1822g;将实验动物分成4组空白对照组、攻毒对照组、30SU组、6SU组，每组10只。2.实验过程小鼠分别腹腔注射生理盐水0.2ml、生理盐水0.2ml、30SUH5N1免疫球蛋白、6SU免疫球蛋白。2天后对攻毒对照组、30SU组、6SU组的实验鼠乙醚麻醉滴鼻攻毒，攻毒量10XLD50(病毒的LD50为l(T6'7/0.05ml)。14天内观察小鼠的发病与死亡情况，并记录体重。3.实验结果(1)空白对照组正常；(2)攻毒对照组攻毒3天开始出现反应迟钝、皱毛、食欲下降、呼吸急促症状，体重急剧下降，46天全部死亡。(3)30SU组小鼠无发病，全部存活。(4)6SU组攻毒后8天体重开始下降，3只死亡，存活率70%。本实验结果说明注射了高剂量特异性免疫球蛋白的小鼠全部存活，低剂量小鼠虽有死亡，但是发病时间比对照组有所推迟，并起到一定的保护效果。该免疫球蛋白具有预防保护的效果。实施例3:H5N1免疫球蛋白对禽流感患病动物的治疗效果实验1.实验动物及分组选取40只雄性SPF级昆明鼠，体重1822g;将实验动物分成4组空白对照组、攻毒对照组、30SU组、68SU组，每组10只。2.实验过程对小鼠采用乙醚麻醉法，第一组麻醉小鼠采用生理盐水滴鼻；后三组分别采用10XLD5o(病毒的LDso为l(T67/0.05ml)的H5N1滴鼻攻毒。三天时攻毒小鼠出现皱毛、反应迟钝、减食、弓背、呼吸称重等症状。然后对40SU组、8SU组分别腹腔注射H5N1特异性免疫球蛋白30SU、6SU。注射后再14天内观察小鼠的发病与死亡情况，并记录体重。3.实验结果(1)结果空白对照组正常；(2)攻毒对照组小鼠攻毒46天全部死亡；(3)30U组小鼠全部存活，7天时全部恢复正常；(4)6SU组小鼠攻毒9天后死亡4只，其他小鼠恢复正常。本实验结果说明，该免疫球蛋白对于感染动物具有很好的治疗效果。实施例4:临床试验2007年至2009年，对国内公布大流感患者信息与我公司H5N1大流感血浆救治患者统计表2:国内2007-2009年8例人感染禽流感(H5N1)病例情况汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>结果显示临床数据说明，我公司输浆救治病人均成功康复出院，而死亡的病例均未输浆，可见该治疗方式对H5N1病人的成功救治可起到积极作用；禽流感病例的早发现、早诊断有利于及早应用血浆进行治疗以发挥其最大的治疗效果。如能及早进行该疾病特免球蛋白的储备，对于全国各地可能出现的新的禽流感病例将能更好应对。临床医生与各级疾病预防控制中心的人员在病人的救治与疾病的流行病调査过程中，尤其是在早期，防护可能不够充分，面临着较大的危险，提前对定点医院的医生接种疫苗，可以有效降低暴露后的感染危险；同时可用H5N1特免球蛋白对其他高危人群或健康进行被动免疫。注本临床效果观察结果发表于Lancet.2008Apr26;371(9622):1427-34。实施例5:血浆效价与治疗、保护相关性推导通过H5N1针对试验小鼠的预防与治疗保护数据进行人的免疫计量的推导。关于小鼠免疫的数据推导采用人和动物的体表面积计算法、不同种类动物之间药物剂量换算法，引自章元沛编(秀逻学实验(V/入乂厉if幼廢私"S^)。按体表面积计算剂量的概念为药理学家普遍接受，被认为尤其适用于不同动物之间剂量的换算。对于该方法为使用方便，可按"mg/kg折算mg/n^的转换因子"进行换算表3:不同种类动物间剂量换算时的常用数据动物Meeh-Rubner公式值的K值Mg/kg-mg/m2转换因子与小鼠转换因子的比值小鼠9.131(20g)大鼠9.162(200g)豚鼠9.882.67(400g)家兔10.1124(2kg)猴11.8124(3kg)人10.63612(50kg)上表可见，按mg/kg剂量折算成等效剂量，人为小鼠的1/12。因此30SUA2成人需求量=-X50kg=6250SU3125SU。2040g(6250SU3125SU)X(1+0.28)=8000SU4000SU其中，0.28是取0.250.3的附加量的近似中间值。单位质量最佳免疫剂量为80160SU/kg体重。理论推导成人单位重量需要注射80~160SUH5N1特异性免疫球蛋白方具有预防与治疗H5N1感染者或自然人群的效果，但是具体实验数据尚需该制品经过大量的临床试验方可获得。权利要求1、一种以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株为免疫原制备的人禽流感特异性免疫球蛋白。2、根据权利要求l所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所获得的血浆，经硫酸铵盐析、溴化钾盐析和蔗糖密度梯度离心，分离提取后再经病毒灭活处理制备而成的特异性免疫球蛋白。3、根据权利要求l所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所获得的血浆，采用低温乙醇分离法分离，再经病毒灭活处理制备而成的特异性免疫球蛋白。4、根据权利要求2或3所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫哺乳动物。5、根据权利要求4所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，所述的哺乳动物选自牛、猪或羊。6、根据权利要求l所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，是肌肉注射用的特异性免疫球蛋白。7、根据权利要求2所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，所述的提取方法包括以下步骤(1)将抗禽流感病毒血浆于04。C,1乂1()4转/分钟离心2040分钟；(2)在04。C温度条件下，取上清加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为4050%;搅拌1220小时后50008000转/分钟离心2050分钟，收集沉淀；(3)在0fC温度条件下，将步骤(2)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000转/分钟离心2040分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.21.8mol/L，搅拌14小时后50008000转/分钟离心13小时；(4)重复步骤(3)的操作13次；(5)将步骤(4)的产物沉淀加入0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为810%、1216%、1822%、3540。％，收集梯度离心产物；(6)超滤，采用0.200.25pm的滤膜过滤。8、根据权利要求7所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，所述的分离提取方法包括以下步骤(1)将抗禽流感病毒血浆于04。C，1乂104转/分钟离心2535分钟；(2)在04'C温度条件下，取上清边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为50%;搅拌1518小时后6000转/分钟离心2535分钟，收集沉淀；(3)在04。C温度条件下，将步骤(2)得到的沉淀中加入体积为抗病毒血浆2540°/。的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000转/分钟离心2535分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.5mol/L，搅拌23小时后6000转/分钟离心2小时，收集沉淀；(4)重复步骤(3)的操作2次；(5)将步骤(4)的产物加入体积为抗病毒血浆2540%的0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为910%、1215%、1820%、3840%，收集产物；(6)超滤，采用0.200.24|im的滤膜过滤。9、根据权利要求2或3所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，所述的病毒灭活处理采用巴氏消毒法病毒灭活，包括以下步骤将分离提取后的产物在pH5.0条件下6(TC灭活10小时。10、一种人禽流感特异性免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用NIBRG-14病毒株接种鸡胚，经培养、收获病毒液、灭活病毒和纯化后制成禽流感疫苗；(2)将制备的禽流感疫苗免疫接种供血浆者，在最后一次免疫后第06个月采血；(3)将抗禽流感病毒血浆于04。C，1乂104转/分钟离心2040分钟；(4)在04。C温度条件下，取上清加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为4050%;搅拌1220小时后50008000转/分钟离心2050分钟，收集沉淀；(5)在04°(3温度条件下，将步骤(4)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后50008000转/分钟离心2040分钟，得到上清；在上清中添加固体溴化钾使浓度为1.21.8mol/L，搅拌14小时后50008000转/分钟离心13小时；(6)重复步骤(5)的操作13次；(7)将步骤(6)的产物加入O.Olmol/LPBS溶液吹溶后进行蔗糖密度梯度离心，转速为2乂104转/分钟，蔗糖梯度质量百分比浓度为810%、1215%、1820%、3540%，收集梯度离心产物；(8)将梯度离心产物用0.01mol/LpH7.2的PBS溶液超滤，0.200.25nm的滤膜过滤；(9)在pH5.0条件下，6(TC灭活10小时；(10)将灭活后的产物用O.Olmol/LpH7.2的PBS溶液进行超滤，得到禽流感免疫球蛋白原液。11、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，将禽流感NIBRG-14病毒株接种于非洲绿猴肾细胞、人胚肺二倍体细胞或地鼠肾细胞。12、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当大流感流行发生肘，以世界卫生组织推荐的流行的人禽流感病毒株为免疫原，对供血浆者进行免疫，制备特异性免疫球蛋白。13、根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，当大流感流行发生时，以世界卫生组织推荐的流行的人禽流感病毒株为免疫原，对哺乳动物进行免疫，制备特异性免疫球蛋白。14、根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物选自牛、猪或羊。15、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当大流感流行发生时，直接从自然感染者体内采集血浆，制备特异性免疫球蛋白。16、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中对供血浆者免疫110次，每次免疫接种间隔735天。17、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中免疫接种供血浆者的疫苗中血凝素含量0.1100jig/ml。18、根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，免疫接种供血浆者的疫苗中血凝素含量为7.520pg/ml。19、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中筛选人禽流感病毒血凝抑制抗体效价为大于1:10的血浆。20、根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，筛选人禽流感病毒血凝抑制抗体效价大于l:40的血浆。21、一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的如权利要求1所述的人禽流感特异性免疫球蛋白和药学上可接受的载体和/或辅料。22、根据权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物选自注射剂或冻干粉剂。23、根据权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体和/或辅料选自麦芽糖或蔗糖。24、根据权利要求1所述的人禽流感特异性免疫球蛋白在制备预防和/或治疗禽流感药物中的应用。25、根据权利要求1所述的人禽流感特异性免疫球蛋白，其特征在于，所述的人禽流感特异性免疫球蛋白来源于人或者哺乳动物。26、一种包含权利要求1所述的人禽流感特异性免疫球蛋白的血浆或血清。全文摘要本发明涉及一种人禽流感特异性免疫球蛋白，其制备方法、使用方法及用途。本发明的人禽流感特异性免疫球蛋白是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所获得的血浆，经硫酸铵盐析、溴化钾盐析和蔗糖密度梯度离心，分离提取后再经病毒灭活处理制备而成的特异性免疫球蛋白，具有纯度高，活性高的优点。同时，本发明提供了一种在大流感流行发生时，以世界卫生组织推荐的流行株为免疫原对供血浆者进行免疫，或者从自然感染者体内直接采集血浆，制备特异性免疫球蛋白的技术方案，使得流感的传播得到及时有效的控制。文档编号C07K16/10GK101508733SQ200910080588公开日2009年8月19日申请日期2009年3月23日优先权日2009年3月23日发明者丘远征,尹卫东,张小梅,芳蔡,陈江婷,高正伦申请人:北京科兴生物制品有限公司