专利名称：一种人免疫球蛋白样受体突变体及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种人免疫球蛋白样受体突变体及其应用。
背景技术：
器官移植是现今挽救终末期器官功能衰竭患者生命的最终有效途径。如何控制器 官移植后的排斥发应，诱发宿主对移植物的免疫耐受，一直是移植免疫学领域研究的热点 及难题。迄今，防治移植排斥的主要对策仍然是通过各种途径抑制宿主的免疫功能，也正 是由于免疫抑制药物，如环孢霉素、Π(506和0ΚΤ3等的问世，包括肾、肝、胰腺和皮肤等在内 的器官移植才取得长足的进展，但其抑制作用的非特异性问题仍然没有得到很好解决。近 年来提出的特异性免疫耐受理论为移植免疫的研究指明了方向即通过诱导机体仅对移植 物抗原产生耐受，而保留和不干预机体的其他免疫功能，达到既延长移植物存活时间，又使 对宿主自身免疫功能的影响降到最低限度的效果。T淋巴细胞是机体细胞免疫的重要执行 和调节细胞，是参与同种/异种器官移植急性排斥反应的主要效应细胞。据此，诱导受体T 淋巴细胞对供者的特异性细胞免疫耐受是解决器官移植急性排斥反应的最主要、最有效手 段。免疫防御、免疫监视和免疫自稳是机体免疫系统恒久存在的三大原始功能。免疫 自稳机制(Immunologic Homeostasis)是指正常机体具有充分利用包括免疫细胞、免疫分 子、独特型-抗独特型网络和神经内分泌等免疫调节方式维持机体免疫状态稳定，保持个 体整体免疫功能平衡的重要免疫调节机制。调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)对 正常机体中未被胸腺“阴性选择”克隆清除的“自身反应性” T细胞的“休眠状态”的维持和 对部分效应性T细胞的功能抑制是个体免疫自稳形成的重要机制之一。正常机体在个体发 育过程中可以通过胸腺的“阴性选择”和“阳性选择”实现对自身抗原的免疫耐受，但是这 种选择对“自身反应性”T淋巴细胞的剔除往往是不完全的。而正常机体中未被克隆清除的 “自身反应性” T细胞的亚活化状态的维持则主要归功于Treg细胞。Treg细胞的活性降低 将导致休眠的“自身反应性”T细胞的活化和自身免疫性疾病的发生。也正是由于Treg细 胞具有参与维持免疫自稳的这种独特免疫学特性，因此，通过移植抗原诱导的Treg细胞对 针对移植抗原的效应性T细胞的单一性功能抑制将能够达到既阻击机体特异性细胞排斥 反应的目的，同时获得不影响和干预机体正常免疫功能的应用效果。应用DNA序列分析和X晶体衍射分析等研究表明，许多细胞膜表面和机体某些蛋白质分子，其多肽链折叠方式与Ig折叠相似，在DNA水平和氨基酸序列上与IgV区或C区 有较高的同源性，它们可能从同一原始祖先基因(primodial ancestralgene)经复制和突 变衍生而来。编码这些多肽链的基因称为免疫球蛋白基因超家族(immunoglobulin gene superfamily)，这一基因超家族所编码的产物称为免疫球蛋白超家族(immunoglob 1 in superfamily, IGSF)。由于细胞表面标记、单克隆抗体以及基因工程研究的进展，近年来发 现属于IGSF的成员已达近百种，主要包括T细胞、B细胞抗原识别受体和信号传导分子，MHC 及相关分子，Ig受体，某些细胞因子受体，神经系统功能相关分子，以及部分白细胞分化抗原(CD)。1997年，美国Immunex公司的Cosman等在研究细胞表面的巨细胞病毒MHC I类分 子同源物UL18的受体时又发现一个新的免疫球蛋白超家族的MHC I类分子受体，并将其命 名为白细胞免疫球蛋白样受体-Kleukocyte immunoglobulin-1 ikereceptor 1，LIR-1)。 同年，瑞士 Basel研究所Colorma小组的Samarid等也报道克隆出LIR-I和另一相关受体， 分别命名为免疫球蛋白样转录子2(immunoglobulin-like transcript 2，ILT2)和免疫球 蛋白样转录子l(immunoglobulin-like transcript 1，ILT1)。随后，一些学者相继报道发 现其它的LIRs家族成员。目前，ILT家族目前共有13个成员，即ILT1-ILT11，LIR6和LIR8。ILT编码基因 定位在人类19号染色体19ql3. 2_19ql3. 4的区域，和NK细胞另外一类受体KIR的编码区 紧邻。ILT家族成员的胞外区与KIRs同源，但与KIRs不同的是，该受体分布广泛，除NK和 T细胞，也在单核细胞、树突状细胞和B细胞等多种免疫细胞表面表达，可能具有更广泛的 免疫调节作用。ILT家族成员按照功能和胞浆区性质可以分别归类为激活型受体、抑制型 受体、分泌型受体。抑制型受体成员细胞内区域都包含有免疫受体酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM),通过募集含 SH2 结构的磷 酸酶SHP-I抑制细胞外的信号向细胞内传递，抑制胞内Ca2+的动员和酪氨酸磷酸化作用，从 而发挥其抑制作用。激活型成员胞浆区比较短，主要通过跨膜区带正电的精氨酸(Arg)与 Fc ε RI y蛋白的跨膜区带负电的天冬氨酸(Asp)相结合，通过Fc ε RI y蛋白的胞内区免疫 ^ ΦΜΜ Φ^^^5 (immunoreceptortyrosine-based activation motif, IΤΑΜ) ^ΨΜ 活性信号。分泌型受体只有一个成员ILT6，它没有跨膜区。目前对于ILT家族中抑制型受 体的研究比较充分。已经证实，在ILT家族中，抑制型受体ILT2/ILT4可同许多经典的MHCI 类分子结合，如HLA-A和HLA-B，行使着保护正常细胞免受NK细胞杀伤的功能。ILT2/ILT4 还可以和一些非经典的MHCI类分子结合，比如HLA-F。由于HLA-G分子在绒毛膜外滋养层 细胞中高表达，因此ILT2/ILT4与之结合可能和抑制母体的NK细胞的杀伤胎儿组织的机制 有关。最近发现在一些发生免疫耐受的患者体内HLA-G分子也有高表达，比如慢性传染病 患者、肿瘤患者等。HLA-G可以与ILT2/ILT4结合，通过这些分子抑制NK细胞的杀伤活性。 此夕卜，ILT2还可以和人巨细胞病毒(HCMV)编码的MHC结构类似物UL-18结合，可能有利于 HCMV感染细胞时抑制机体的抗病毒免疫应答。目前，ILT2/ILT4配体结合域的晶体结构都 已经分别解出，并且ILT2配体结合域与HLA-A2复合物、ILT4配体结合域与HLA G复合物 的晶体结构也已经解出，为抑制型受体的功能深入研究提供了很好的指引。ILT家族成员按照结构可以归类为含有两个或者四个免疫球蛋白超家族C2样结 构域成员，目前已知只有ILT3和ILTl 1含有两个Ig结构域，其余成员都为四个Ig结构域。 按照氨基酸同源性和ILT2-HLA结合位点的保守性，ILT成员又可归入为“Group 1”(同源 性大于80% )和“Group2” (同源性小于60% )。“Groupl”成员包括抑制性受体ILT2和 ILT4，激活性受体ILTl和LIR6，再加上分泌性受体ILT6 ；“Group2”成员则主要包括ILT 3/7/11。迄今为止对于ILT家族中“GroUp2”成员的研究还十分有限，唯一成功进行结构 解析的成员即激活性受体ILTl 1，对于“Group 2”抑制性成员还所知甚少。与ILT1/ILT2/ILT4不同的是，ILT3的胞外区有2个C-2型免疫球蛋白样功能区，其胞浆区均含有免疫受 体酪氨酸抑制基序。随着骨髓细胞的不断成熟，抑制性ILT受体不断增加，而活化ILT受体 轻微增加或几乎没有变化，这提示抑制性受体在细胞成熟的最后阶段发挥着非常重要的作 用。2002年，Nicole Suciu-Foca课题组首次报道了在一种特殊的Treg细胞，主要标记为 ⑶8+⑶28-Ts，高表达ILT3和ILT4，并且这些细胞能够特异性的导致耐受APC细胞和无能T 细胞的形成，揭示了 ILT3在移植耐受的发生和肿瘤的转移可能起到重要作用。
对于所有的ILT家族中“GroUp2”成员来说，结合的配体均没有研究清楚。之前文 献报道没有检测出与MHCI类分子的结合，这个可能是和其行使不同于“Groupl”成员的特 殊功能相互统一的，其配体的差异性机理就更加值得关注。胞外区结构的不同必然是影响 这种功能差异的因素之一。对于ILT3，到目前为止所有的研究都是基于细胞生物学实验得 出的，其体外表达纯化不稳定，成为了对其进行体外生化性质研究和可能的药物设计和生 产的瓶颈。传统情况下，接受器官或骨髓移植的患者需要使用很强的免疫抑制剂来抑制其自 身的免疫系统，避免机体对移植器官的免疫排斥。但是免疫抑制剂都有很强的副作用，长期 使用这些药物会使患者容易发生病毒感染或其他疾病。而且即使在使用免疫抑制剂的情况 下仍有一部分移植器官被排斥。解决这一问题的另外一种更好的思路就是关闭机体内的T 细胞，因为T细胞在免疫反应的激发和进行过程中起着关键作用。研究人员分离出一种特 殊的T细胞，被称为T抑制细胞，它能够停止免疫系统中其他细胞的正常功能，如单核细胞 和树突细胞等。在正常情况下，单核细胞和树突细胞是帮助诱发免疫反应的。Suciu-F0ca及 其同事观察到，当单核细胞与树突细胞接触T抑制细胞后，细胞表面的两种抑制蛋白ILT3 和ILT4水平增加。而这种抑制蛋白的增加就会使单核细胞和树突细胞对外源性的组织产 生耐受，而不是发动免疫排斥。研究人员从接受心脏移植手术后未发生排斥反应的患者中 采集血液样本进行研究。结果发现在这类患者的血液样本中T抑制细胞和ILT3、ILT4水平 较高，这种情况下，患者的单核细胞功能被抑制，也就防止了器官排斥反应的发生。在2002 年1月27日出版的《自然免疫学杂志(网络版)》上，Suciu-Foca等人建议，对接受器官移 植手术的患者使用能够增加其ILT3和ILT4水平的药物，使患者产生免疫耐受。Suciu-Foca 告诉路透社记者说“研究中最重要的发现是发现了 ILT3和ILT4的作用，这是人体发生免 疫耐受的核心机制。”研究的结果可以用于多发性硬化症、银屑病、乳糜泻、风湿性关节炎和 其他一些自家免疫性疾病的治疗。在这些疾病中患者的免疫系统发生混乱，对其自身组织 产生了免疫反应。Foca解释说，将来有一天可以通过操纵树突细胞使其表达高水平的ILT3 和ILT4，来治疗这些疾病。通过向患者体内注射这种“疫苗”，可以抑制那些不想启动的免 疫反应。另一方面，在某些情况下，需要激发免疫反应，如对肿瘤患者的恶性肿瘤细胞，对艾 滋病患者的HIV感染细胞，可以通过抑制ILT3和ILT4的表达来加强免疫反应。ILT3作为 研究器官移植和肿瘤转移的潜在突破口，需要建立一种有效提高其体外稳定性的一套制备 方法。目前应用常规方法体外纯化ILT3效率低下，蛋白变性沉淀现象严重，获得的ILT3胞 外区蛋白也不稳定，无法适应长期的保存，制约了对其功能的研究和潜在价值的利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种人免疫球蛋白样受体突变体及其应用。
本发明提供的人免疫球蛋白样受体突变体，是在人免疫球蛋白样受体中引入一个 二硫键得到的人免疫球蛋白样受体突变体。所述在人免疫球蛋白样受体中引入一个二硫键可通过将人免疫球蛋白样受体的 两个氨基酸残基突变为半胱氨酸实现。所述人免疫球蛋白样受体可为ILT蛋白。在ILT蛋白中引入一个二硫键可通过将 ILT蛋白自氮端第150-158位氨基酸残基中的一个和第160-168位氨基酸残基中的一个突 变为半胱氨酸实现。所述人免疫球蛋白样受体具体可为ILT3蛋白(GenBank Accession NumberNP_001074907)。在ILT3蛋白中引入一个二硫键可通过将ILT3蛋白自氮端第156 位氨基酸残基和第166位氨基酸残基突变为半胱氨酸实现。
所述人免疫球蛋白样受体自氮端第24至219位氨基酸残基序列具体可如序列表 的序列1所示。本发明还提供了一种提高人免疫球蛋白样受体稳定性的方法，是在人免疫球蛋白 样受体中引入一个二硫键。所述在人免疫球蛋白样受体中弓丨入一个二硫键可通过将人免疫球蛋白样受体的 两个氨基酸残基突变为半胱氨酸实现。所述人免疫球蛋白样受体可为ILT蛋白。在ILT蛋白中引入一个二硫键可通过将 ILT蛋白自氮端第150-158位氨基酸残基中的一个和第160-168位氨基酸残基中的一个突 变为半胱氨酸实现的。所述人免疫球蛋白样受体具体可为ILT3蛋白(GenBank Accession NumberNP_001074907)。在ILT3蛋白中引入一个二硫键可通过将ILT3蛋白自氮端第156 位氨基酸残基和第166位氨基酸残基突变为半胱氨酸实现。本发明还保护一种人免疫球蛋白样受体突变体的多肽片段，是序列表的序列1所 示的多肽片段。将人源的ILT3(immunoglobulin-like transcript 3)蛋白的 24-219 位氨基酸命 名为ILT3wt，该ILT3wt包括胞外Ig结构域1和2，分子量为21801. 9道尔顿。本发明将 ILT3wt 中，ILT3 蛋白(GenBank Accession Number ΝΡ_001074907)自氮端第 156 位异亮氨 酸(英文缩写为Ile，I)和第166位组氨酸(英文缩写为His，H)均突变成为半胱氨酸(英 文缩写为Cys，C)，将突变后的多肽片段命名为ILT3cc，ILT3cc分子量为21757. 9道尔顿。 ILT3cc中，突变得到的两个半胱氨酸在ILT3Ig结构域2 β折叠C和C’之间形成二硫键(以 下简称二硫键3)，从而减小了 C-C’ loop区域的柔性和摆动。与ILT3wt相比，ILT3cc的稳 定性大大增加。对具有二硫键3的成员ILT2和ILT4，没有二硫键3的成员ILTll进行生物信息 学分析，发现二硫键3的有无并不影响这些蛋白质的拓扑结构，因此在ILT3蛋白中引入的 二硫键不会影响其结构和功能。通过分子筛层析、动态光闪射、高速分析离心、蛋白质结晶 等实验对ILT3cc的生理生化性质进行鉴定。在分子筛层析实验中，ILT3cc和ILT3wt出 峰位置重合，证明其分子均为单体，在ILT3蛋白中引入的二硫键不影响其功能组织形式； 在动态光闪射实验中，ILT3cc和ILT3wt的分子大小一致，状态均一；在分析超速离心实验 中，ILT3cc和ILT3wt沉降速率保持一致；在平行的蛋白质结晶实验中，ILT3cc成功结晶，ILT3wt未见晶体形成。应用本发明的方法，可以在体外制备中极大的提高人免疫球蛋白样受体的稳定性 和制备效率。本发明所提供的人免疫球蛋白样受体突变体，可以应用于人免疫球蛋白样受 体的各项生理生化性质的检测、蛋白质结晶和结构测定、体外结合和功能学实验，并可以应 用于单克隆抗体的制备、药物靶标的筛选、医用生产等。本发明具有重大的经济价值和社会意义。
图1为抑制型受体ILT2和激活型受体ILTll的拓扑结构图比较。图2为ILT3改造区氨基酸序列与其它家族成员的比较。图3为复性之后的ILT3cc和ILT3wt分子筛层析图谱对照。图4为图3所示的ILT3cc分子筛凝胶层析收集组分的SDS-PAGE电泳图。图5为图3所示ILT3cc和ILT3wt纯化后4°C放置24小时的SDS-PAGE电泳图。图6为相同浓度的ILT3cc和ILT3wt蛋白溶液常温静置24小时后的照片。图7为ILT3wt和ILT3cc的沉降速率和分子量分布。图8为ILT3cc晶体的照片。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。入 iH 白勺 ILT3 (immunoglobulin-like transcript 3)胃自(GenBank AccessionNumber ΝΡ_001074907)的24-219位氨基酸命名为ILT3wt (见序列表的序列2)， ILT3wt包括胞外Ig结构域1和2，分子量为21801. 9道尔顿。将ILT3wt中，ILT3蛋白 (GenBank Accession Number ΝΡ_001074907)自氮端第156位异亮氨酸和第166位组氨酸 均突变成为半胱氨酸，将突变后的多肽片段命名为ILT3CC (见序列表的序列1)。以下实施 例中，以ILT3cc为例，进一步阐述本发明的技术方案。实施例1、人免疫球蛋白样受体突变体的制备一、生物信息学分析分析发现ILT3蛋白的Ig结构域2柔性loop区，对整个蛋白的结构刚性产生不利 影响。对ILT家族成员ILT 2/4/11，进行序列比较分析，发现它们有一个共同的特点，就是 每个免疫球蛋白结构域是由两个二硫键(二硫键1和二硫键2)固定住，形成稳定的折叠方 式，这两个二硫键是通过两对高度保守的半胱氨酸形成的。对于ILT 2/3/4/11这些成员来 说，除了两对高度保守的半胱氨酸之外，其他的半胱氨酸都是非保守的。非保守的半胱氨 酸只要存在，总是两两出现，形成一个二硫键(二硫键3)，且二硫键存在的位置是固定的。 ILT3和ILTll没有这个非保守二硫键，这就造成了这个loop区域过于柔化。抑制型受体ILT2和激活型受体ILTll的拓扑结构图比较见图1。从图1可见，对 于ILT2/4和ILTll来说，二硫键3 (ILT2圈内区域)对于蛋白质拓扑结构没有影响，而且其 所在的区域在Ig结构域2，远离配体结合区。因此，在ILT3蛋白与ILT2和ILT4 二硫键3半胱氨酸相对应的位置上(156位和166位)引入2个配对的半胱氨酸，以构造出一个类似的二硫键，可提升ILT3的体外稳定性。ILT3改造区氨基酸序列与其它家族成员的比较见图2。二、人免疫球蛋白样受体突变体的制备1、ILT3cc的DNA序列的克隆和表达载体的构建(1)编码ILT3wt的DNA序列的克隆设计两条引物，从淋巴细胞cDNA文库(StrataGene，货号937214)中克隆目标片 段(编码ILT324-219蛋白的DNA序列，588bp)，并在目标片段5'端引入起始密码子ATG， 引物如下上游引物P1 CCAACATATGGGTCCACTTCCAAAACCAACTCTC ；下游引物P2 CCGCTCGAGTTATCCTGAGACTATGAGCTCCAGGGGGTC。上游引物做了密码子优化，以提高目标片段在大肠杆菌中的表达量，包含有NdeI 酶切位点；下游引物包含有XhoI的酶切位点和终止密码子。PCR 体系(50μ 1) :Η20，36· 5μ 1 ;10Xpfu 缓冲液，5 μ 1 ;dNTPs，5 μ 1 ;P1 禾口 P2 (10 μ Μ)，各 1 μ 1 ；pfu Taq 酶，1· 5 μ 1。PCR 反应程序94°C变性 5min，一个循环；94°C、30s，60°C、30s，72°C、45s，共 30 个 循环；最后72°C延伸lOmin。1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果并且用胶回收试剂盒纯化目标片段(ILT3wt)， PCR产物测序，密码子优化后的DNA序列见序列表的序列3。(2) ILT3cc的DNA序列的克隆用搭桥法合成ILT3cc的DNA片段，设计引物如下P3 :CTTCTGTGCAAGGAGCGGGCAGCCCATCCCCTACTGTGTCTGAGATC ；P4 GATCTCAGACACAGTAGGGGATGGGCTGCCCGCTCCTTGCACAGAAG 引物序列中，加粗和下划线标出的是突变的氨基酸对应的密码子。分别用Pl和P4、P2和P3作为引物，将上述扩增所得的ILT3wt片段作为模板进 行PCR，PCR条件同上。纯化相应片段，然后将两者片段等比混合作为模板，再用引物Pl和 P2进行PCR扩增，PCR条件同上，得到ILT3cc的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收ILT3cc的 DNA片段。PCR产物测序，DNA序列见序列表的序列4。(3) ILT3cc蛋白原核系统表达载体的构建用Nde I禾PXho I (TaKaRa Inc.)双酶切ILT3cc的DNA片段，酶切体系如下PCR产 物 15. O μ 1，IOXH buffer 4 μ 1，灭菌水 17 μ l，Nde I 禾口 Xho I 酶各 2 μ 1。37°C酶切 12h， 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收目的片段后，与同样酶切的载体pET-21a(+) (Novagen公司)大片段连接，连接体系为酶切的PCR产物10 μ 1，酶切的pET_21a(+)载体 大片段6 μ 1，IOX连接酶缓冲液2 μ 1，T4 DNA连接酶2 μ 1。18°C连接12h后，将连接产物 转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，将上述大肠杆菌DH5 α感受态细胞涂布在含有IOOyg/ ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，培养12小时后挑取单克隆。提取质粒酶切验证，琼脂 糖凝胶电泳检测，将获得的携带ILT3cc的DNA片段的重组质粒命名为pET-ILT3cc。对 pET-ILT3cc进行测序鉴定，结果表明在重组质粒pET-ILT3cc的Nde I和Xho I酶切位点 间插入片段的核苷酸序列是序列表中序列4的自5'末端第1-588位核苷酸。
将ILT3cc蛋白从氮端进行15个氨基酸残基的测序，测序结果表明，其自氮端开始 的 15 个氨基酸与 ILT3 蛋白(GenBank Accession Number ΝΡ_001074907)自氮端第 24 至 38位氨基酸残基完全一致。2、ILT3cc蛋白的表达和包涵体处理将质粒pET-ILT3cc转化入原核表达宿主菌BL21(DE3)中，37°C诱导表达后， ILT3cc蛋白以包涵体的形式表达。菌液在4°C条件下5000rpm/min离心IOmin后收集菌体， 用20倍体积的PBS溶液重悬菌体，再次离心，离心条件同上；再用10倍体积的PBS溶液重悬 菌体，经100次超声破碎菌体(超声4s，间隔IOs)，然后于4°CU5000rpm/min离心15min， 收集沉淀即得到以包涵体形式表达的ILT3CC蛋白。将得到的ILT3CC蛋白用洗涤缓冲液 (0. 5% Triton X_100，50mM Tris-HCl pH8. 0, IOOmM NaCl，0· 1 %叠氮化钠，IOmM EDTA, 2mM 二硫苏糖醇(DTT))洗涤沉淀，再用重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8. 0, IOOmM NaCl, IOmM EDTA, 2mM DTT)洗涤一次，然后将沉淀溶于盐酸胍缓冲液中(6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH 8. 0，IOOmMNaCl, IOmM EDTA, IOmM DTT)。SDS-PAGE 检测 ILT3cc 蛋白的纯度，在 95% 以上。3、ILT3cc蛋白的纯化
将20mg ILT3cc 蛋白溶解于 300ml 复性液(200mM Tris-HCl pH 8. 0，IM L-精氨 酸，IOmM EDTA, 0. ImM苯甲磺酰氟化物(PMSF)，5mM还原型谷胱甘肽，0. 5mM氧化型谷胱甘 肽)中，4°C搅拌复性，每24小时添加一次ILT3cc蛋白，每次20mg，共添加三次。复性后的 ILT3cc蛋白经浓缩后用分子筛上样缓冲液(50mM Tris-HCl pH8. 0,50mM NaCl)透析，用 Superdex 75HR分子筛层析柱(GE Healthcare)纯化目的蛋白并浓缩。纯化后的目的蛋白 经质谱鉴定，分子量为22KDa，与理论计算值(21757. 9Da)相符。三、ILT3Wt的制备1、编码ILT3wt蛋白的DNA序列的克隆同步骤二的1的(1)。2、ILT3wt蛋白原核系统表达载体的构建同步骤二的1的(3)。将ILT3wt蛋白从氮端进行15个氨基酸残基的测序，测序结果表明，其自氮端开始 的 15 个氨基酸与 ILT3 蛋白(GenBank Accession Number ΝΡ_001074907)自氮端第 24 至 38位氨基酸残基完全一致。3、ILT3wt蛋白的表达和包涵体处理同步骤二的2。4、ILT3wt蛋白的纯化同步骤二的3。实施例2、ILT3cc蛋白的生理生化性质测定将实施例1制备的纯化后的ILT3cc蛋白和ILT3wt蛋白(对照)进行以下性质鉴 定一、分子筛层析将ILT3cc 蛋白和 ILT3wt 蛋白用 Superdex 75HR 分子筛层析柱(GE Healthcare) 纯化并浓缩。分子筛层析图谱见图3，结果表明ILT3CC和ILT3wt溶液性质保持一致。进行完分子筛层析后，将收集的ILT3cc蛋白进行SDS-PAGE，电泳图见图4。将ILT3cc蛋白和ILT3wt蛋白4°C放置24小时，然后进行电泳，结果见图5。结果表明，放置 24小时后，与ILT3wt蛋白相比，ILT3cc蛋白降解情况明显改观。二、蛋白常温静置实验分别将同批纯化的浓度为lOmg/mL的ILT3cc蛋白和浓度为10mg/mL的ILT3wt蛋 白室温(28摄氏度)静置24小时，结果如图6。图6中，A :ILT3cc ;B :ILT3wt。24小时常 温静置之后，ILT3wt蛋白溶液已经浑浊不堪，蛋白质变性沉淀，而ILT3cc蛋白溶液依旧澄 清。结果表明，ILT3cc蛋白的稳定性显著高于ILT3wt蛋白。三、分析超速离心将制备好的ILT3cc蛋白和ILT3wt蛋白分别浓缩，浓度控制在A280 = 1.0AU，缓冲 体系为 20mM Tris-Cl, 150mM NaCl，pH 8.0。测定样品(400 μ L)和空白参比(400 μ L, 20mM Tris-Cl, 150mM NaCl，pH 8. 0)注入到离心机的比色杯中(Beckman Coulter An_60)。转子 转动速度为54，OOOrpm,同时每隔480s时测定比色杯紫外光的吸收谱，进一步用软件 计算 沉降速率(SEDFIT program ver. 11. 3b)。软件将每次测定的吸光谱线进行拟合，经过计算得出的沉降速率和分子量结果， 见图7。图7中，A :ILT3wt的分子量分布；B :ILT3cc的分子量分布；C :ILT3wt的沉降速率； D :ILT3cc的沉降速率。结果表明，虽然ILT3cc和ILT3wt的沉降速率和分子量分布平均 值一致，符合理论数值，但是明显的，ILT3cc比ILT3wt数值分布要集中，也说明ILT3cc比 ILT3wt蛋白质分子在溶液中显得更刚性或者更加均一。四、蛋白质结晶实验一般说来，排除浓度、温度、条件等因素的影响，蛋白质结晶成功与否与蛋白质本 身的性质尤其是其刚性和稳定性有密切关系。将ILT3CC和ILT3wt蛋白平行进行蛋白质结 晶实验，ILT3cc成功结晶，ILT3wt未观察到晶体。ILT3cc结晶的照片见图8。序列表<110>中国科学院微生物研究所<120> 一种人免疫球蛋白样受体突变体及其应用<130>CGGNARY92140<160>4<210>1<211>196<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val lie151015Ser Trp Gly Asn Ser Val Thr lie Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala202530Arg Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Glu Ser Pro Ala Pro Trp Asp Arg
354045Gln Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser lie Pro Ser505560Met Thr Glu Asp Tyr Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Arg Ser Pro
65707580Val Gly Trp Ser Gln Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Met Thr Gly859095Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Leu Val Thr100105110Ser Gly Lys Ser Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Arg Ser Pro Met Asp115120125Thr Phe Leu Leu Cys Lys Glu Arg Ala Ala His Pro Leu Leu Cys Leu130135140Arg Ser Glu His Gly Ala Gln Gln His Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser145150155160Pro Val Thr Ser Val His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Ser His165170175Gly Phe Ser His Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu180185190lie Val Ser Gly195<210>2<211>196<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val lie151015Ser Trp Gly Asn Ser Val Thr lie Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala202530Arg Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Glu Ser Pro Ala Pro Trp Asp Arg354045Gln Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser lie Pro Ser505560Met Thr Glu Asp Tyr Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Arg Ser Pro65707580Val Gly Trp Ser Gln Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Met Thr Gly
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权利要求
一种人免疫球蛋白样受体突变体，是在人免疫球蛋白样受体中引入一个二硫键得到的人免疫球蛋白样受体突变体。
2.如权利要求1所述的人免疫球蛋白样受体突变体，其特征在于所述在人免疫球蛋 白样受体中引入一个二硫键是通过将人免疫球蛋白样受体的两个氨基酸残基突变为半胱 氨酸实现的。
3.如权利要求2所述的人免疫球蛋白样受体突变体，其特征在于所述人免疫球蛋白 样受体为ILT蛋白；在ILT蛋白中引入一个二硫键是通过将ILT蛋白自氮端第150-158位 氨基酸残基中的一个和第160-168位氨基酸残基中的一个突变为半胱氨酸实现的。
4.如权利要求3所述的人免疫球蛋白样受体突变体，其特征在于所述人免疫球蛋白 样受体为ILT3蛋白；在ILT3蛋白中引入一个二硫键是通过将ILT3蛋白自氮端第156位氨 基酸残基和第166位氨基酸残基突变为半胱氨酸实现的。
5.如权利要求4所述的人免疫球蛋白样受体突变体，其特征在于所述人免疫球蛋白 样受体的自氮端第24至219位氨基酸残基序列如序列表的序列1所示。
6.一种提高人免疫球蛋白样受体稳定性的方法，是在人免疫球蛋白样受体中引入一个 二硫键。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述在人免疫球蛋白样受体中引入一个二 硫键是通过将人免疫球蛋白样受体的两个氨基酸残基突变为半胱氨酸实现的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白样受体为ILT蛋白；在 ILT蛋白中引入一个二硫键是通过将ILT蛋白自氮端第150-158位氨基酸残基中的一个和 第160-168位氨基酸残基中的一个突变为半胱氨酸实现的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述人免疫球蛋白样受体为ILT3蛋白；在 ILT3蛋白中引入一个二硫键是通过将ILT3蛋白自氮端第156位氨基酸残基和第166位氨 基酸残基突变为半胱氨酸实现的。
10.权利要求5所述人免疫球蛋白样受体突变体的多肽片段，是序列表的序列1所示的 多肽片段。
全文摘要
本发明公开了一种人免疫球蛋白样受体突变体及其应用。本发明提供的人免疫球蛋白样受体突变体，是在人免疫球蛋白样受体中引入一个二硫键得到的人免疫球蛋白样受体突变体。本发明还提供了提高人免疫球蛋白样受体稳定性的方法，是在人免疫球蛋白样受体中引入一个二硫键。本发明的人免疫球蛋白样受体突变体可应用于对人免疫球蛋白样受体结构解析，也可以用于器官移植和肿瘤转移研究以及药物靶标的筛选。本发明具有重大的经济价值和社会意义。
文档编号C07K14/705GK101830978SQ20091007937
公开日2010年9月15日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者陈勇, 高福 申请人:中国科学院微生物研究所