专利名称：环五肽细胞凋亡酶抑制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一类环五肽化合物，特别涉及具有抑制细胞凋亡酶活性的一 类环五肽化合物及其制备方法。
背景技术：
环肽是一类结构比较特殊的肽类化合物，广泛存在于植物、动物、海洋 生物和发酵液中。按成环的特点，分为环肽和杂环肽两大类。这些化合物大 多具有良好的生理和药理活性，目前应用于临床的环肽药物有环孢素、万古 霉素等。与链肽相似，随着氨基酸排列的顺序的不同，环肽的结构不同，性 质不同，活性也不同。
由于环肽结构中，没有确切的碳端和氮端，在体内不易降解，有较长的 半衰期，表现出良好的酶稳定性，所以研究具有药用活性环肽是目前发现新 药的一种新的重要途径。
Caspases是一类细胞凋亡过程中起主要作用的细胞凋亡酶，细胞的增殖 与凋亡失衡可引起多种疾病的发生，凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病 和自身免疫疾病，而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重 症肝炎与退行性神经疾病，如Parkinson症、Huntington病、Alzheimer病、 缺血性心血管病、神经系统疾病、脊椎小脑失调、肌肉萎縮病、脑缺血、脑 损伤等。caspases酶抑制剂有望成为治疗一些退行性疾病和促进严重损伤时 组织细胞修复的有效药物。
发明内容
本发明发现了具有全新结构的一类环五肽细胞凋亡酶抑制剂。 本发明还提供该环五肽细胞凋亡酶抑制剂的制备方法。 本发明所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，由五个氨基酸彼此之间以肽键 连接成环状结构，所述五个氨基酸中一个为芳基氨基酸， 一个为环状氨基酸，另外三个氨基酸为脂肪基氨基酸或取代脂肪基氨基酸，所述五个氨基酸相互 独立，并非完全相同，按随机顺序排列。
所述环状氨基酸为脯氨酸或取代脯氨酸，所述取代脯氨酸的取代基为 氢、羟基、卤素、烃氧基、酰氧基、巯基、垸硫基、过硫基、垸基过硫基、 磺酰基或亚磺酰基等。
所述脂肪基氨基酸和取代的脂肪基氨基酸中的脂肪基为甲基、乙基、异 丙基、异丁基、仲丁基、羟垸基、羧基垸基、氨甲酰基烷基以及氨基烷基等。
本发明所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，所含芳基氨基酸的芳基为
CH2ArX或ArX;
其中Ar为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、 呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、刚哚基或苯并呋喃基等；
X为氢、卤素、烷氧基、糖苷基、苯氧基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基 乙氧基、二甲氨基丙氧基、二乙氨基丙氧基、N-吡咯乙氧基、N-吡咯丙氧基、 N-哌啶乙氧基或N-哌啶丙氧基等；
所述取代脯氨酸的取代基为氢、羟基、卣素、烃氧基、酰氧基、巯基、 烷硫基、过硫基、烷基过硫基、磺酰基或亚磺酰基等。
本发明所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，具有式(I )结构，
(I )
其中，
R为氢、羟基、垸氧基或垸硫基等；
R1-R4为各自独立的异丙基、异丁基、甲基、羧基烷基、羟基烷基、氨 甲酰基烷基、氨基烷基、胍基烷基、CH2ArX或ArX;
Ar为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基、苯并呋喃基和tl引哚基等芳杂环
基；
X为氢、卤素、烷氧基、糖苷基、苯氧基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基 乙氧基、二甲氨基丙氧基或二乙氨基丙氧基等。 所述五个氨基酸包括L-或D-型氨基酸。
所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其为萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽。 所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其为萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽。 所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其为亮-亮-缬-亮-4-氯苯丙环五肽。 所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其表现出良好的抑制细胞凋亡酶 (caspases)的活性，特别是对caspase-3酶的抑制活性。
本发明所述环五肽细胞凋亡酶抑制剂的制备采用液相合成方法实现的， 合成路线为2+3的会聚式，使用的氨基酸氮端用Boc保护，而碳端的保护采 用形成甲酯的方法，肽链的增长使用HBTU或HATU或HCTU或PyB0P等作为 縮合剂，其合成方法包括如下步骤 (2) 二肽片段的合成<formula>formula see original document page 8</formula>
(2)三肽片段的合成:<formula>formula see original document page 8</formula>
(3)五肽的合成和环合反应:<formula>formula see original document page 9</formula>
Caspases是一类细胞凋亡过程中起主要作用的细胞凋亡酶。惊奇的发 现，本发明所述的环五肽化合物对caspases酶具有良好的抑制作用，特别 是对caspase-3的抑制活性更强，其中有些化合物的ICs。为2. 02nmol/mL， 且显示出良好的量效关系。
本发明的特点在于
1) 设计合成的环五肽为一类全新化合物。
2) 环五肽中涉及的氨基酸，包含了 L-氨基酸，D-氨基酸、N-烷基氨基 酸和其他非天然氨基酸。
3)首次发现了环肽，特别是环五肽类化合物具有抑制caspases酶的活
性。 附1为萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽、萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽、亮-亮_缬
-亮-4-氯苯丙环五肽对caspase -3酶抑制活性的量效关系。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图1为萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽、萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽、亮-亮-缬 -亮-4-氯苯丙环五肽对caspase -3酶抑制活性的量效关系。 实例1萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽的合成
1) 脯-萘丙甲酯的合成。将2隱ol Boc-脯氨酸和2 mmol HATU、 4 mmol DIPEA加入到盛有30 mL THF和6 mL DMF溶液的配有氯化钙干燥管的100 mL 单口瓶中搅拌溶解，然后再加入1 mmol萘丙氨酸甲酯，于室温下搅拌反应 过夜。反应液浓縮除去大部分溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解后，分别用水、 5 % NaHC03、饱和NaCl各洗2次，有机相用无水船2304干燥。过滤，浓縮， 重结晶得类白色固体产物，产率为90%。然后将此溶解到30 mL二氯甲烷和 20mL三氟醋酸中，于室温下搅拌反应45 min。减压除去DCM和TFA，即得 产物脯-萘丙甲酯粗产品。
2) Boc-亮-亮-缬三肽的合成。在盛有30 mL THF和6 mL DMF溶液的 100 mL单口瓶中，加入2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HBTU以及4 mmol DIPEA，搅拌15min，而后再加入1 mmol的缬氨酸甲酯，并于室温搅拌过 夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入50mL水，用60mL乙酸乙酯萃取， 合并有机相，分别用水、5°/。NaHC03、 2 % HC1、饱和NaCl各洗2次，无 水Na2S04干燥。过滤，浓縮，在剩余物中加入30mLDCM和20mLTFA， 室温下搅拌反应45 min。减压除去DCM和TFA，获得亮-缬甲酯三氟醋酸盐。 将此盐溶于30 mL THF和6 mL DMF溶液中，再加入2 mmol Boc-亮氨酸和 2 mmol HBTU以及4 mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余 物中加入50 mL水，用80 mL乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、5% NaHC03、 2Q/。HCl和饱和NaCl各洗2次，无水Na2S04干燥。过滤、浓縮，产物经硅 胶柱层析纯化，得固体产物，收率为82.6%。用17.5mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5 mmol LiOH与2.5 mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌 反应8h。减压除去THF，加入20mL水，用2 %稀盐酸调节溶液的pH至 4.5-6，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水Na2S04干燥过夜。过滤，浓縮， 即得Boc-亮-亮-缬三肽。
3) 萘丙-亮-亮-缬-脯五肽的合成。在盛有1. lmmol Boc-亮-亮-缬三肽 的30 mL THF和6 mL DMF溶液中，先加入2. 5 mmol HATU以及5 mmol的DIPEA， 搅拌反应15min，再加入lramol脯-萘丙甲酯，于室温条件下搅拌反应过夜。 减压浓縮，用乙酸乙酯溶解，依次用水、5%NaHC03、 2%盐酸和饱和食盐水各 洗两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压除去溶剂，重结晶得Boc-亮-亮-缬-脯-萘丙甲酯，收率86. 4%。用30 mL THF溶解所得固体，并转移到盛有5 mmol LiOH与4 mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应10 h。用TLC跟踪反 应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水30mL，用稀盐酸调PH=3 4， 80 mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。减压浓縮得 Boc-亮-亮-缬-脯-萘丙五肽后，溶解到30mL 二氯甲垸和30mL三氟乙酸的溶 液中，常温搅拌反应2h。减压除去二氯甲垸和三氟乙酸，即得萘丙-亮-亮-缬-脯五肽。
4) 萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽的合成。将0. 5 mmol萘丙-亮-亮-缬-脯五 肽加入到单口瓶中，溶解于30 mL N，N-二甲基甲酰胺和270 mL二氯甲烷形 成的溶液。搅拌溶解之后，加入2. 5 mmol PyB0P、 0. 5mmolHATU、 3. 5 mmol 二异丙基乙胺，常温搅拌反应72 h。减压浓縮除去溶剂，残余液用100 mL 乙酸乙酯萃取，合并有机相。依次用水、5% NaHC03、 2%盐酸、水和饱和 食盐水各洗两次，无水硫酸钠千燥。抽滤，减压浓縮除去溶剂。经硅胶柱层 析纯化，得到萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽，收率73.4%。 1H NMR (500MHz, CDC13) S 0.88-0.90 (m， 6H), 0.94 (d， J=7.5 Hz， 6H), 1.02 (d， J=7.0 Hz， 6H)， 1.38-1.43 (m， 1H), 1.45-1.48 (m， 2H), 1.54-1.56 (m， 2H), 1.73-1.75 (m， 1H), 1.98 (ddd， J = 3.4 Hz, 1H), 1.94 (m, 1H), 1.90 (m, 1H)， 2.05 (m， 1H), 2.26 (m， 1H), 3.16 (dd， J=13.0Hz， 5.5Hz, 1H), 3.32 (t， J=7.5Hz， 1H), 3.53 (dd， J = 5.0 Hz， 2H) , 4.03 (t，J=7.5Hz, 1H)， 4.21(dd, J = 6.5Hz, 1H)， 4.35 (dd， J=10.5Hz， 6Hz, 1H)， 4.42 (t， J=8.0Hz, 1H), 4.78 (dd, J=9.0Hz， 3.0Hz， IH)， 6.64 (brs, IH)， 6.84 (brs, IH)， 7.32(d，lH)， 7.40-7.43(m， 2H), 7.48 (brs, 1H), 7.53 (brs, 1H)， 7.66(s，lH), 7.82-7.79 (m，3H); HRMS (ESI, M+l) C35H49N505，计算值为619.3734，实 测值为619.3735。
实例2亮-亮-缬-亮-4-氯苯丙环五肽的合成
1 )亮-4-氯苯丙氨酸甲酯的合成。将2 mmol Boc-亮氨酸、2 mmol HBTU、 4 mmol DIPEA加入到盛有30 mL THF和4 mL DMF溶液的配有氯化转干燥 管的100mL单口瓶中搅拌反应30min.，然后再加入1 mmol4-溴苯丙氨酸甲 酯，于室温下搅拌反应过夜。反应液浓縮除去大部分溶剂，残余物用乙酸乙 酯溶解后，分别用20mL水、20mL5%NaHCO3、 20 mL饱和NaCl各洗2 次，有机相用无水Na2S04干燥过夜。过滤，浓縮，重结晶得类白色固体产 物，产率为85 %。然后将此溶解到30 mL 二氯甲烷和20 mL三氟醋酸中， 于室温下搅拌反应45 min。减压除去DCM和TFA，即得产物亮-4-氯苯丙氨 酸甲酯粗产品，产率为90%。
2) Boc-亮-亮-缬三肽的合成。在盛有30mLTHF、 4mLDMF、 2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HBTU以及4 mmol DIPEA的100 mL单口瓶中，于搅 拌条件下加入l mmol的缬氨酸甲酯盐酸盐，室温反应过夜。反应液浓縮， 在所得残余物中加入50mL水，用40mL乙酸乙酯萃取5次，合并有机相， 分别用水、5%NaHC03、 2 % HC1、饱和NaCl各洗2次，无水Na2S04干 燥，过滤，浓縮。在剩余物中加入30mLDCM和20mLTFA，室温下搅拌 反应45min。减压除去DCM和TFA，获得亮-缬甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶 于30 mL THF和4 mL DMF，此后加入2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HBTU 以及4 mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入50 mL 水，用乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、5%NaHC03、 2y。HCl和饱和NaCl 各洗2次，无水Na2S04干燥过夜。过滤、浓縮，产物经重结晶纯化，得固 体产物，产率85%。用17.5 mL THF溶解所得固体，并转移到盛有5 mmolLiOH与2.5 mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应6 h。减压除去THF， 加入20mL水，用2。/。盐酸调节溶液的pH至4.5-6，用乙酸乙酯萃取，合并 有机相，无水Na2S04干燥过夜。过滤，浓縮，即得Boc-亮-亮-缬三肽。
3) 亮-亮-缬-亮-对氯苯丙五肽的合成。在盛有l.lmmolBoc-亮-亮-缬三 肽的30 mL THF和6 mL DMF溶液中，先加入2.5 mmol HATU以及5 mmol 的DIPEA，搅拌溶解后继续反应10min，再加入lmmol亮-对氯苯丙甲酯， 于室温条件下搅拌反应过夜，用TLC检测反应的进展。减压浓縮，加水150 mL，用乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5%NaHC03、 2%盐酸 和饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥过夜。抽滤，减压除去溶剂，重结 晶得Boc-亮-亮-缬-亮-对氯苯丙氨酸甲酯，收率88%。用30 mL THF溶解所 得固体，并转移到盛有5mmolLiOH与4mL水形成的溶液的烧瓶中，室温 下搅拌反应8h。用TLC跟踪反应，待反应结束后减压除去THF。在残余物 中加水30mL，用稀盐酸调pH-3 4，乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无 水硫酸钠干燥过夜。减压浓縮获得Boc-亮-亮-缬-亮-对氯苯丙五肽。溶解此 到20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸的溶液中，常温搅拌反应2h。减压除去 二氯甲烷和三氟乙酸，即得亮-亮-缬-亮-对氯苯丙五肽。
4) 亮-亮-缬-亮-对氯苯丙环五肽的合成。0.5 mmol亮-亮-缬-亮-对氯苯 丙五肽加入到单口瓶中，搅拌溶解于30 mL DMF和270 mL 二氯甲烷形成的 溶液，加入2.5mmolPyBOP、 0.5 mmol HATU、 6mmol二异丙基乙胺，常 温搅拌反应36h。减压浓縮除去溶剂，在残余液中加入50mL水，用100 mL 乙酸乙酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5% NaHC03、 2%盐酸、水和 饱和食盐水各洗两次，无水硫酸钠干燥过夜。抽滤，浓縮除去溶剂。经硅胶 柱层析纯化，得到对氟苯丙-亮-亮-缬-亮环五肽，收率70.3°/。。 1H NMR (500MHz， CDC13) S 0.80-0.83(m, 6H)， 0.87-0.9l(m， 6H)， 0.93 (d， J=7.5 Hz， 6H), 0.99 (d， J=7.0 Hz, 6H)， 1.26-1.30 (m, 2H)， 1.43-1.45 (m， 2H), 1.68-1.70 (m， 2H), 1.82 (m, 1H)， 1.95 (m, 1H)， 2.04 (ddd， J = 3.4 Hz， 1H), 2.08 (m， 1H)， 3.23 (dd， J=13.0Hz， 5.5Hz， 1H)， 3.40 (t， J=7.5Hz， 1H)， 3.56 (dd, J = 5.0 Hz, 2H) ， 4.03 (br，1H)， 4.20(dd, J = 6.5Hz, 1H)， 4,40 (dd， J=10.5Hz， 6Hz， 1H)， 4.55 (t， J=8.0Hz, 1H)， 4.76 (dd， J=9.0Hz, 3.0Hz， 1H)， 6.58 (brs, 1H), 6.80 (brs， 1H), 7.13 (d， J=8.0Hz， 2H), 7.21(d， J=8.0Hz， 2H), 7.62 (brs, 1H); HRMS (ESI, M+l) C32H50C1N5O5 ，计算值为619.3500、 620.3534和621.3471，实测值为 619.4996、 620.3530和621.3468。
实例3萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽的合成
1) 亮-萘丙甲酯二肽的合成。将2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HCTU、 4 mmol DIPEA加入到盛有30 mL THF和6 mL DMF溶液的100 mL单口瓶中 搅拌溶解，然后再加入l mmol喹啉丙氨酸甲酯，于室温下搅拌反应过夜。 反应液浓縮除去大部分溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解后，分别用水、5 % NaHC03、饱和NaCl各洗2次，有机相用无水Na2S04干燥。过滤，浓縮， 重结晶得类白色固体产物，产率为85 %。然后将此溶解到30 mL二氯甲烷 和30mL三氟醋酸中，于室温下搅拌反应45 min。减压除去DCM和TFA， 即得产物亮-喹啉丙甲酯粗产品。
2) Boc-脯-亮-缬三肽的合成。在盛有30 mL THF、4 mL DMF、2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HBTU以及4 mmol DIPEA的100 mL单口瓶中，于搅拌条 件下加入1 mmol的缬氨酸甲酯盐酸盐，室温反应过夜。反应液浓縮，在所 得残余物中加入50mL水，用40mL乙酸乙酯萃取5次，合并有机相，分别 用水、5%NaHC03、 2 % HC1、饱和NaCl各洗2次，无水Na2S04干燥， 过滤，浓縮。在剩余物中加入30mLDCM和20mLTFA，室温下搅拌反应 45min。减压除去DCM和TFA，获得亮-缬甲酯三氟醋酸盐。将此盐溶于30 mL THF和4 mL DMF，此后加入2 mmol Boc-亮氨酸和2 mmol HBTU以及4 mmol的DIPEA，搅拌过夜。反应液浓縮，在所得残余物中加入50 mL水， 用乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、5%NaHC03、 2 % HC1饱和NaCl各洗 2次，无水Na2S04干燥过夜。过滤、浓缩，产物经重结晶纯化，得固体产 物，产率83%。用17.5mLTHF溶解所得固体，并转移到盛有5 mmol LiOH 与2.5mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应6h。减压除去THF，加入20mL水，用2。/。盐酸调节溶液的pH至4.5-6，用乙酸乙酯萃取，合并有 机相，无水Na2S04干燥过夜。过滤，浓縮，即得Boc-亮-亮-缬三肽。
3) 萘丙-脯-亮-缬-亮丙五肽的合成。在盛有l.lmmol Boc-脯-亮-缬三肽 的30 mL THF和6 mL DMF溶液中，先加入2.5 mmol HATU以及5 mmol的 DIPEA，搅拌10min后，再加入1 mmol亮-萘丙甲酯，于室温条件下搅拌反 应过夜，用TLC检测反应。减压浓縮，浓縮残余物中加水80mL，用乙酸乙 酯萃取五次，合并有机相。依次用水、5% NaHC03、 2%盐酸和饱和食盐水 各洗两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，减压除去溶剂，重结晶得Boc-脯-亮-缬-亮-萘丙甲酯，收率86.3%。用30 mL THF溶解所得固体，并转移到盛有5 mmol LiOH与4mL水形成的溶液的烧瓶中，室温下搅拌反应8h。用TLC跟踪反 应，待反应结束后减压除去THF。在残余物中加水30 mL，用稀盐酸调pH=3 4, 300mL乙酸乙酯萃取四次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。减压浓縮获 得Boc-脯-亮-缬-亮-萘丙五肽后，溶解到30mL 二氯甲烷和30mL三氟乙酸的 溶液中，常温搅拌反应2h。减压除去二氯甲烷和三氟乙酸，即得萘丙-脯-亮-缬-亮五肽。
4) 萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽的合成。0.5 mmol萘丙-脯-亮-缬-亮五肽加 入到单口瓶中，溶解于30mLN,N-二甲基甲酰胺和270 mL二氯甲烷中。随 着搅拌，加入2.5mmolPyBOP、 0.5 mmol HATU、 6mmol二异丙基乙胺， 常温搅拌反应36h，用TLC检测反应。减压除去溶剂，残余液用乙酸乙酯萃 取五次，合并有机相。依次用水、5% NaHC03、 2%盐酸和饱和食盐水各洗 两次，无水硫酸钠干燥。抽滤，浓縮除去溶剂。经硅胶柱层析纯化，得到萘 丙-脯-亮-缬-亮环五肽，收率58.5%。 1H NMR (500MHz, CDC13) 5 0.80-0.83(m， 3H)， 0.87(m, 3H)， 0.93 (d， J=7.5 Hz, 6H)， 0.99 (d, J=7.0 Hz, 6H)， 1.46-1.48 (m， 2H)， 1.63-1.65 (m, 2H)， 1.70-1.73 (m， 2H), 1.92 (m, 1H)， 1.95 (m, 1H)， 2.04 (ddd J = 3.4 Hz， 1H)， 2.08 (m, 1H), 2.19 (m， 1H), 3.23 (dd, J=13.0Hz, 5.5Hz， 1H)， 3.40 (t， J=7.5Hz, 1H)， 3.56 (dd， J = 5.0 Hz, 2H) , 4.03 (br， 1H)， 4.20(dd， J = 6.5Hz， 1H)， 4.40 (dd, J=10.5Hz, 6Hz, 1H), 4.55 (t， J=8.0Hz, 1H)， 4.76 (dd， J=9.0Hz,3.0Hz， 1H)， 6.58 (brs， 1H)， 6.80 (brs， 1H)， 7.38(d,lH), 7.43-7.50(m, 2H), 7.53 (brs, 1H), 7.62 (brs， 1H), 7.76(s,lH), 7. 79-7. 82 (m，3H); HRMS (ESI， M+l) C35H49N505,计算值为619.3734，实测值为619.3732。 实例4酶抑制活性测试
选择人体重组caspase-3酶为模型，使用荧光测定法，在激发光355nM/ 发射光465nM条件下，以多肽一ASP-AMC (7-氨基-4-甲基香豆素荧光标记 的多肽ASP)对caspase的作用为对照，测定环五肽的活性。测试在孔体积 为210微升的96孔板上进行，每孔中加入20mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠 (pH为7.4) 、 10%蔗糖、lOOmM氯化钠、0.1%的3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲 氨基]丙磺酸盐、2mMEDTA和10微摩尔的7-氨基-4-甲基香豆素荧光标记的 多肽ASP，依据7-氨基-4-甲基香豆素聚集的量优化出浓度与酶作用的曲线， 再用相同的方法测定待测样品的抑制率。被测样溶解在二甲亚砜中，10微升 的样加入到包含100微升caspase酶溶液，然后在冰上孵化30分钟。100微 升底物溶液加到每一个孔中，样品板在37'C下培养l-2小时，最终，二甲亚 砜浓度占总体积的5%。 7-氨基-4-甲基香豆素的量通过荧光光度计来测量。 化合物对细胞凋亡酶抑制的IC50值为三次独立测定计算的平均值。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而 并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在 上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法 对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见 的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
权利要求
1、环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，该类化合物由五个氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，所述五个氨基酸中一个为芳基氨基酸，一个为环状氨基酸，另外三个氨基酸为脂肪基氨基酸或取代脂肪基氨基酸，所述五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。
2、 根据权利要求1所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，所 述环状氨基酸为脯氨酸或取代脯氨酸，所述取代脯氨酸的取代基为氢、羟基、 卤素、烃氧基、酰氧基、巯基、垸硫基、过硫基、烷基过硫基、磺酰基或亚 磺酰基中的一种。
3、 根据权利要求1所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，所 述脂肪基氨基酸的脂肪基为甲基、乙基、异丙基、异丁基、仲丁基、羟烷基、 氨基烷基、羧基垸基、氨甲酰基烷基中的一种。
4、 根据权利要求1所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，所 述芳基氨基酸的芳基为CH2ArX或ArX;其中Ar为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、 呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、刚哚基或苯并呋喃基中的一种；X为氢、卤素、烷氧基、糖苷基、苯氧基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基 乙氧基、二甲氨基丙氧基、二乙氨基丙氧基、N-吡咯乙氧基、N-吡咯丙氧基、 N-哌啶乙氧基或N-哌啶丙氧基中的一种。
5、 根据权利要求1所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，具 有式(I )结构，其中，R为氢、羟基、垸氧基或烷硫基中的一种；Rl-R4为各自独立的异丙基、异丁基、甲基、羧基烷基、羟基烷基、氨 基烷基、羧基烷基、氨甲酰基烷基、胍基烷基、CH2ArX或ArX;Ar为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、 噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基、苯并呋喃基或苯并吡咯基等芳 杂环基；X为氢、卤素、烷氧基、糖苷基、苯氧基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基 乙氧基、二甲氨基丙氧基或二乙氨基丙氧基中的一种。
6、 根据权利要求1所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，所 述五个氨基酸包括为L-或D-型氨基酸。
7、 根据权利要求5所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，其 为萘丙-脯-亮-缬-亮环五肽，或为萘丙-亮-亮-缬-脯环五肽，或为亮-亮-缬 -亮_4-氯苯丙环五肽。
8、 根据权利要求5所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂，其特征在于，其 表现出良好的抑制细胞凋亡酶(caspases)的活性，特别是对caspase-3酶 的抑制活性。
9、 一种如权利要求1~8所述的环五肽细胞凋亡酶抑制剂的制备方法， 其特征在于，包括以下步骤(1) 二肽片段的合成<formula>formula see original document page 3</formula>(2) 三肽片段的合成<formula>formula see original document page 4</formula>其中，R为氢、羟基、烷氧基或烷硫基；RrR4为各自独立的异丙基、异丁基、甲基、羧基烷基、羟基烷基、氨基 烷基、羧基垸基、氨甲酰基垸基、胍基烷基、CH2ArX或ArX;Ar为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基、吡咯基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、吲哚基、苯并呋喃基或苯并吡咯基等芳 杂环基；X为氢、卤素、烷氧基、糖苷基、苯氧基、二甲氨基乙氧基、二乙氨基 乙氧基、二甲氨基丙氧基或二乙氨基丙氧基。
全文摘要
本发明公开了一类环五肽细胞凋亡酶抑制剂及其制备方法，该化合物由五个氨基酸彼此之间以肽键连接成环状结构，所述五个氨基酸中一个为芳基氨基酸，一个为环状氨基酸，另外三个氨基酸为脂肪基氨基酸或取代脂肪基氨基酸，所述五个氨基酸相互独立，并非完全相同，按随机顺序排列。本发明所述的环五肽化合物对caspases酶具有良好的抑制作用，特别是对caspase-3的抑制活性更强。
文档编号C07K7/64GK101544688SQ20091007428
公开日2009年9月30日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者刘守信, 姚子俭, 张萧洁, 李军章, 李振朝, 杨毅华 申请人:河北科技大学