专利名称：：抗菌肽lfb-me及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法。
背景技术：
：抗菌肽是动物体内抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞的一类小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌、抗肿瘤、调节免疫与消炎等多种生物学功能，同时具有无毒性、无耐药性、无残留与污染等优点，而且其热稳定性好，有希望成为新一代的抗菌剂，这些肽类抗菌物质显示了在医学、畜牧、兽医及其食品行业上潜在的研究和应用价值，近年来对抗菌肽的研究与开发成为研究热点。然而，与抗生素相比，抗菌肽的活性，尤其是抗菌活性不够理想，寻求功能理想、活性更强的抗菌肽是抗菌肽研究的热点问题。目前，在众多抗菌肽中，阳离子型的牛乳铁蛋白素(LfcinB)和天蚕素A(CecropinA，CA)是常见的两种抗菌肽，但是依然存在抗菌活性不高的问题。
发明内容本发明目的是为了解决现有抗菌肽的抗菌活性不高的问题，而提供抗菌肽LFB-ME及其制备方法。抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAl化ysTrpLysLeuPheLysLysIle。制备抗菌肽LFB-ME的方法按以下步骤进行一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，再采用多肽合成仪进行固相化学法合成，得肽树脂；二、肽树脂经TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色谱进行纯化，即完成抗菌肽的制备；其中步骤一中牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步骤一中天蚕素A的活性中心氨基酸序列为LysTrpLysLeuPheLysLysIle步骤一固相化学法合成中所用固相载体为Wang树脂(王树脂)，单体为Fmoc-氨基酸(9-芴甲氧羰基-氨基酸)，縮合剂为DCC(N，N'-二环己基碳二亚胺)，活化剂为H0Bt(N-羟基苯并三氮唑)，Fmoc脱除剂为体积浓度20%的六氢吡啶二氯甲烷溶液。本发明中制备抗菌肽的操作方法简单，所得抗菌肽LFB-ME对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有抑制作用，与牛乳铁蛋白素和天蚕素A相比，抗菌活性有了明显提高，且无溶血毒性和动物毒性，是一种健康安全、具有更好抗菌活性的抗菌肽。图1为具体实施方式二中抗菌肽的质谱图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。具体实施方式二本实施方式制备抗菌肽LFB-ME的方法按以下步骤进行一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，再采用多肽合成仪进行固相化学法合成，得肽树脂；二、肽树脂经TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色谱进行纯化，即完成抗菌肽的制备；其中步骤一中牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步骤一中天蚕素A的活性中心氨基酸序列为LysTrpLysLeuPheLysLysIle;步骤一固相化学法合成中所用固相载体为Wang树脂，单体为Fmoc-氨基酸，縮合剂为DCC，活化剂为H0Bt，Fmoc脱除剂为体积浓度20%的六氢吡啶二氯甲烷溶液。本实施方式中Wang树脂、Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt按体积比1:3:4:l混合。本实施方式具体操作步骤如下抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为N-PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle-C。1、制备从C端到N端逐个进行，由多肽合成仪自动控制。首先将Fmoc-Ile接入Wang树脂，脱去Fmoc基团得lie-Wang树脂；在lie-Wang树脂上再链接FmOC-LyS-Trt-0H(9-芴甲氧羰基-三苯基-赖氨酸)，再脱去Fmoc基团；依次从C端到N端逐个进行，至反应结束，得脱去Fmoc基团的侧链保护的肽树脂(具体操作步骤见多肽合成仪操作指南)。2、在肽树脂中，加入切割试剂，在2(TC避光条件下搅拌反应2h，过滤，滤液保留待用；沉淀用TFA(三氟乙酸)洗涤2次，然后将洗液与滤液混合，置于旋转蒸发仪浓縮，再加入510倍体积的预冷无水乙醚，-2(TC下沉淀3h，析出白色粉末状物，以4000r/min离心10min，收集沉淀，然后用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得多肽；其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按质量比95:2.5:2.5混合而成。3、用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调pH5.0)平衡柱30min，用90%乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按体积比30:7070:30混合而成)，流速lml/min，检测波220nm，收集主峰，冻干；再利用高压反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1%TFA/水溶液；洗脱液B为0.1%TFA/乙腈溶液，洗脱梯度为25%B40%B，洗脱时间为12min，流速为lmL/min，其余条件同上，收集主峰，冻干，得抗菌肽。4、鉴定制备的抗菌肽LFB-ME经质谱分析，抗菌肽LFB-ME在质谱图(图1)中显示的分子量为3121.91D，与理论分子量3121.8D基本一致，抗菌肽LFB-ME的纯度大于98%;色谱条件PhenomenexC18(250mmX4.6mm)柱，洗脱剂为10%40%甲醇(0.1%)，流速lml/min，检测波长220nm，应用电喷雾质谱法测定肽的分子量。本实施方式中所用试剂均为购买得到。抗菌肽LFB-ME的体外抗菌活性检测，用LfcinB和CecropinA作为对照体外抗菌活性检测分别采用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌；5mlMH液体培养基37°C、180r/min下培养过夜，得培养物，然后用无菌的MHB培养基将培养物稀释至2X105CFU/ml7X1()5CFU/ml，得菌液；用0.01%乙酸(0.2%BSA)稀释得到系列10倍测试浓度的抗菌肽LFB-ME溶解液；将菌液分别加到96孔细胞培养板，每行的1号孔至11号？L每孔100iU;12号孔不加菌液，而是加入100iU的新鲜MHB培养基作为参比对照。1号孔至10号孔对应添加11iU的抗菌肽LFB-ME溶解液(11号孔不加抗菌肽LFB-ME溶解液，作为对照)；将96孔细胞培养板置于37。C恒温培养18_24h，调整转速100-200r/min，然后用酶标仪在490nm波长下进行吸光度检测，比11号孔低的吸光度低50%以上的孔内的抗菌肽LFB-ME溶解液的浓度即定义为抗菌肽LFB-ME溶解液对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。LfcinB和CecropinA的体外抗菌活性检测方法同上。检测结果如表1所示，抗菌肽LFB-ME的抗菌活性明显提高。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>抗菌肽LFB-ME的体外溶血活性检测，检测用血液样品取自正常人血液，检测步骤如下新鲜血液900Xg离心10min，弃上清。加入5倍PBS，悬浮，900Xg离心lOmin，重复洗涤三次。加入11.5倍PBS悬浮，制成8X(v/v)血细胞悬浮液。取100iU血细胞悬浮液，加入lOOiU含有一定浓度抗菌肽的PBS，37。C培养lh。加入空白PBS和O.1%TritonX100处理组作为阴性和阳性对照。lOOOXg离心lOmin，将上清转移制96孔培养板，414nm测定吸光值。检测结果为，在256g/ml浓度下没有溶血活性。抗菌肽LFB-ME的动物体内急性毒性试验采用昆明白小鼠40只，雌雄各半，体重25士0.28g，按照lmg/kg剂量肌肉注射抗菌肽LFB-ME，每日一次，连续7天，观察小鼠毒性反应，结果表明，肌注抗菌肽LFB-ME7天后，小鼠无异常反应，活动正常，60只小鼠全部存活，证明抗菌肽LFB-ME无毒副作用。序列表〈110〉东北农业大学〈120〉抗菌肽LFB-ME及其制备方法〈160>3〈210>1〈211>15〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列。〈400〉1PheLysCysArgArgTrpGinTrpArgMetLysLysLeuGlyAla151015〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉惜古比天蚕(Hyalophora)〈220〉〈223〉天蚕素A的活性中心氨基酸序列。<400>2LysTrpLysLeuPheLysLyslie15〈210>3〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉抗菌肽LFB-ME氨基酸序列。〈400>3PheLysCysArgArgTrpGinTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLys151015TrpLysLeuPheLysLyslie20权利要求抗菌肽LFB-ME，其特征在于抗菌肽LFB-ME氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。2.制备如权利要求1所述的抗菌肽LFB-ME的方法，其特征在于制备抗菌肽LFB-ME的方法按以下步骤进行一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第lO位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，再采用多肽合成仪进行固相化学法合成，得肽树脂；二、肽树脂经TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色谱进行纯化，即完成抗菌肽的制备；其中步骤一中牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步骤一中天蚕素A的活性中心氨基酸序列为LysTrpLysLeuPheLysLysIle;步骤一固相化学法合成中所用固相载体为Wang树脂，单体为Fmoc-氨基酸，縮合剂为DCC，活化剂为H0Bt，Fmoc脱除剂为体积浓度20%的六氢吡啶二氯甲烷溶液。全文摘要抗菌肽LFB-ME及其制备方法，它涉及一种抗菌肽及其制备方法。它解决了现有抗菌肽的抗菌活性不高的问题。抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列为PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。方法一、将牛乳铁蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替换为Trp，然后与天蚕素A的活性中心氨基酸序列进行杂合，用多肽合成仪进行固相化学法合成得肽树脂；二、经TFA切割后得多肽，反相高效液相色谱进行纯化。本发明所得抗菌肽LFB-ME的抗菌活性有明显提高，且无溶血毒性和动物毒性。文档编号C07K1/00GK101717450SQ20091007325公开日2010年6月2日申请日期2009年11月24日优先权日2009年11月24日发明者冯兴军,宋雪莹,李静,赵晓宇,郭佳音申请人:东北农业大学