专利名称：一种异黄酮苷类化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的化合物，其来自于东方拟无枝酸菌ATCC 43491的发酵液，为发酵液 中一种含量较低的组分，通过分离纯化，经质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳 谱(13C NMR)检测，进行结构分析，确定该组分为一种新的化合物。
因此，本发明的首要目的在于，提供一种新的化合物t 本发明提供的化合物，如结构式(I)所示
本发明的另一个目的在于，提供如结构式(I)所示的化合物的制备方法。 本发明提供的化合物通过发酵培养东方拟无枝酸菌获得。 根据本发明，使用的东方拟无枝酸菌为东方拟无枝酸菌ATCC 43491。 根据本发明，该化合物的制备方法还包括以下步骤
A)东方拟无枝酸菌发酵液离心，收集离心上清；
B)对步骤A获得的离心上清，使用HPD100树脂进行初纯，收集洗脱液；
C)对步骤B中获得的洗脱液使用中压液相色谱精纯，收集洗脱液。
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根据本发明，HPD100树脂初纯包括以下步骤将离心上清液上样到HPD100树脂柱 上，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集乙醇体积百分比在25%到35%区段的洗脱液。根据本发明，中压液相色谱精纯包括以下步骤将步骤B中获得的洗脱液上样到 反相C-18柱；使用体积比为35 65的甲醇-水溶液1洗涤；使用体积比为44 56的甲 醇_水溶液2洗脱，收集洗脱液，获得本发明提供的化合物溶液，其中，在上样至C-18柱步 骤前，对步骤B中获得的洗脱液进行浓缩，甲醇-水溶液2的pH为3. 8。本发明提供了结构式(I)所示的新的化合物，该化合物对白色念珠菌具有很好的 抑制作用，可用于开发抗菌药物。
图1是东方拟无枝酸菌发酵离心上清的HPLC检测图谱，其中，峰1为化合物 LYV091x01 的峰。图2是中压液相色谱精纯后获得的洗脱后溶液的HPLC检测图谱。图3是化合物LYV091x01的质谱检测结果。图4是化合物LYV091x01的核磁共振氢谱的检测结果。图5是化合物LYV091x01的核磁共振碳谱的检测结果。图6是化合物LYV091x01的结构式。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。在本发明的下述实施例中，使用的培养基组成如下斜面培养基高氏1号琼脂培养基。种子培养基可溶性淀粉40g/L，去脂黄豆粉20g/L，甘油20g/L，葡萄糖15g/L， KN036g/L, KH2PO4O. 2g/L, MgCl2 · 6H20 0. 4g/L。发酵培养基乳糖20g/L，黄豆粉15g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁lg/L，磷酸氢二钾 lg/L。在本发明的下述实施例中，HPD100树脂初纯条件如下取发酵液离心上清液上HPD100树脂柱，以乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集乙醇 体积百分比在25% -35%区段的洗脱液，浓缩得LYV091x01粗品溶液。中压液相色谱纯化条件如下色谱柱为反相C-18柱。样品上柱后先用甲醇水=35 65 (体积比)溶液洗涤 除杂，然后用甲醇水(体积比)=44 56的溶液(磷酸调pH至3.8)洗脱，收集洗脱液， 以HPLC检测洗脱液中产物。HPLC条件如下流动相配制用0. 2%的三乙胺溶液，磷酸调pH至3. 2作为缓冲液。缓冲液与乙 睛和四氢呋喃按92 7 1的比例混合，摇勻，作为A液；缓冲溶液与乙睛和四氢呋喃按 70 29 1的比例混合，摇勻，作为B液。超声波脱气20min，备用。色谱柱=Diamonsi1 C18，0DS，ID 4. 6*200mm
4 实施例1、东方拟无枝酸菌ATCC 43491发酵取东方拟无枝酸菌ATCC 43491斜面培养物，接种到种子培养基中培养，于28°C、 220r/min转速的摇床上培养40小时，获得种子培养液。将种子培养液接种到发酵培养基中，于28°C、220r/min转速的摇床上培养120小 时，获得发酵液。用4mol/L盐酸酸化发酵液，调pH至3_4，离心收集上清液。实施例2、发酵液纯化将实施例1中获得的离心上清液进行HPLC检测，结果如图1所示，然后将离心上 清液分别经HPD100树脂初纯和中压液相色谱精纯，获得纯度达到98%的化合物，具体过程 如下A) HPD100 树脂初纯将离心上清液上样到HPD100树脂柱上，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集乙醇体积 百分比在25%到35%区段的洗脱液，然后将洗脱液浓缩，获得粗品浓缩液。B)采用中压液相色谱技术对步骤A中获得的浓缩液进行精纯，具体过程如下将上述粗品浓缩液上样到在反相C-18柱上，先使用甲醇水=35 65(体积比) 溶液洗脱除杂，然后使用甲醇水=44 56(体积比)溶液(磷酸调？!1至3.8)洗脱，收 集洗脱液，以HPLC检测洗脱液中产物，结果如图2所示。根据图2的结果，洗脱后溶液的纯 度达到98%。将获得的洗脱后溶液干燥，获得白色粉末，得LYV091x01精制品。实施例3、LYV091x01 鉴定LYV091x01的理化性质如下化合物LYV091x01为白色粉末，略带微黄色，易溶于水，可溶于甲醇，不溶于丙酮、 丁醇、乙酸乙酯；以质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳谱(13C NMR)对化合物 LYV091x01进行测定，结果如下化合物LYV091x01的质谱检测结果如图3所示，根据图3的结果，[M+H]+ = 563，
5[2M+H]+ = 1125，推断出化合物LYV091x01的分子量为562。化合物LYV091x01的核磁共振碳谱如图4所示，其核磁共振氢谱的检测结果如图 5所示，对核磁共振碳谱和核磁共振氢谱的解谱结果如表2所示，其中，标识为a的数据于 500MHz检测，标识为b的数据于400MHz检测。表2、LYV091x01核磁共振的碳谱和氢谱测定结果 根据上述结果，本发明获得的化合物LYV091x01的分子式为C27H3tlO13的结构式如 图6所示，该结构在现有技术中未见有报道，是一种新的化合物，由于其结构式与已知的异 黄酮苷化合物类似，因此可以归类为一种新的异黄酮苷化合物。实施例4、抑菌活性测定取直径为90mm、高16_17mm的平皿，注入加热融化的YPD培养基，待凝固后作为底 层培养基。取白色念珠菌ATCC10231菌种新鲜斜面，制成菌悬液，加到40°C左右的YPD培养 基中，倾倒在铺有底层培养基的平板上，冷却凝固。在制好的检测培养平板上，放置加有LYV091x01浓度为10 μ g/ml的待测样品液 20 μ 1的纸敏片(直径6mm)，将平板于28°C培养2天，测得抑菌圈直径为19mm。由此显示化合物LYV091x01对白色念珠菌有显著的抑制作用。综上所述，本发明提供了一种新的化合物，该化合物对白色念珠菌具有很好的抑 制作用，可用于制备抑菌药物，特别是用于抑制白色念珠菌的药物。
权利要求
一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式(I)所示F2009100528505C0000011.tif
2.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物通过发酵培养东 方拟无枝酸菌获得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述东方拟无枝酸菌为东方拟无枝 酸菌 ATCC 43491。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤A)东方拟无枝酸菌发酵液离心，收集离心上清；B)对步骤A获得的离心上清，使用HPDlOO树脂进行初纯，收集洗脱液；C)对步骤B中获得的洗脱液使用中压液相色谱精纯，收集洗脱液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述HPDlOO树脂初纯包括以下步骤 将离心上清液上样到HPDlOO树脂柱上，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集乙醇体积百分比在 25%到35%区段的洗脱液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述中压液相色谱精纯包括以下步 骤将步骤B中获得的洗脱液上样到反相C-18柱；使用体积比为35 65的甲醇-水溶液 1洗涤；使用体积比为44 56的甲醇-水溶液2洗脱，收集洗脱液，获得所述化合物溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在上样至所述C-18柱步骤前，对步骤 B中获得的所述洗脱液进行浓缩。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇-水溶液2的pH为3.8。
全文摘要
本发明提供了一种异黄酮苷类化合物以及该化合物的制备方法。本发明提供的化合物，其结构如结构式(I)所示，该化合物通过发酵培养东方拟无枝酸菌获得。本发明提供的化合物对白色念珠菌具有很好的抑制作用。
文档编号C07H17/07GK101921300SQ200910052850
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者刘效稳, 夏兴, 戈梅, 李秋爽, 杨天, 杨志钧, 殷瑜, 罗敏玉, 金文翔, 阮丽军, 陈代杰, 魏维 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司;浙江医药股份有限公司新昌制药厂