专利名称：利用具有反式剪接功能的蛋白质内含子制备重组多肽的利记博彩app
技术领域：
本发明属于重组多肽制备领域。利用具有反式剪切活性的蛋白质内含子的N-端 剪接结构域和C端剪接结构域之间的特异性相互作用，亲和纯化含有目标多肽的融合蛋 白，通过改变洗涤液的PH、盐浓度、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，诱导蛋白质内含 子的反式剪切使目标多肽从融合蛋白中释放出来，得到纯化。
背景技术：
随着基因组学和蛋白质组学的深入研究，越来越多的蛋白被发现。为了研究这些 蛋白质的生物功能，首先必须获得足够量的高活性、高纯度的样品。由于生物组织中的蛋白 成分非常复杂，而目标蛋白往往在组织中的含量很少，因此目前人们普遍采用基因工程而 很少采用组织提取的方法制备目标多肽[1]。为了方便从宿主细胞或其培养液中将目标蛋白纯化，人们往往在目标蛋白的 N-端或C-端加上亲和纯化的标签。由于大多数的活性小肽在宿主细胞中的表达效率低、稳 定性差[2]，通常必须采用和载体蛋白融合表达的方法来制备低分子量小肽[3，4]。但这些 亲和纯化标签以及载体蛋白往往影响目标蛋白或小肽的生物活性，必须经过蛋白水解酶或 化学裂解试剂处理，才能使目标蛋白或小肽与亲和标签或载体蛋白分开。其中蛋白水解酶 的专一性较高，但缺点是酶制剂的价格非常昂贵，且有时也会出现非特性酶解作用[5，6]； 化学裂解试剂虽然价廉，但存在裂解条件比较剧烈，容易使目标蛋白失去活性的缺陷[7， 8]。近年来，人们利用携带了亲和纯化标签的蛋白质内含子作为载体蛋白，来表达纯 化目标蛋白[9，10]。蛋白质内含子(intein)是指前体蛋白中的一段插入序列，在蛋白质 翻译后的成熟过程中它能自我催化蛋白质的剪接作用(protein splicing)，使自身从前体 蛋白中切除，并将其两侧称为蛋白外显子(extein)的多肽片段以正常的肽键连接形成有 功能的成熟蛋白[11，12]。蛋白质内含子和蛋白质外显子位于同一多肽链时产生的剪接作 用称为顺式剪接(cis-splicing)。蛋白质内含子通常含有N-端和C-端两个剪切结构域 (splicing domain)。一方面，蛋白质内含子N-端和C-端剪接区的功能具有相对独立性，当N-端的 Ser, Cys或Thr突变后，N-端的剪切功能丧失，但C-端的剪切功能仍保留；同样，当C-端 的Asn突变后，N-端的剪切功能仍然存在。另一方面，蛋白质内含子N-端和C-端剪接结构域的功能又相互依赖，只有在 C-端结构域存在时(即使该结构域C端Asn发生突变而丧失C-端剪接功能)，N-端结构域 才具有(N-端)剪接活性。同样，只有在N-端结构域存在时(即使该结构域N端Cys、Ser 或Thr发生突变而丧失了 N-端剪接功能)，C-端结构域才具有(C-端)剪接活性。基于蛋白质内含子的上述特性，人们通过定点突变，选择性地保留其N-端或C-端 剪接功能，成功地将蛋白质内含子融合表达系统用于目标蛋白的表达、纯化[13]。图1显示 了将目标蛋白与携带了几丁质结合(CBD-tag)亲和纯化标签的蛋白质内含子的N-端融合表达，通过改变洗涤液的PH、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，使目标多肽从融合蛋 白中释放出来，从而避免使用昂贵的蛋白水解酶。但从大肠杆菌中纯化重组蛋白时，该方法 仍然存在一些缺点，主要包括(1)必须使用完整的蛋白质内含子作为载体蛋白。载体蛋白 分子越大、结构越复杂，往往影响融合蛋白的表达效率，减少目标多肽在融合蛋白中所占的 比例，降低融合蛋白复性加工的产率。(2)蛋白质内含子的突变体通常仍然存在本底水平的 剪接活性。该活性降低了目标多肽的回收率。特别是当目标蛋白对宿主细胞具有毒性时， 蛋白质内含子本底水平的剪接活性将影响宿主细胞的生长。(3)蛋白质内含子本身不能用 作亲和纯化的配基。为了提高融合蛋白的纯化效率，必须在蛋白质内含子的N-端或C-端 附加亲和纯化标签，这进一步降低了目标多肽在融合蛋白中所占的比例。除具有顺式剪接功能的蛋白质内含子外，人们还发现了具有反式剪切活性的蛋 白质内含子[14，15]。反式剪切蛋白质内含子的N-端和C-端剪接结构域分别位于不 同的多肽链，当两个剪接结构域结合后仍能介导肽键的剪接，该剪接作用称为反式剪接 (trans-splicing) 0具有反式剪接功能的蛋白质内含子的一个重要结构特征是其N-端和 C-端剪接结构域之间具有一定的亲和力，能够形成稳定的复合物，有的甚至对高温、高盐及 变性剂(如尿素)具有一定的耐受性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基因工程融合蛋白表达、纯化、加工系统。本发明根据具有反式剪接功能的蛋白质内含子的特性，利用其N-端和C-端剪接 结构域之间的特异性亲和力来建立一个新的基因工程融合蛋白表达、亲和纯化系统；利用 N-端和C-端剪接结构域相互独立而又相互依赖的剪切活性建立一个新的基因工程融合蛋 白切割、加工系统。我们以具有反式剪接功能的蛋白质内含子dnaE为例，用图2来对本发明的技术措 施进行说明。将失去剪接功能的dnaE蛋白质内含子的C-端结构域作为亲和层析的配基， 通过与S印harose交联制备亲和层析柱，用来纯化与dnaE蛋白质内含子的N-端剪接结构 域融合表达的目标多肽。利用高盐浓度的洗涤缓冲液去除杂蛋白后，通过加巯基试剂或改 变层析柱内的PH及温度，诱导N-端结构域的剪接活性，使目标多肽从融合蛋白中释放出来 并得到纯化。在该表达系统中，蛋白质内含子起到了载体蛋白、亲和纯化、肽键特异性裂解 三重功能，极大地方便了目标多肽的制备。与其它融合蛋白的表达、纯化方法相比，本发明采用反式剪接蛋白质内含子制备 目标多肽的方法具有多种优点。采用蛋白水解酶裂解载体蛋白和目标多肽之间肽键(使目 标多肽从融合蛋白中释放出来)的方法通常具有一定的局限性，包括制备的目标多肽不能 是该蛋白水解酶的抑制剂，以及蛋白水解酶价格比较昂贵，有时存在非特异性水解等。本发 明在采用反式剪接蛋白内含子制备目标多肽过程中，不需要使用蛋白水解酶，因此可用于 制备各种蛋白水解酶抑制剂。与完整的蛋白质内含子相比，其N-端或C-端结构域分子较 小、结构较简单，因此用作载体蛋白时一般不影响融合蛋白的表达效率，并可提高目标多肽 在融合蛋白中所占的比例，增加融合蛋白复性加工的产率。顺式剪接蛋白质内含子在细胞 内由于存在本底水平的剪切活性，因此往往不能用于制备对宿主细胞毒性较强的目标多肽 或蛋白。由于反式剪接蛋白质内含子的N-端剪接结构域和C-端剪接结构域分别在不同的细胞内表达，因而目标多肽与N-端或C-端结构域组成的融合蛋白在细胞内完全不具备剪 切活性(不存在本底水平的剪接作用，不会产生游离的目标多肽)，所以可用于制备对宿主 细胞毒性较强的多肽样品。当顺式剪接蛋白质内含子作为载体蛋白时，其本身不能用作亲 和纯化的配基，必须另外在蛋白质内含子的N-端或C-端附加亲和纯化标签，从而降低了 目标多肽在融合蛋白中所占的比例。由于反式剪接蛋白质内含子的N-端和C-端剪接结构 域的结合具有特异性，且形成的复合物是非共价键的，可通过改变PH(大于11或小于3)而 解离。因此当采用C-端剪接结构域作为载体蛋白时，N-端结构域就可用作亲和层析的配 基，并且交联了 N-端结构域的S印harose可以反复使用。此外，N-端和C-端剪接结构域 之间的结合通常不受目标多肽的影响。因此，与反式剪接蛋白质内含子N-端结构域交联的 S印harose可用于纯化制备与对应的C-端结构域融合表达的任何目标多肽。上述方法同样 适用于将失去剪接功能的蛋白质内含子的C-端结构域与Sepharose交联后，用来纯化制备 与N-端剪接结构域融合表达的目标多肽。本发明的有益效果本发明创建了一种新的基因工程融合蛋白的亲和纯化系统，发明一种新的融合蛋 白特异性切割的方法；此方法能够特异性的纯化含有intein C-端剪接结构域(或N-端剪 接结构域)的融合蛋白，所发明的亲和纯化填料能够被重复使用；此方法使用的亲和标签 也能与传统的其他亲和标签如组氨酸标签联合使用；此系统中对融合蛋白的纯化与切割可 直接在亲和柱上一步完成，且无需加入其它的蛋白水解酶，从而可降低成本并防止蛋白酶 污染。本发明还具有下列特点1.创造了一类新的用于基因工程融合蛋白纯化的亲和标签以及与之相应的新的 亲和纯化配基，该亲和纯化系统尚未见有人报道。目前使用的基于intein的蛋白纯化与切 割方法与本发明有很大不同，已有的方法是将亲和标签与完整的intein和目标蛋白融合 表达，通过其中的亲和标签来纯化，再利用intein的顺式拼接活性把目标蛋白切割下来。 而本发明中的纯化方法依靠的是intein的两个剪接结构域之间的亲和力完成的，肽键的 切割是依靠两个剪接结构域的反式剪接活性。2.此系统对融合蛋白的切割无需任何蛋白酶参与，依靠intein本身的切割能力 完成；省去了蛋白水解酶的使用以及最后产品中蛋白水解酶去除的步骤，既降低成本又可 防止对目的蛋白的酶污染。3.此系统可以把对目的蛋白的纯化及从融合蛋白中的切割反应在同一根亲合柱 上完成，而且切割反应过程容易可控；通常在pH < 5或pH > 10时，intein的反式剪接活 性很弱，样品在此条件下上样和洗涤不会造成目标蛋白的损失。当杂蛋白洗涤去除后，换成 PH中性并含有EDTA的切割缓冲液后即可发挥intein反式拼接活性，将目标蛋白从融合蛋 白中释放。4.亲合标签仅为intein的N-端或C-端剪接结构域，通常小于完整的intein以 及常用的载体蛋白(如GST，Trx，MBP)等，因而本系统可以相应提高目的蛋白的产量。5.已有的基于蛋白内含子的切割系统是依靠intein的顺式剪接作用，需要把完 整intein与目标蛋白融合，在菌体内表达过程中即可发生切割作用而导致目标蛋白损失。 而本发明只把intein单独的C-端剪接结构域(或N-端剪接结构域)与目标蛋白融合，在另一个端剪接结构域不存在时，无拼接活性产生，目标蛋白不会有损失。此外，该系统还可 用于制备对宿主细胞有毒性的多肽。6.本课题制造的新亲合基质可以被重复使用，纯化方法简单，易于放大，能够用于 融合蛋白的规模化制备。本发明使用的材料和试剂1.菌株大肠杆菌DH5 α和BL21购自Novagen公司。2.质粒pET28a与pET30a购自Novagen公司，质粒pTwinl购自NEB公司。3.其它试剂质粒提取和DNA片段回收试剂盒为Qiagen公司产品；Ni-S印harose _自 Pharmacia Biotech, chitin—sepharose _ 自 Pharmacia Biotech。4. PCR 引物由 Invitrogen 公司合成。本发明涉及的名词术语的说明说明1:大肠杆菌DH5ci为常用的克隆菌，BL21为常用的表达菌。(详见《生物 化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸等主编，科学出版社1998，p426)。说明2 双链DNA(是由两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键作用而配对形 成的双螺旋结构。详见《生物化学》第三版上册王镜岩朱圣庚徐长法主编，高等教育出版社 2002，p486-487)。说明3 =PCR扩增(PCR 聚合酶链式反应。详见 << 分子克隆实验指南 >> 第三版上 册J.萨姆布鲁克D. W.拉塞尔著，科学出版社2002，p611-612)。说明4 质粒(质粒是染色体外的DNA分子，其大小范围在1Kb至200Kb以上不等。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。详见 << 分子克 隆实验指南》第三版上册J.萨姆布鲁克D. W.拉塞尔著，科学出版社2002，p2-3)。说明5 连接(连接是指在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻 的5 ‘端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。详见 << 现代医学分子生物学 >> 谷 志远著，人民军医出版社1998，ρ 198)。说明6 转化(转化是指重组DNA分子导入受体细胞的过程。详见 << 现代医学分 子生物学》谷志远著，人民军医出版社1998，P204-206)。说明7 感受态细胞(感受态细胞是指处于容易接受外源DNA状态的细菌细胞。详 见 << 现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社1998，p204)。说明8 质粒序列测定(质粒序列测定是指将基因和基因组转化为具有明确结构 的化学物质的过程。详见《分子克隆实验指南》第三版下册J.萨姆布鲁克D. W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p981)。说明9 引物(引物是指与模板DNA待扩增区两侧的碱基相互补的短核苷酸链。详 见 << 现代医学分子生物学》谷志远著，人民军医出版社1998，p238)。说明10 模板(模板是指PCR扩增时的DNA或RNA核苷酸链。详见 << 现代医学 分子生物学 >> 谷志远著，人民军医出版社1998，p240)。说明11 几丁质结合结构域(chitin binding domain)，简称 CBD,与 chitin 很 强的结合力，对高盐和一定浓度的表面活性剂和以及变性剂稳定，带有CBD的蛋白可用 chitin柱子纯化。详见NEW ENGLAND Biolabs的IMPACT-TWIN蛋白纯化系统。说明12 =LB培养基(1升LB培养基其成分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaClIOg,详见 << 分子克隆实验指南 >> 第二版金冬雁校P908)。说明13 :IPTG(IPTG是异丙基硫代半乳糖苷。详见 << 现代医学分子生物学 >> 谷 志远著，人民军医出版社1998，pl30)。说明14 =SDS-PAGE (SDS-PAGE为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。<< 精编 分子生物学实验指南》奥斯伯等著，金冬雁校科学出版社1998，P336-337)。说明15 16% Tricine SDS-PAGE(是一种用于分离肽类物质的凝胶电泳，配方 详见 << 生物化学与分子生物学实验常用数据手册 >> 吴冠芸等主编，科学出版社1998， pl92)。说明16 质谱分析(详见下文“质谱联用技术在生物大分子分析中的应用”龙耀 庭，陆妙琴。化学进展，1994，6 (3) 244-248)。
四
图1.蛋白质内含子的N-端切割和目标蛋白的纯化。图2.用Siipharose交联的C-端剪切结构域纯化制备与N-端剪切结构域融合表 达的目标多肽。图3. His-inteinN的表达和纯化。1 标准分子量蛋白；2 :非诱导菌裂解液；3 :诱导表达的菌裂解液；4 Ni-Sepharose 1^MkM His—inteinN。图4. inteinC-ETI融合蛋白的表达。1 标准分子量蛋白；2 非诱导菌裂解液；3 诱导表达的菌裂解液。图5.用inteinN-S印harose亲和柱对inteinC-ETI融合蛋白的纯化。1 标准分子量蛋白；2 :inteinC-ETI包涵体；3 :inteinC_ETI复性样品上样后的 穿过液；4 洗涤组分；5 直接用洗脱缓冲液洗脱的inteinC-ETI融合蛋白。图6. inteinC-ETI融合蛋白在inteinN-S印harose亲和柱的裂解。1 标准分子量蛋白；2 :inteinC-ETI融合蛋白；3 :inteinC-ETI融合蛋白的切割； 4 裂解反应后穿过液中的目标蛋白ΕΤΙ。图7.用质谱测定ETI样品的分子量。图8. inteinN-S印harose诱导inteinC融合蛋白切割的重复使用性。1 完整的融合蛋白(inteinC-ETI)对照；2 第1次使用；3 第2次使用；4 第3次 使用；5 第4次使用；6 第5次使用；7 第7次使用；8 第9次使用；9 第11次使用。
五具体实施例方式重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)的制备l、pET28a/His-inteinN 和 pET28a/inteinC_ETI 表达质粒的构建pET28a/His-inteinN表达质粒的构建以pTwinl质粒为模板，用PCR扩增编码 Ssp DnaB蛋白质内含子N-端剪接结构域的基因序列(inteinN)。PCR扩增条件为5. Ofmol pTwinl质粒，50pmol的上游引物和下游引物，0. 25U pyrobest酶，94°C变性2min后进行以 下26个循环94°C、30s ；55°C、Imin ；72°C、60s，PCR产物经琼脂糖电泳纯化后用DNA片段 回收试剂盒回收，用Ndel/Xhol双酶切，回收大片段(约550bp)，与经过Ndel/Xhol消化的表达质粒pET28a混合，加入T4DNA连接酶，用连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，用 NdeI/XhoI双酶切鉴定阳性克隆，对pET28a/HiS-inteinN表达质粒进行序列测定。pET28a/inteinC-ETI表达质粒的构建以pTwinl质粒为模板，用PCR扩增编码 Ssp DnaB蛋白质内含子C-端剪接结构域的基因序列(inteinC)。PCR扩增条件为5. Ofmol pTwinl质粒，50pmol的上游引物和下游引物，0. 25U pyrobest酶，94°C变性2min后进行以 下26个循环94°C、30s ；55°CUmin ；72°C、60s，PCR产物经琼脂糖电泳纯化后用DNA片段回 收试剂盒回收(约150bp)。通过PCR扩增ETI基因，扩增方法与上相同，模板为本实验室保存的质粒。PCR产 物经琼脂糖电泳后纯化回收。将回收的inteinC和ETI基因通过重叠PCR相连，ETI作为目标蛋白连接在 inteinC基因的3’端，且处于同一阅读框。用NdeI和XhoI双酶切处理PCR产物，经琼脂糖 电泳纯化后与pET28a载体连接，用连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，用Ndel/Xhol 双酶切鉴定阳性克隆，并进一步进行序列测定。2,His-inteinN融合蛋白的表达、纯化、复性及固相化(1). His-inteinN 融合蛋白的表达用 pET28a/His_inteinN 质粒转化 E. coli BL2KDE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含卡那霉素(50yg/mL)的LB培养基，置37°C振 摇过夜。过夜菌按2% (ν/ν)接种于新鲜1^培养基(含卡那霉素5(^8/!^)，371、2001·/ min振摇培养至OD600值为0. 6 0. 8，加入终浓度为0. 5mmol/L IPTG诱导3. 5hr，离心 (8000rpm, IOmin, 4°C )并收集菌体。(2). His-inteinN融合蛋白的纯化按每克菌体加入7. 5mL裂解缓冲液(20mmol/ LTris-HCl,0. 5mol/L NaCl，6M 盐酸胍，IOmM β -巯基乙醇，pH7. 9)的比例，在 4°C用超声 破菌，将裂解的菌液用20000r/min，4°C离心30min，收集上清。上清液上样至预先用平衡缓 冲液(6M 盐酸胍，20mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl，ΙΟπιΜβ -巯基乙醇，5mmol/L 咪唑， pH7. 9)平衡的Ni-S印harose层析柱(2. 5cmX5. 0cm)，用洗涤缓冲液(8M尿素，25mmol/ LTris-HCl, 0. 5mol/L NaCl，，IOmMβ -巯基乙醇，5mmol/L 咪唑，pH7. 9)充分洗涤，再用洗脱 缓冲液(8M尿素，25mmol/L Tris_HCl，0. 5mol/L NaCl，ΙΟπιΜβ -巯基乙醇，300mmol/L 咪唑， pH7. 9)洗脱。收集His-inteinN，用SDS-PAGE检测其纯度。(3). His-inteinN的复性及固相化将His-inteinN样品滴入到100倍体积的复 性缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，2M尿素，2mM β -巯基乙醇，pH8. 0)中，4°C静置过夜。复 性样品对5mM NH4HCO3充分透析，10000r/min，4°C离心30min，收集上清液，冷冻干燥。将 His-inteinN样品溶于0. IM NaHCO3, pH 8. 3缓冲液中，加入用溴化氰活化的S印harose 4B， 置4°C混合过夜。加入0. 2M，pH8. 2的甘氨酸，置室温混合2小时。用0. 5M NaCl充分洗涤 His-inteinN-Sepharose.3、inteinC-ETI融合蛋白的表达和纯化(1). inteinC-ETI融合蛋白的表达和复性方法与His-inteinN相同。(2). inteinC-ETI融合蛋白的纯化、裂解和ETI的回收inteinC_ETI复性样品中 加入 lmmol/L ZnSO4 后上样至预先用缓冲液(20mmol/L NaAc, 0. lmol/L NaCl，pH5. 0)平衡 的inteinN-S印harsee亲和柱上。用20倍柱体积的洗涤缓冲液(20mmol/L NaAc,0. 5mol/ L NaCl,0. 1% Tween 20，pH5. 0)充分洗涤去除杂蛋白。通常情况下，融合蛋白不直接用洗脱缓冲液(0. lmol/L Glycine-NaOH, 0. 2mol/L NaCl,pH10)洗脱，而是用3倍柱体积的切割 缓冲液(50mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，0. 2mol/L NaCl,5mmol/L EDTA，pH6. 5)快速洗 涤柱床，待液面略高于填料柱面时关闭柱子并堵上柱帽，室温放置24小时。次日再用3倍 柱体积同样的切割缓冲液洗涤柱床，分管接收穿过液。融合蛋白切割产生的ETI主要分布 于穿过液中，可用SDS-PAGE鉴定穿过液中目标蛋白的纯度。(3). inteinN-Sepharose亲和柱的再生目标蛋白ETI洗脱完毕后，再用10倍体 积的洗脱缓冲液(0. lmol/L Glycine-NaOH, 0. 2mol/L NaCl,pH10)洗涤柱床，去除仍然结合 在柱子上的蛋白(主要组分为未被切割的融合蛋白和切割产生的inteinC片段)。用pH6. 5 的20mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液平衡亲和层析柱，加入叠氮钠，置4°C保存。4、重组ETI的性质鉴定将纯化的ETI样品对5mmol/L NH4HCO3充分透析后，冷冻干燥。用质谱鉴定ETI的
分子量。5、inteinN-Sepharose亲和柱的可重复使用性用1毫升inteinN-S印harose填料装柱，将过量的inteinC-ETI融合蛋白上样至 层析柱，使亲和填料达到饱和吸附。上样完毕，用10倍柱床体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，然 后加入2倍柱床体积的切割缓冲液平衡层析柱，待液面接近柱床表面时堵上柱帽，室温静 置切割24小时。次日首先用切割缓冲液洗柱，收集含有蛋白吸收的洗脱组分。待流出液的 OD28tl回到基线后，再加入洗脱缓冲液，收集含有蛋白吸收的洗脱组分，该组分中含有未被切 割的融合蛋白和切割产生的inteinC片段。通过SDS-PAGE比较切割释放的ETI和未被切 割的融合蛋白的量即可得到切割效率以及吸附容量。每次实验完毕后，用洗脱缓冲液进一 步冲洗层析柱，使亲和层析填料再生。重复上述实验操作10次。根据比较每次洗脱组分的蛋白总量，来确定亲和层析柱 载样量的变化，并通过SDS-PAGE对亲和层析柱每次的切割效率进行比较。6、本发明的实验数据(l)pET28a/His-inteinN, pET28a/inteinC-ETI 表达质粒的构建DNA序列测定结果表明，上述两个表达质粒的核酸序列完全正确。(2)His_inteinN融合蛋白的表达、纯化以及inteinN-S印harose亲和填料的制 备用pET28a/His_inteinN表达质粒转化E. coli BL21，挑取单菌落接种于含卡那霉 素(SOyg/mL)的LB培养基，经IPTG诱导后，His-inteinN的表达量占菌体总蛋白的18%。 His-inteinN融合蛋白经Ni-S印harose纯化后，纯度可达85% (见图3)。从每升细菌培养 液，最终可获得His-inteinN融合蛋白38mg。His-inteinN可有效地与经溴化氰活化的S印harose 4B交联，交联容量约为每毫 升填料2. 7毫克蛋白。(3) inteinC-ETI融合蛋白的表达、纯化用pET28a/inteinC-ETI 表达质粒转化E. coli BL21，经 IPTG诱导后，inteinC-ETI 的表达量占菌体总蛋白的20% (图4)。inteinC-ETI包涵体的复性效率达72%左右。在低 温(40C )以及pH低于5. 0的条件下，inteinN和inteinC的结合作用不受影响，而inteinN 诱导的inteinC的C-端切割活性很低。因此在纯化inteinC-ETI时，采用在低温及低pH条件下上样。InteinC-ETI融合蛋白复性产物经inteinN-S印harose亲和柱纯化后，其纯度 约为90% (图5)。(4) inteinC-ETI融合蛋白的切割结合到inteinN-S印harose亲和柱上的inteinC-ETI融合蛋白可以在层析柱上直 接切割。当大肠杆菌中的杂蛋白被充分洗涤去除后，在层析柱中加入切割缓冲液(50mmol/ L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，0. 2mol/L NaCl,5mmol/L EDTA，pH6. 5)，室温放置过夜，诱导 inteinN和inteinC的反式剪切。用切割缓冲液洗涤层析柱时，切割产生的游离ETI因不能 与inteinN结合而随缓冲液流出。切割产生的inteinC以及未发生切割反应的融合蛋白则 仍然吸附在柱上，须用洗脱缓冲液才能洗脱。经SDS-凝胶电泳鉴定，inteinC-ETI融合蛋 白的切割效率达90 %，ETI的纯度超过85 % (图6)。(5) ETI的性质鉴定用质谱测定ETI的分子量为12973(图7)，与理论计算值相同，说明了 inteinN诱 导inteinC的C-端切割位点的专一性。(6) inteinN-S印harose亲和柱的使用重复性新制备的inteinN-S印harose亲和层析填料对inteinC-ETI融合蛋白的吸附容 量约为2. 3切割效率达90%左右。反复使用10次后，亲和填料的吸附容量约为2. Omg/ ml，切割效率超过80% (图8)。该结果表明，inteinN是一种稳定的亲和层析配基， inteinN-S印harose填料可以反复使用。参考文献1. G. Hanning, and S. C. Makrides, Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. , Thends Biotechnol. 16(1998)54-60.2. S. Gottesman, Genetics of proteolysis in Escherichia coli., Annu. Rev. Genet. 23(1989) 163-198.3. J. Nilsson, S. Stahl, J. Lundeberg, M. Uhlen, and P. A. Nygren, Affinity fusion strategies fordetection, purification, and immobilization of recombinant proteins, Protein Expression and Purification 11(1997) 1-16.4. E. R. Lavallie, and J. M. McCoy, Gene fusion expression systems in Escherichia coli. , Curr.Opin.Biotechnol.6 (1995)501-506.5. S. Chong, G. E. Montello, A. Zhang, E. J. Cantor, W. Liao, M. Xu, and J. Benner, Utilizing the C—terminal cleavage activity of a protein splicing element to purify recombinant proteins in a single chromatographic step, Nucleic Acids Research 26(1998)5109-5115.6. P. Lepage, C. Heckel, S. Humbert, S. Stahl, and G. Rautmann, Recombinant techbology as an alternative to chemical peptide synthesis -Expression and characreization of HIV-I Rev recombinant peptides,Anal. Biochem. 213(1993)40-48.7. P. A. Nygren, S. Stahl, and M. Uhlen, Engineering proteins to facilitate bioprocessiong, Trends Biotechnol. 12 (1994) 184-188.8. S. Mathys, T. C. Evans, I. C. Chute, H. Wu, S. Chong, J. Benner, X. Liu, and M. Xu, Characterization of a self-splicing mini—intein and its conversion intoautocatalytic N_and C—terminal cleavage elements :facile production of protein building blocks for protein ligation,Gene.231 (1999) 1-13.9. Ziyong Sun，Junyong Chen，Hongwei Yao, Lili Liu, Jing Wang，Jing Zhang and Jianning Liu, Use of Ssp dnaB derived mini—intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli.， Protein Expr Purif. 43 (2005) 26-32.10. R. S. Esipov，V. N. Stepanenko , L. A. Chupova，U. A. Boyar ski kh , M.L. Filipenko, and A. I. Miroshnikov, Production of recombinant human epidermnal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system, Protein Expr Purif. 61(2008) 1-6.11. IR. Cottinghan，A. Millar，E. Emslie，A. CoIman，A. E. Schhieke，and C. A. McKee,Method for the amidation of recombinant peptides expressed as intein fusion proteins in Escherichia coli, Nat Biotechnol. 19(2001)974-7.12. C. Morassutti, D. F. Amicis, B. Skerlavaj, M. Zanetti, and S. Marchetti, Production of a recombinant antimicrobial peptide in transgenic plants using a modified VMA intein expression system, FEBS Lett. 519(2002) 141-6.13. M. Xu, H. Paulus, and S. Chong, Fusions to self-splicing inteins for protein purification, Methods in Enzymology 362 (2000)376-418.14. H. Wu, M. Q. Xu, and X. Q. Liu, Protein trans-splicing and functional mini-inteins of a cyanobacterial dnaB intein，Biochim Biophys Acta. 1387(1998)
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序列表
<110>南京大学
<120>利用具有反式剪接功能的蛋白质内含子制备重组多肽
<160>6
<210>1
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>微型蛋白内含子Ssp DnaB N-端剪接结构域的基因序列
<400>1
gctatctctg gcgatagtct gatcagcctg gctagcacag gaaaaagagtttctattaaa60
gatttgttag atgaaaaaga ttttgaaata tgggcaatta atgaacagacgatgaagcta120
gaatcagcta aagttagtcg tgtattttgta ctggcaaaa agctagttta ￡Ι 0 ￡1￡1￡1￡1180
actcgactag gtagaactat caaggcaacag caaatcata gatttttaactattgatggt240
110121]tggaaaagattagatgagct atctttaaaa gagcatattgctctaccccgtaaactagaa0122]agctcctctttacaattg0123]<210>20124]<211>1060125]<212>PRT0126]<213>人工序列0127]<220>0128]<223>微型蛋白内含子SspDnab N-端剪接结构域氨基酸序列0129]<400>20130]Ala lie SerGlyAspSerLeu IleSerLeuAlaSerThrGlyLys0131]1510150132]Arg Val SerIleLysAspLeu LeuAspGluLysAspPheGluIle0133]2025300134]Trp Ala IleAsnGluGlnThr MetLysLeuGluSerAlaLysVal0135]3540450136]Ser Arg ValPheCysThrGly LysLysLeuValTyrIleLeuLys0137]5055600138]Thr Arg LeuGlyArgThrlie LysAlaThrAlaAsnHisArgPhe0139]6570750140]Leu Thr IleAspGlyTrpLys ArgLeuAspGluLeuSerLeuLys0141]8085900142]Glu His IleAlaLeuProArg LysLeuGluSerSerSerLeuGln0143]951001050144]Leu0145]1060146]<210>30147]<211>1430148]<212>DNA0149]<213>人工序列0150]<220>0151]<223>微型蛋白内含子SspDnab C-端剪接结构域的基因0152]<400>30153]tcaccagaaatagaaaagtt gtctcagagt gatatttactgggactccatogtttctatt0154]acggagactggagtcgagag gtttttgatt tgactgtgccaggaccacataactttgtcg0155]cgaatgacatcattgtacac aac0156]<210>40157]<211>480158]<212>PRT0159]<213>人工序列
318
143
<220>
<223>微型蛋白内含子Ssp Dnab C-端剪接结构域的氨基酸序列
<400>4
Ser Pro GluIleGlu Lys Leu SerGln Ser Asplie Tyr Trp Asp
151015
Ser lie ValSerlie Thr Glu ThrGly Val GluGlu Val Phe Asp
202530
Leu Thr ValProGly Pro His AsnPhe Val AlaAsn Asp lie Ile
354045
Val His Asn
48
<210>5
<211>522
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>刺桐胰蛋白酶抑制剂的基因序列
<400>5
ggatcctcattgttagacgg taacggcgaagtggtgcagaacggtggcgc ctattatctg60
ctgccgcaggtgtgggcaca gggtggtggcgtgcagctggcgaaaaccgg cgaagaaacc120
tgcccgctgaccgtggtgca gagcccgaacgaactgagcgatggcaaacc gattcgtatt180
gaaagccgtctgcgtagcgc gtttattccggatgacgataaagtgcgtat tggctttgcg240
tatgcgccgaaatgcgcacc gagcccatggtggaccgtggtggaagatga acaggaaggc300
ctgagcgtgaaactgagcga agatgaaagcacccagtttgattatccgtt taaatttgaa360
caggtgagcgatcagctgca tagctataaactgctgtattgcgaaggcaa gcatgagaaa420
tgcgcgagcattggcattaa ccgtgatcagaaaggctatcgtcgtctggt ggtgaccgaa480
gattatccgctgaccgtggt gctgaaaaaggatgaaagcagc522
<210>6
<211>174
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>刺桐胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列
<400>6
Gly Ser SerLeuLeu Asp Gly AsnGly Glu ValVal Gln Asn Gly
151015
Gly Ala TyrTyrLeu Leu Pro GlnVal Trp AlaGln Gly Gly Gly
202530
Val Gln LeuAlaLys Thr Gly GluGlu Thr CysPro Leu Thr Val
Val Gln Ser Pro Glu Ser Arg Leu Arg Trp
Ser Gln Gly Lys Val
Ile Thr Glu Val Lys Gly Val
Arg Gly Val Asp Ser His Tyr Leu
Phe Val Glu Asp Glu Arg Lys
35 Asn 50 Arg 65 Ala 80 Glu 95 Ser 110 Gln 125 Lys 140 Arg 155 Lys 170
Glu Leu Ser
Ser Tyr Asp Thr
Ala Phe Ala Pro Glu Gln
Gln Phe
Leu His Ser Cys Ala Ser Leu Val Val Asp Glu Ser
Asp
lie
Lys
Glu
Asp
Tyr
lie
Thr
Ser 174
4045
Gly Lys Pro lie Arg lie 5560
Pro Asp Asp Asp Lys Val 7075
Cys Ala Pro Ser Pro Trp 8590
Gly Leu Ser Val Lys Leu 100105
Tyr Pro Phe Lys Phe Glu 115120
Lys Leu Leu Tyr Cys Glu 130135
Gly lie Asn Arg Asp Gln 145150
Glu Asp Tyr Pro Leu Thr 160165
1权利要求
用具有反式剪接功能的蛋白质内含子的N-端剪接结构域肽段作为亲和层析的配基与固相支持介质交联，制备亲和层析填料。
2.利用权利要求1所述的亲和层析填料纯化与C-端剪接结构域融合表达的目标多肽。
3.在权利要求2所述的亲和纯化过程中，通过改变层析柱洗涤溶液的组成诱导蛋白质 内含子的反式剪切，使目标多肽从融合蛋白中释放出来并得到纯化。其中层析柱洗涤溶液 组成的改变包括PH和离子强度的改变以及加入含游离巯基功能团的化合物。
4.用具有反式剪接功能的蛋白质内含子的C-端剪接结构域肽段作为亲和层析的配基 与固相支持介质交联，制备亲和层析填料。
5.利用权利要求4所述的亲和层析填料纯化与N-端剪接结构域融合表达的目标多肽。
6.在权利要求5所述的亲和纯化过程中，通过改变层析柱洗涤溶液的组成诱导蛋白质 内含子的反式剪切，使目标多肽从融合蛋白中释放出来并得到纯化。其中层析柱洗涤溶液 组成的改变包括PH和离子强度的改变以及加入含游离巯基功能团的化合物。
全文摘要
具有反式剪切活性的蛋白质内含子的N-端剪接结构域和C-端剪接结构域之间能够特异性结合。本发明用蛋白质内含子的一个剪接结构域(N-或C-端剪接结构域)作为载体蛋白与目标多肽融合表达；将另一个剪接结构域(C-或N-端剪接结构域)与支持介质交联，制备亲和柱，用来吸附并纯化上述含有目标多肽的融合蛋白。通过增加亲和层析柱洗涤液中的盐浓度，去除融合蛋白样品中的杂质；通过改变层析柱的pH、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，诱导蛋白质内含子的反式剪切，使目标多肽从融合蛋白中释放出来，并同时获得纯化。
文档编号C07K1/22GK101884910SQ20091002656
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者刘建宁, 孙自勇, 陆嵬 申请人:南京大学