链亲和素/白细胞介素15融合蛋白的利记博彩app

专利名称：链亲和素/白细胞介素15融合蛋白的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，特别是涉及两种利用基因工程技术生产的链亲和素-白细胞介15双功能融合蛋白。背景知识
白细胞介素-15 (Interleukin-15, IL-15)是一种T细胞生长因子和信号调节分子，与IL-2
有许多相似的生物学活性。它通过诱导淋巴细胞的增值、分化和发育，诱导自然杀伤细胞和淋巴因子激活杀伤细胞的细胞活性,诱导细胞毒性T淋巴细胞活性,而体现抗肿瘤效应。IL-15
基因常用来修饰肿瘤细胞，制备肿瘤细胞疫苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性。
链亲和素(SA)是由亲和素链霉菌产生的非糖基化同源四聚体蛋白，故一个链亲和素蛋白可结合四个生物素。它能与生物素紧密非共价结合(Kd-10"5M),其结合力是抗原一抗体间作用力的一千至一百万倍。由于链亲和素可与生物素快速且几乎不可逆的强力结合，以及生物素较容易参入各种生物分子(如蛋白质，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故链亲和素一生物素间的强力作用早已用于生物医学的许多领域(Sano,T. and Cantor，C.R. Streptavidin-containingchimeric proteins: 4esign — production. Methods Enzymol.2000; 326: 305-311.)。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型白细胞介素-15。
本发明解决上述技术问题的技术方案是
一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-15构成，其中所述的接
头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的N端或C端；其中链亲和素位于接头肽的C
端的融合蛋白(如SEQN0.1)的活性比链亲和素位于接头肽的N端的融合蛋白(如SEQN0.2)高10倍以上。
本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、白细胞介素-15基因以及连接所述的链亲和素和白细胞介素-15的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。
为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，本发明融合蛋白SEQ N0.2的链亲和素的N端连有组氨酸标签，本发明融合蛋白SEQN0.4的链亲和素的N端连有组氨酸标签。本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由成熟链亲和素cDNA、成熟白细胞介素-15 cDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGATCC连接而成;该多核苷酸中成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CATCAT CAC CAT CAC CAT。
将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是pET24a或pET24d，大肠杆菌为DH5a 。
本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。
本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接白细胞介素-15和链亲和素，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有链亲和素和白细胞介素-15的双重活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-15锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在Y射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-15的活性。
经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿癯的作用，可用于制备预防性和治疗性肿瘤的疫苗。本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿癯细胞表面获得的。
本发明所述的肿癯疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将白细胞介素-15迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使白细胞介素-15在局部达到持续有效的治疗浓度；再者，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤细胞的量是可以精确控制的。


图1是IL15 -L-SA-6His-pET24重组质粒的结构图。图2是6His-SA-L-IL15-pET24重组质粒的结构图。
图3是融合蛋白IL2-L-SA-6His的SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准，2是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是包涵体，5是Ni-NTA柱层析后；6是复性后还原；7是复性后非还原。
图4是用抗IL-15单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的816.F10表面上本发明融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰,胞(阴性对照)，而右峰为本发明融合蛋白锚定修饰的细胞。
图5是用PHA刺激人外周血淋巴细胞MTT法对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发明融合蛋白的IL-15进行生物活性测定的结果，以锚定在生物素化的B16.F10表面上
GFP-L-SA为阴性对照；其中，表示本发明融合蛋白，+表示融合蛋白GFP-L-SA。
图6是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的肿瘤生长情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。
图7是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。
图8是接种本发明肿瘤疫苗后的治疗肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。
下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。
具体实施例方式
下述实施例和实验所用的材料及设备如下
细胞株、菌株与质粒B16.F10 (鼠黑色素瘤细胞株)；菌株5^pto/^ce《ovW附'!'(亲和素链霉菌，ATCC), DH5a和Rosetta;原核表达质粒pET24a (Kanaf ， Novagen)。
主要生化试剂及材料DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)， Trizol, Superscript H逆转录酶，Platinum户々DNA聚合酶和T4 DNA连接酶(Invitrogen); IL-15标准品(R & D Systems),琼脂糖和SDS-PAGE (Biorad); 2-Iminobiotin(Sigma)和Ni-NTA (Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗IL-15单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。
DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点泳等常规方法均参照文献(Sambrook J， et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在大连宝生物工程公司的DNA测序服务中心完成。
例1融合蛋白IL15 -L-SA-6His的制备
1、用DNeasy组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板,通过Platinum;^cDNA聚合酶进行PCR制备成熟链亲和素cDNA 。
弓I物5 ，GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCG
GATCCGCCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC3， (78nt)和
5'GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (39nt)。
反应条件变性94'C, 2min，循环(94'C, 15s—60。C， 15s—68'C， 30s) 25轮，最后
68。C， 5min。
2、 用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴细胞的总RNA,并以其作为模板，进行 RT-PCR制备成熟IL-15 cDNA。
弓|物5，-CGGGATCCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3， ( 31nt ) 和 5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3， (19nt)。
反应条件变性94。C， 2min,循环(94", 20s—55°C， 30s—68'C, 60s) 30轮，最后 68。C， 5min。
3、 构建IL15 -L-SA-6His-pET24重组质粒
制备的IL-15 cDNA (不含终止码，两端分别含BamHI和EcoRI限制性内切酶位点)和 SA cDNA (不含终止码，两端分别含EcoRI和Xhol限制性内切酶位点)，将上述IL-15和SA 基因片段克隆于pET-24d载体中，获得IL15-L-SA-6His-pET24重组表达质粒(结构图如图1 所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(15肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定， 验证其正确无误。
4、 构建IL15 -L-SA-6His-pET24/Rosetta工程菌
IL15 -L-SA-6His-pET24重组表达质粒转化后Rosetta感受态细胞后，用含卡那霉素的LB 平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素(2(Vg/ml)的LB培养基中。经37 'C摇床培养扩增至吸光度A600为0. 4 0. 5时，加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG， 37'C诱导 表达4h，离心(8000gX 10min)收获菌体，将细胞破碎后用12%的SDS-PAGE检测分析融合蛋白 的表达情况。
5、 融合蛋白IL15 -L-SA-6His-pET24的表达
融合蛋白IL15丄-8八-6^3卞￡丁24在菌体中主要以包涵体的形式存在，其表达量达20
30%。
6、 从包涵体中获得融合蛋白IL15 -L-SA-6His
a.制备包涵体5克菌体悬于100ml lxPBS中，冰浴中超声(电流270mA), 30秒X10 次(每次间隔30秒);接着于4'C离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml lxPBS (内含4mol/L 尿素，0.5%Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(l加0gX10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH8.0)中，15000gX15分钟， 取上清液。
b. Ni-NTA柱层析将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA柱(2.6X5cm),用平衡液 (50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿氣0.5mmol/LNaCl， pH8.0)进行冲洗至样品A2抑恢复至 基线；然后用洗脱液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿氣0.5mmol/LNaCl ，pH8.0,其中咪 唑分别为30mmol/L， 50mmol/L, 100mmol/L, 200mmol/L)进行洗脱，洗脱液经SDS-PAGE鉴 定，收集融合蛋白质峰(融合蛋白6His-SA-L-IL15的分子量为30KD)。
c. 透析复性将Ni-NTA柱层析纯化获得的6His-SA-L-IL15融合蛋白调至OD28(^0.2, 在大于20倍体积的透析液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，4.0mol/L尿素，0.2mmol/LNaCl， 5%甘 油，pH8.0)中4'C透析食性8小时；然后在50mmol/L磷酸钠缓冲液，2.0mol/L尿素，2.5°/。甘油， pH8.0)中4'C透析复性8小时；再在5Ommol/L磷酸钠缓冲液，l.OmoiyL尿素，1.25%甘油，pH8.0) 中4'C透析复性8小时；最后在50mmol/L磷酸钠缓冲液中继续透析8小时；离心除去不溶物， 收集上清。将收集的融合蛋白质液调至pH8.0,并过滤除菌分装，储存于-20'C。
所得融合蛋白IL15 -L-SA-6His用SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。 7、利用PHA刺激人外周血淋巴细胞对IL-15的活性进行测定，测得的IL-15活性为 lxl06U/mg。
例2 6His-SA-L-IL15融合蛋白的制备
1、 制备成熟链亲和素cDNA:方法与例1同。
弓I物 5 '^GGAATTCC ATATGCATCATCACCATCACC ATGAGGCCGGCATCACCGGCACCT GG-3，(55nt)和5'-GGAATTCGGCGGATCCGCCCCC GCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCC GCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC-3' (82nt)。
2、 制备成熟ML-15cDNA:方法与例1同。
引物5,-CGGGATCCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3，和5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，。 3 、构建6His-SA-L-IL 15-pET24重组质粒
制备的SAcDNA (不含终止码，两端分别含Xbal和BamHI限制性内切酶位点)和IL-15 cDNA (不含终止码，两端分别含BamHI和EcoRI限制性内切酶位点)，将上述SA基因片段 和IL-15克隆于pET-24d载体中，获得6His-SA-L-IL15-pET24重组表达质粒(结构图如图2 所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(15肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定， 验证其正确无误。
4、 构建6His-SA-L-IL15-pET24/Rosetta工程菌方法与例1同。
5、 融合蛋白6His-SA-L-IL15的表达融合蛋白6His-SA-L-IL15在菌体中主要以包涵体的形式存在，6His-SA-L-IL15融合蛋白 的分子量为30KD,其表达量达20 30%。
6、 从包涵体中获得融合蛋白6His-SA-L-IL15:方法与例1同。
7、 利用PHA刺激人外周血淋巴细胞对IL-15的活性进行测定，测得的IL-15活性为 lxl07U/mg，是IL15 -L-SA-6His融合蛋白相应比活的10倍。
例3 IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白修饰的肿瘤疫苗的制备 将107个B16.F10细胞悬浮在lml 1 XPBS中，加入0.5mg SulfoNHS-LC-Biotin并混匀 后，室温下作用30分钟；用1XPBS洗涤细胞3次后，每106个B16.F10细胞加入200ng 6His-SA-L-IL15融合蛋白，冰上作用30分钟；1 XPBS洗涤细胞1次后，然后用y射线灭活 (20000rad)即可。
例4本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测
用抗IL-15单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表 面上的IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白进行检测，结果见图3，几乎100%的肿 瘤细胞被修饰，且肿瘤细胞表面有大量的IL-15。对锚定在肿瘤细胞表面的IL15-L-SA-6His 融合蛋白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明，在一周内这些铺定的融合蛋白在细胞表面的 数量无显著下降。
例5对锚定在生物素化的B16.F10表面上的本发明融合蛋白进行IL-15生物活性的測定 首先将表面已锚定了 IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白的106个B16.F10经超 声破碎，离心收集其不溶的膜性成分；然后将其悬浮于100nl完全培养基中，用PHA刺激人 外周血淋巴细胞MTT法对其中的IL-15进行生物活性测定，结果如图5所示，活化的淋巴细 胞的生长增殖依赖于已锚定修饰细胞的不溶膜性成分的剂量，表明IL15-L-SA-6His或 6His-SA-L-IL15融合蛋白锚定在细胞表面后仍然能保持IL-15的生物活性。 例6本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗预防肿瘤的效果
(1) 材料
本发明肿瘤疫苗制备方法见实施例2; GFP-L-SA-6His (即绿色荧光蛋白和链亲和素的 融合蛋白)修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞作为实验的阴性对照。
(2) 方法
分别将106个GFP-L-SA-6His修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿癯细胞以及 本发明肿瘤疫苗接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，14天后加强一次；7天后，将105未 经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下，然后观^肿瘤的生长情况和小鼠 在40天内的成活情况(3)结果
有20%的免疫小鼠获得100%的保护(即无肿瘤生长)，阴性对照组全部有肿癯生长(图 6)。同时，本发明肿瘤疫苗的预防接种组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组 (图7)。
例7本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗治疗肿瘤的效果。
(1) 材料见实施例6。
(2) 方法
将105个未经任何处理的86. 10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下;4， 11和18天后， 分别将106 GFP-L-SA-6His或IL15-SA-6His修饰的、y射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤 细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成 活情况。
(3) 结果
如图8所示,本发明肿瘤疫苗治疗组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的附性对照组。SEQUENCE LISTING
<110>温州医学院
<120〉链亲和素/白细胞介素15融合蛋白
<160〉 4
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 289
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<220>
〈221〉 CHAIN
<222〉 (1)..(115) <223>人成熟IL-15
<220>
<221〉 DOMAIN
<222> (116)..(130)
<223>甘氛酸和丝氨酸的链接肽(L),此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元 蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白的双
重活性o
<220〉
<221> CHAIN
<222〉 (131)..(289)
<223>链霉菌成熟的全长链亲和素(SA)
<400> 1
Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu
15 10 15
lie Gin Ser Met His He Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80
85 90 95
He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met Phe He
100 105 110
Asn Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala
130 135 140
Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe
145 150 155
He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser 160 165 170 175
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
180 185 190
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
195 200 205
Ala T卬Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
210 215 220
Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu
225 230 235
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 240 245 250 255
260 265 270
Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val 275 280 285
Gin Gin
<210> 2
<211> 277
<212> PRT <213〉人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)"(147)
<223〉链亲和素；与成熟的全长相比，在N-端缺失了 13个贫基酸。并且第 133位的丝氨酸突变为半胱氨酸<220>
<221> DOMAIN
<222> (148)..(162)
<223>连接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (163)..(277) <223>人成熟IL15
<400> 2
Met Glu Ala Gly He Thr Gly Thr T卬Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 15 10 15
Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80
Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Cys He
115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala
130 135 140
Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Met Asn Trp Val Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu
165 170 175
Asp Leu lie Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
180 185 190
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
195 200 205
Glu Leu Gin lie Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie His Asp
210 215 220
Thr Val Glu Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 225 230 235 240
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
245 250 255
Lys Asn He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met 260 265 270Phe lie Asn Thr Ser 275
<210〉 3
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (1)..(115)
<223>人成熟IL-15的cDNA
<220〉
<221> DOMAIN 〈222〉 (116)..(130)
<223〉富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L),此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各 单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白 的双重活性。
<220>
<221> CHAIN
<222> (131)..(289)
<223〉链霉菌成熟的全长链亲和素。
<220>
<221> PEPT腿
<222> (290)..(297) <223>组氨酸标签
<400> 3
Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu 15 10 15
lie Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu lie He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Vai Gin Met Phe He
100 105 110
Asn Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125
Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala
130 135 140
Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe
145 150 155
He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser 160 165 170 175
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
180 185 190
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
195 200 205
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
210 215 220
Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp Leu
225 230 235
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 240 245 250 255
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Cys He Asp 260 265 270
275 280 Gin Gin Leu Glu His His His His His His 290 295
285
<210> 4
<211〉 283
<212> PRT <213>人工序列
<220〉
<221> PEPTIDE
<222> (2)..(7) <223>组氨酸标签
<220〉
<221> CHAIN
<222〉 (8)..(153)
<223>链亲和素；与成熟的全长相比，在N-端缺失了 13个氨基酸。并且第 133位的丝氨酸突变为半胱氛酸
<220〉
<221> DOMAIN
<222> (154)..(168)<223>连接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。 <220>
〈221> CHAIN
<222> (169)..(283) <223>人成熟IL15
<400> 4
Met His His His His His His Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr
15 10 15
Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala
20 25 30
Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr 35 40 45
50 55 60
Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 65 70 75 80
His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala
85 90 95
Arg He Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn 100' 105 110
115 120 125
Pro Ser Ala Ala Cys lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn
130 135 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser
165 170 175
Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu lie Gin Ser Met His lie Asp Ala
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
195 200 205
Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly
210 215 220
Asp Ala Ser lie His Asp Thr Val Glu Asn Leu He He Leu Ala Asn 225 230 235 240
Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe
260 265 270
Val His He Val Gin Met Phe He Asn Thr Ser 275 280
权利要求
1.一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-15构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2. 根据权利要求l所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的N端。
3. 根据权利要求l所述的一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.N0 2。
4. 根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的C端。
5. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的链亲和素部分的末端连接有纯化 标签。
6. —种基因，该基因編码权利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7. —种表达载体，该表达载体含有权利要求5所述的基因。
8. —种工程菌，该工程菌转化了权利要求6所述的表达载体。
9. 权利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。
10. —种肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗是将权利要求1、 2、 3或4所述的融合蛋白锚定到经过生物 素化的肿瘤细胞的表面获得的。
全文摘要
本发明提供了一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-15构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser。本发明融合蛋白同时具有链亲和素和白细胞介素-15的双重活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-15锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ-射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-15的活性。因此，这些链亲和素/白细胞介素15融合蛋白可用于已生物素化的肿瘤细胞、肿瘤组织的修饰以增强其免疫原性并调节机体的免疫反应，从而预防和治疗肿瘤。
文档编号C07K19/00GK101492508SQ200910004309
公开日2009年7月29日 申请日期2009年1月24日 优先权日2009年1月24日
发明者琳 张, 胡志明, 华 苏, 高基民 申请人:温州医学院