标签肽及其应用的利记博彩app

专利名称：标签肽及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及标签肽及其应用，更具体而言，涉及能够用于蛋白的纯化、检测或定量 的标签肽、连接有该标签肽的标签肽融合蛋白、编码该标签肽的多核苷酸及包含该多核苷 酸的重组载体、以及该标签肽的抗体及使用该抗体的蛋白纯化方法、检测方法、定量方法、 试齐U盒。
背景技术：
在生命科学领域中，在基础研究、应用研究及产品开发的所有领域中均进行着利 用基因重组技术的蛋白的生产。但是，用于将生产的蛋白高纯度地分离及纯化的技术却有 限。亲和层析是最强的蛋白纯化手段之一。作为这种层析，已知在蛋白的N末端或C 末端附加含有6至10个组氨酸残基的肽(组氨酸标签)，利用该组氨酸标签与镍等金属的 相互作用来分离纯化蛋白的方法。此外，还已知利用标签肽(肽标签)与其抗体的相互作 用的方法(例如非专利文献1及非专利文献2)。但是，前一种使用组氨酸标签的方法中，镍与组氨酸标签的特异性低，也会吸附除 附加有组氨酸标签的目的蛋白之外的蛋白或蛋白之外的化合物等。因此，存在不能通过一 个步骤的纯化得到高纯度的蛋白的问题。作为后一种利用标签肽与其抗体的相互作用的蛋白检测及纯化系统，广泛使用由 西格玛(sigma)公司出售的FLAG(注册商标)。该技术使用FLAG肽与其抗体(Ml抗体、M2 抗体等)，目前认为其特异性最为优良。但是，由于FLAG(注册商标)价格昂贵，因此从成本 方面考虑有时其使用受到限制。此外，现有的使用标签肽与其抗体的方法中，由于抗原(标签肽)_抗体的相互作 用强，因此不容易使与抗体结合的抗原从免疫亲和柱上洗脱下来。因此，在蛋白的亲和纯化 方法中，通常抗原的洗脱使用强酸性(例如PH3)或强碱性(例如pHIO)的溶液、蛋白的变 性剂(高浓度的尿素或盐酸胍)等洗脱液。但是，这些洗脱液使目的蛋白变性或使其稳定 性降低，特别是存在使多亚基酶等的收率变得非常低的问题。而且，使用这样的洗脱液时， 纯化用柱上使用的抗体也容易劣化，存在不能重复使用的问题。对于FLAG(注册商标)来 说，由于纯化等中使用的Ml抗体及M2抗体在重复使用时与抗原的特异性降低，因此重复使 用也有限。因此，目前尚未开发出能够廉价且通过容易的操作分离及纯化高纯度的蛋白、而 且能够重复使用的蛋白纯化系统。非专利文献 1 :Protein Expression and Purification 41(2005)98—105非专利文献 2 ,Advance in Eoitope Tagging Strategies，，，GeneticEngineeri ng&Biotechnology News, April 1,200
发明内容
本发明的目的在于，提供能够用于可通过容易的操作高纯度且廉价地对由克隆基 因表达的蛋白进行纯化的系统的新型标签肽以及连接有该标签肽的标签肽融合蛋白。另 外，本发明的目的还在于，提供编码该标签肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体以及 该标签肽的抗体。另外，本发明的目的还在于，提供利用该标签肽及其抗体的相互作用的可 廉价且简便地实施的蛋白纯化方法、蛋白检测方法及蛋白定量方法、以及用于蛋白的表达、 纯化、检测或定量的试剂盒。本发明人对利用标签肽和识别该标签肽的抗肽抗体的亲和标签系统进行了深入 研究。结果发现，以由与人凝血酶受体PAR4的N末端的20个残基相当的序列(序列编号2， 以下也称为“P4肽”)构成的肽作为抗原而制作的抗体(以下也称为“P20. 1抗体”)与具有 该抗体的识别序列的肽能够应用于蛋白的亲和纯化系统。进一步研究发现，P20. 1抗体识别 人凝血酶受体PAR4的N末端20个残基中C末端侧的6个残基(Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val， 序列编号1)；该6个残基中从N末端侧开始第2位的酪氨酸、第4位的甘氨酸及第5位的 谷氨酰胺对于与抗体的相互作用是必不可缺的。而且，还发现通过在标签肽中多次重复该 6个残基的序列(以下也称为“P4序列”)，标签肽与P20. 1抗体的亲和性增大，因此想到如 果使用这种具有重复序列的标签肽和P20. 1抗体，能够通过一个步骤高纯度地纯化由克隆 基因表达的蛋白。另外，进一步研究亲和纯化的条件后发现，这种具有重复序列的标签肽与P20. 1 抗体的相互作用通过多元醇等亲水性有机溶剂能够容易地解离。在现有的利用抗原抗体相互作用的亲和纯化系统中，洗脱液需要使用强酸性或强 碱性溶剂等，但在本发明的纯化系统中，洗脱物质可以使用多元醇等亲水性有机溶剂，因此 能够在稳定的条件下对蛋白进行纯化。因此，可以在不使目的蛋白变性等的情况下进行纯 化，而且抗体不容易发生劣化，因而还具有纯化系统能够重复利用的优点。另外还发现，由 于用作洗脱物质的亲水性有机溶剂比现有的洗脱液(例如，FlAG(注册商标)的洗脱液等) 廉价，因此能够削减蛋白纯化所花费的成本。另外，在本说明书中，“洗脱物质”是指具有使 抗体与标签肽解离的作用的物质。另外还发现，使用这种具有重复序列的标签肽和抗体时，能够通过一步纯化操作 得到充分量的用于X射线晶体结构分析的高品质的重组蛋白。蛋白的结晶化需要制备毫克 级的纯度极高、化学上均勻且保持100%生物活性的蛋白，本发明的技术适合制备用于X射 线晶体结构分析的蛋白。另外还发现，这种具有重复序列的标签肽及抗体能够用于蛋白的检测、定量。本发 明人进一步进行了反复研究，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下(1) (16)。(1) 一种标签肽，具有下式(I)所示的氨基酸序列，X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3(I)(式中，XpX2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)。(2) 一种标签肽，具有下式(II)所示的氨基酸序列，(X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3) η(II)(式中，XpX2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基。η表示2 6的整数)。
(3)如上述(2)所述的标签肽，其中，式(II)所示的氨基酸序列为下式(III)，(Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val)m(III)(式中，m表示3 5的整数)。(4)如上述(1)所述的标签肽，其中，在两处以上具有下式(IV)所示的氨基酸序 列，(Tyr-X2-Gly-Gln)(IV)(式中，X2表示任意的氨基酸残基)。(5) 一种标签肽融合蛋白，其中，连接有上述(1) (4)中任一项所述的标签肽。(6) 一种多核苷酸，其编码上述(1) (4)中任一项所述的标签肽。(7) 一种重组载体，其中，包含上述(6)所述的多核苷酸。(8)上述(1) (4)中任一项所述的标签肽的抗体。(9)如上述(8)所述的抗体，其中，含有具有序列编号3所示的氨基酸序列的重 链可变区和具有序列编号5所示的氨基酸序列的轻链可变区。(10)如上述(8)所述的抗体，其为具有序列编号7所示的氨基酸序列的单链抗体。(11)如上述(9)所述的抗体，其为由小鼠-小鼠杂交瘤细胞P20. 1 (FERM BP-11061)产生的单克隆抗体。(12) 一种蛋白纯化方法，其中，包括下述(i) (iii)的步骤(i)制备含有上述(5)所述的标签肽融合蛋白与该标签肽融合蛋白之外的物质的 混合物的步骤；(ii)使上述(8) (11)中任一项所述的抗体与由所述(i)的步骤得到的混合物 作用，而形成所述标签肽融合蛋白与该抗体的结合物的步骤；(iii)使洗脱物质与由所述(ii)的步骤得到的结合物作用，从而使所述标签肽融 合蛋白从抗体上游离的步骤。(13)如上述(12)所述的蛋白纯化方法，其中，洗脱物质为亲水性有机溶剂。(14) 一种蛋白检测或定量方法，其中，包括下述⑴ (iii)的步骤(i)制备含有上述(5)所述的标签肽融合蛋白的样品的步骤；(ii)使上述⑶ (11)中任一项所述的抗体与由所述⑴的步骤得到的样品作 用，而形成所述标签肽融合蛋白与该抗体的结合物的步骤；(iii)对由所述(ii)的步骤得到的结合物进行检测或定量的步骤。(15)小鼠-小鼠杂交瘤细胞 P20. 1 (FERM BP-11061)。(16) 一种试剂盒，用于表达、纯化、检测或定量蛋白，其中，含有上述(7)所述的重 组载体或上述(8) (11)中任一项所述的抗体。发明效果根据本发明，利用标签肽与标签肽的抗体的相互作用，能够通过容易的操作高纯 度地纯化连接有标签肽的标签肽融合蛋白。因此，根据本发明，即使是不熟练的操作者也能 够容易地进行由克隆基因表达的不稳定且微量的重组蛋白的纯化。另外，在本发明中，纯化 中所使用的洗脱物质比较廉价，并且抗体能够重复使用，因此能够削减蛋白纯化的成本。另 外，如果使用上述标签肽及其抗体，则能够有效地检测和/或定量连接有标签肽的标签肽 融合蛋白。


图1是示意地表示在人纤连蛋白的第9-第10Fn3结构域部分(Fn9_10)的N末端 或C末端附加有各种长度的P4肽序列的标签肽融合蛋白(P4-Fn)的图。图2(a)是示意地表示在动物细胞中表达附加有P4序列的人生长因子(hGH)与人 纤维蛋白原、链C结构域的融合蛋白的载体的图。图2 (b)是示意地表示在与hGH的微基因(minigene)连接的生物素化序列(BAS) 和纤维蛋白原、链片段(YC)后面重复1、3或5次P4序列(6个残基)的构建体的图。图3是表示编码附加有P4序列的标签肽融合蛋白(hGH-BAS- y C_P4)的DNA序列 的一部分以及该蛋白的氨基酸序列的一部分的图。图4(a)是表示编码附加有P4序列的标签肽融合蛋白(hGH_BAS_ y C-P4X3)的 DNA序列的一部分以及该蛋白的氨基酸序列的一部分的图。图4(b)是表示编码附加有Ρ4序列的标签肽融合蛋白(hGH-BAS- y C-P4X4)的 DNA序列的一部分以及该蛋白的氨基酸序列的一部分的图。图5是表示通过ELISA法(酶联免疫吸附法)研究Ρ4肽或其部分肽段与Fn的融 合蛋白对单克隆抗体(Ρ20. 1抗体)的反应性的结果的图。图6是表示通过ELISA法研究具有用丙氨酸置换Ρ4序列(6个残基)中的氨基酸 残基后的突变序列的标签肽/Fn融合蛋白(Ala突变体)对P20. 1抗体的反应性的结果的 图。图7 (a)是表示通过使用Biacore生物大分子相互作用仪的表面等离子共振分析 技术分析P20. 1抗体对P4(20)-Fn的亲和性的结果的图。图7 (b)是表示通过使用Biacore的表面等离子共振分析技术分析市售的抗Flag 抗体M2对Flag-Fn的亲和性的结果的图。图8是表示由P4(C8)肽的部分肽段引起P20. 1抗体与P4(20)_Fn的结合竞争性 解离的实验结果。图9是表示通过使用P20. 1抗体的免疫印迹法(Western blotting)，检测P4肽融 合蛋白(P4(20)-Fn)的结果的图。图10是表示噬菌体展示法的概略的示意图。图11是示意地表示为制作噬菌体展示文库而构建的噬菌粒的图。图12是表示P20. 1抗体所识别的肽序列的序列模式的研究结果的图。图13是表示P20. 1抗体Fab片段的重链可变区的DNA/氨基酸序列的图。图14是表示P20. 1抗体Fab片段的轻链可变区的DNA/氨基酸序列的图。图15是P20. 1抗体的Fab片段与P4(C8)肽的复合物的结晶的示意图(左)及结 晶的放大照片。图16是P4(C8)肽与P20. 1抗体的Fab片段的连接部附近的X射线晶体分析图的 放大图。图17是表示P20. 1抗体的单链Fv片段(scFV)的DNA/氨基酸序列的图。图18是表达scFV四聚体的构建体的示意图。图19(a)是表示通过使用固定有P4(20)-Fn的传感芯片的Biacore试验考察P20. 1抗体的Fab片段的肽结合能的结果的图。图19(b)是表示通过使用固定有P4 (20)-Fn的传感芯片的Biacore试验考察scFv 的肽结合能的结果的图。图19(c)是表示通过使用固定有P4 (20)-Fn的传感芯片的Biacore试验考察scFv 四聚体的肽结合能的结果的图。图20(a)是表示具有重复1次P4序列的标签的标签肽融合蛋白与抗体的亲和性 的测定结果的图。图20 (b)是表示具有重复3次P4序列的标签的标签肽融合蛋白与抗体的亲和性 的测定结果的图。图20 (c)是表示具有重复5次P4序列的标签的标签肽融合蛋白与抗体的亲和性 的测定结果的图。图21是表示通过使用P20. 1抗体作为检测抗体的夹心ELISA，检测P4序列或其重 复序列的结果的图。图22是表示通过使用P20. 1抗体作为包被抗体的夹心ELISA，检测P4序列或其重 复序列的结果的图。图23 (a)是表示将(P4序列X 3)融合蛋白从固定有P20. 1抗体的微珠上洗脱的 条件的研究结果的图。图23(b)是表示将(P4序列X 3)融合蛋白从固定有P20. 1抗体的微珠上洗脱的 条件的研究结果的图。图24是表示编码F-脊椎蛋白(spondin) - (P4序列X 3)融合蛋白的DNA序列的 一部分以及该融合蛋白的氨基酸序列的一部分的图。图25是表示通过SDS凝胶电泳对使用固定有本发明的抗体的微珠纯化后的F-脊 椎蛋白进行分析的结果的图。图26是纯化F-脊椎蛋白的结晶的放大照片。图27是在分辨率1.45A下得到的F-脊椎蛋白的电子密度图(部分)。图28是示意地表示在络丝蛋白(reelin)的N末端融合有(P4序列X 3)标签的 表达构建体的图。图29是表示通过SDS凝胶电泳及免疫印迹法对用P20. 1抗体柱纯化后的络丝蛋 白进行分析的结果的图。图30是示意地表示附加有重复4个残基(YPGQ)的标签序列的标签肽/纤连蛋白 融合蛋白的表达构建体的图。图31是表示附加有重复4个残基(YPGQ)的标签序列的标签肽/纤连蛋白融合蛋 白的电泳结果的图。图32是表示附加有重复1 5次4个残基(YPGQ)的标签序列的标签肽/纤连蛋 白融合蛋白的表面等离子共振的动力学分析结果的图。图33是示意地表示在荧光蛋白GFPuv的N末端附加有(P4序列X 3)标签的标签 肽融合蛋白的表达构建体的图。图34是表示使用P20. 1抗体-琼脂糖的GFPuv蛋白的反复纯化的结果的图。
具体实施例方式[标签肽]本发明的标签肽可以是具有下式(I)所示的氨基酸序列的标签肽，X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3(I)(式中，X1、X2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)。另外，本发明的标签肽也可以是具有下式(II)所示的氨基酸序列的标签肽，(X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3) η(II)(式中，XpX2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基。η表示2 6的整数)。另外，本发明的标签肽优选具有上述式⑴所示的氨基酸序列(以下也称为“序列 (I)”)、且在两处以上具有下式(IV)所示的氨基酸序列，(Tyr-X2-Gly-Gln)(IV)(式中，X2表示任意的氨基酸残基)。例如，在序列(I)重复2次的标签肽中，式(IV)所示的氨基酸序列(以下也称为 “序列(IV)”)隔着2个氨基酸残基(XjPX1)在两处存在。另一方面，在序列(IV)重复3 次的标签肽中，含有1次X1 SGlruX3 STyr的序列(I)。另外，对于在两处以上具有序列 (IV)的标签肽来说，只要在至少具有1次序列(I)的标签肽中至少在两处存在序列(IV)即 可，其间隔、配置没有限制。在序列⑴中，X1没有特别限制，优选例如甘氨酸。作为X2，优选丝氨酸、缬氨酸、 半胱氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等具有小侧链的氨基酸或脯氨酸，更 优选脯氨酸。作为χ3，优选疏水性氨基酸。可以列举例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙 氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、蛋氨酸等，其中优选缬氨酸。特别优选的序列为 Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val (序列编号1)。另外，构成本发明中的标签肽的氨基酸为L-氨基酸。本发明的标签肽可以仅由序列(I)构成，也可以含有序列(I)和序列(I)之外的 氨基酸残基。优选在两处以上具有序列(I)的标签肽，更优选具有重复2次以上序列(I) 的氨基酸序列的标签肽。在两处以上具有序列⑴的情况下，对其次数没有限制。另外，在 具有重复2次以上序列(I)的氨基酸序列的情况下，对其重复次数也没有限制。已确认本 发明的标签肽随着序列(I)重复次数的增加，与该标签肽的抗体的亲和性提高。本发明的 标签肽的氨基酸残基数的上限没有特别限制，从实用性方面考虑，优选为50个残基以下， 更优选为40个残基以下，进一步优选为30个残基以下。作为本发明的标签肽，特别优选具有重复3 5次下述重复单元 Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val (序列编号1，也称为“Ρ4序列”)的氨基酸序列的标签肽，或者具 有重复3 5次下述重复单元=Tyr-Pr0-Gly-Gln(序列编号18)的氨基酸序列的标签肽。本发明的标签肽可以通过基因工程方法与任意的蛋白连接，形成标签肽与任意蛋 白的融合蛋白。此时，可以将标签肽连接到蛋白的N末端及C末端的任一末端。这样的在N 末端或C末端连接有标签肽的标签肽融合蛋白，可以使用与本发明的标签肽特异性结合的 抗体通过一个步骤高纯度地纯化。另外，可以使用该抗体进行检测、定量等。可以使本发明的标签肽与任意的物质化学结合。这样的本发明的标签肽化学结合 的物质，利用与本发明的标签肽的特异性结合，能够简便且高纯度地进行纯化，另外能够进 行检测、定量等。本发明的标签肽化学结合的对象物质没有特别限制，可以列举例如蛋白、
8核酸、糖类、有机高分子、金属等。[标签肽融合蛋白]本发明的标签肽融合蛋白是上述中说明的本发明的标签肽(以下也仅称为“标签 肽”)与任意蛋白的融合蛋白，只要是以本发明的标签肽与任意的蛋白连接的状态存在的融 合蛋白即可。在本发明的标签肽融合蛋白中，标签肽可以连接在蛋白的N末端及C末端的 任一末端。这样的在N末端或C末端连接有标签肽的标签肽融合蛋白，可以使用与该标签 肽特异性结合的抗体通过一个步骤高纯度地纯化。本发明的标签肽融合蛋白可以通过公知的基因重组技术来制造。以下对其概要进 行说明。首先，通过公知的方法合成编码本发明的标签肽的多核苷酸。作为多核苷酸可以 列举DNA、RNA,优选DNA。当多核苷酸为DNA时，可以利用DNA合成仪合成DNA。另外，DNA 可以分成几个部分合成后再将其连接起来。标签肽的DNA序列由于基因密码子的简并可能 有多种，只要由DNA表达的肽具有本发明的标签肽的氨基酸序列则没有特别限制。作为编 码P4序列的DNA，例如可以使用序列编号9中记载的DNA序列。序列编号11中，给出了编 码由重复3次P4序列的氨基酸序列构成的标签肽的DNA的一例；序列编号13中，给出了编 码由重复5次P4序列的氨基酸序列构成的标签肽的DNA的一例。在合成的编码标签肽的DNA的3 ’末端或5 ’末端连接编码目的蛋白的DNA。或者， 在通过PCR等方法得到目的蛋白的DNA时，如果使用编码标签肽的DNA作为DNA的3，末端 或5’末端的引物，则能够得到编码标签肽的DNA与目的蛋白的基因连接的基因作为PCR产 物。在本发明的标签肽融合蛋白中，标签肽与目的蛋白之间可以插入有间隔肽。间隔 肽只要不与后述的本发明的标签肽的抗体结合或缔合、并且不影响标签肽与该抗体的相互 作用，则可以是任何肽。可以列举例如具有蛋白酶切割序列的肽等。插入间隔肽的情况下， 制作在编码标签肽的DNA与编码目的蛋白的DNA之间连接有编码间隔肽的DNA的DNA。如上所述合成DNA后，将所得的含有编码标签肽及蛋白的DNA的DNA适当插入表 达载体中。作为载体，可以适当地使用公知的表达载体(细菌来源、酵母来源、病毒来源 等)，没有特别限制。表达载体中所含的启动子只要是与用于表达的宿主对应的适当的启动 子即可。除此以外，表达载体中还可以含有增强子、剪接信号、多聚腺苷酸加尾信号、选择标 记、复制起点等。将如此得到的表达载体导入宿主细胞。作为宿主细胞，没有特别限制，可 以使用大肠杆菌、酵母等微生物；动物细胞等。优选的宿主细胞为动物细胞。将表达载体导 入宿主细胞的方法可以根据宿主细胞从公知的转化方法中适当选择来使用。将得到的重组 微生物或细胞在适当的培养基中培养，使其表达连接有标签肽的融合蛋白。连接有标签肽 的融合蛋白可以使用后述的抗体通过一个步骤从重组微生物或细胞中或培养液中纯化。在上述标签肽融合蛋白的制造方法中说明的编码本发明的标签肽的多核苷酸及 包含该多核苷酸的重组载体也包含在本发明之中。另外，本发明的重组载体并不限于能够 表达标签肽与目的蛋白的融合蛋白(标签肽融合蛋白)的重组载体，只要是包含编码本发 明的标签肽的多核苷酸的重组载体即可。[抗体]本发明提供上述本发明的标签肽的抗体。本发明的抗体只要是识别本发明的标
9签肽并与其特异性地相互作用的抗体则没有特别限制。可以列举例如识别从序列⑴的 N末端开始的第二位的酪氨酸、第四位的甘氨酸及第五位的谷氨酰胺，并与上述本发明的标 签肽相互作用的抗体。作为这样的抗体，可以列举如下抗体在抗体的抗原结合部，本发明 的标签肽中的序列(I)的酪氨酸与抗体中的色氨酸通过疏水性相互作用而相互作用、序列 (I)的甘氨酸的α碳与抗体中的H链的Trp50通过疏水性相互作用而相互作用、并且序列 (I)的谷氨酰胺的氮原子和氧原子与抗体H链中的主链的羰基氧原子及酰胺氮原子各自通 过氢键键合，由此使标签肽与抗体相互作用。表示这样的肽_抗体相互作用中的氨基酸残 基的具体立体配置的一例的肽_抗体结合部位的X射线晶体结构分析图如图16所示。作为上述抗体的具体例子，可以列举以与人凝血酶受体PAR4的N末端的20个残 基相当的肽作为抗原，免疫小鼠、兔等哺乳动物而得到的抗体，更具体而言，优选列举(a) 含有具有序列编号3所示的氨基酸序列的重链可变区和具有序列编号5所示的氨基酸序列 的轻链可变区的抗体、或者(b)具有序列编号7所示的氨基酸序列的单链抗体。此外，作为
(a)的抗体，可以列举由小鼠-小鼠杂交瘤细胞P20.1(以保藏编号FERM BP-11061保藏于 独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1丁目1番1 号中央第6 (邮政编码305-8566)。保藏日2007年12月11日)产生的单克隆抗体。另外， 通过用木瓜蛋白酶消化该单克隆抗体而得到的Fab片段也包含在(a)的抗体中。(b)的抗 体是利用(a)的抗体的可变区区域而得到的单链抗体。(b)的单链抗体优选通过基因重组 技术等以2 4聚体的形式来使用。上述(a)的抗体例如可以如后述实施例所述，使用小鼠-小鼠杂交瘤细胞 P20. 1 (FERM BP-11061)进行制造。另外，产生本发明的抗体的小鼠-小鼠杂交瘤细胞 P20. KFERM BP-11061)也是本发明之一。此外，上述(a)及(b)的抗体可以利用基因重组技术进行制造。利用基因重组技 术制造(a)的抗体时，首先，合成编码序列编号4所示的氨基酸序列的DNA(序列编号3)及 编码序列编号6所示的氨基酸序列的DNA(序列编号5)。另外，在利用基因重组技术制造
(b)的抗体时，首先，合成编码序列编号8所示的氨基酸序列的DNA(序列编号7)。将这些 DNA插入适当的表达载体中，并将该载体导入宿主细胞中，表达蛋白。然后，通过分离及纯化 表达的蛋白，能够得到上述(a)或(b)的抗体。[蛋白纯化方法]本发明提供使用上述本发明的抗体的蛋白纯化方法。本发明的蛋白纯化方法包括 以下⑴ (iii)的步骤即可(i)制备含有本发明的标签肽融合蛋白与该标签肽融合蛋白之外的物质的混合物 的步骤；(ii)使本发明的抗体与由所述(i)的步骤得到的混合物作用，形成标签肽融合蛋 白与该抗体的结合物的步骤；(iii)使洗脱物质与由所述(ii)的步骤得到的结合物作用，从而使标签肽融合蛋 白从抗体上游离的步骤。本发明的抗体与本发明的标签肽融合蛋白中的标签肽特异性地相互作用，因此如 果使用该抗体，则能够通过一个步骤高纯度地纯化本发明的标签肽融合蛋白。在(i)的步骤中，制备混合物的方法没有特别限制。例如，当连接有标签肽的目的标签肽融合蛋白存在于细胞中时，通过公知的方法对培养的重组微生物或细胞进行裂解 或粉碎等，得到含有标签肽融合蛋白与该标签肽融合蛋白之外的物质的混合物(细胞裂解 液)。当标签肽融合蛋白以包涵体等不溶性组分形式得到时，在进行(ii)的步骤之前，可以 适当进行蛋白的溶解步骤、溶解后的蛋白的折叠(复性)步骤等。当标签肽融合蛋白分泌 到细胞外即培养基中时，收集培养液的上清，将其作为混合物在(ii)的步骤中使用。细胞 裂解液或培养液上清通过离心分离除去固体成分，并根据需要将PH调节至中性(7 8)，但 除此以外无需特别添加盐等。另外，这些混合物中的目的蛋白的浓度优选为0. 2μ g/mL以 上。在(ii)的步骤中，优选使用将本发明的抗体固定到载体上的固定化抗体。作为固 定抗体的载体，只要能发挥本发明的效果则没有特别限制，可以使用公知的载体。例如优选 琼脂糖(GE医疗(healthcare)公司)、Affigel (BI0-RAD公司)等。将抗体固定到载体上 的方法可以根据载体的种类等适当选择，没有特别限制。例如，使用琼脂糖时，可以通过将 抗体在偶联缓冲液中透析，然后将CNBr活化琼脂糖(GE医疗公司)与抗体在室温下混合约 1 2小时，来制作琼脂糖固定化抗体。本发明的蛋白纯化方法中，可以同时利用将上述固定化抗体填充到柱中来使用的 柱法、以及将上述固定化抗体与样品混合并在悬浮状态下使其结合的分批法。前者的情况 下，将固定化抗体填充到柱中，使步骤(i)制备的混合物流过柱，从而使本发明的抗体与标 签肽作用。由此，标签肽与抗体结合，形成标签肽融合蛋白与抗体的结合物。后者的情况下， 向每IOmL样品溶液中加入约100 μ 1的固定化抗体并使其温和地混合，形成标签肽融合蛋 白与抗体的结合物后再填充到柱中。然后，在步骤(iii)中，使洗脱物质与(ii)的步骤得到的结合物作用，从而使标签 肽融合蛋白从抗体上游离下来。即，通过使洗脱物质与结合物作用使抗体与标签肽解离，从 而使通过标签肽与固定化抗体结合的标签肽融合蛋白从抗体上游离下来。作为洗脱物质，只要是具有使本发明的标签肽与本发明的抗体的结合发生解离的 作用的物质即可。作为这样的物质，可以列举多元醇等亲水性有机溶剂、本发明的标签肽。 本发明的蛋白纯化方法中，可以根据目的蛋白的种类等适当选择洗脱物质，但优选亲水性 有机溶剂。其中，特别优选丙二醇和二甲基亚砜。此外，也可以使用乙二醇。作为使洗脱物质与标签肽融合蛋白和抗体的结合物作用的方法，优选将洗脱物质 与水或适当的缓冲液混合而制成洗脱液，然后使该洗脱液流过柱的方法。此时，在洗脱液中 的洗脱物质的作用下从抗体上游离下来的标签肽融合蛋白与洗脱液一起从柱上洗脱下来。 水或缓冲液根据蛋白的种类进行选择即可。洗脱液中的洗脱物质的含量优选根据目的标签肽融合蛋白或洗脱物质的种类等 适当改变。例如，使用亲水性有机溶剂作为洗脱物质时，以水或缓冲液与亲水性有机溶剂的 总体积作为100，优选以约40% (ν/ν)以上的比例混合亲水性有机溶剂，优选使水或缓冲液 与亲水性有机溶剂的体积比(水或缓冲液亲水性有机溶剂)为约60 40 40 60。将标签肽作为洗脱物质时，优选制备水或缓冲液中的标签肽浓度为约0. Img/ mL 约lmg/mL的洗脱液。作为用作洗脱物质的标签肽，只要是本发明的标签肽则没有特别 限制，优选包含序列⑴的标签肽。本发明的标签肽可以通过公知的肽合成法来制造。为了使得到的标签肽融合蛋白稳定，可以在洗脱液中添加盐。盐的种类根据蛋白
11的种类等选择即可，没有特别限制。盐的浓度也是根据蛋白的种类适当调节即可，没有特别 限制。纯化标签肽融合蛋白后的固定化抗体，通过用含有洗脱物质的洗脱液进行洗涤，
可以重复使用。本发明的蛋白纯化方法可以在(i) (iii)的步骤之后还含有(iv)从标签肽融 合蛋白上切掉标签肽的步骤。例如，在标签肽与目的蛋白之间插入有具有蛋白酶切割序列 的间隔肽时，通过在适当的条件下使识别该蛋白酶切割序列的蛋白酶与纯化后的融合蛋白 作用，可以得到没有连接标签肽的目的蛋白。本发明的蛋白纯化方法中，标签肽与抗体特异性地相互作用，该相互作用通过亲 水性有机溶剂等洗脱物质可容易地解离，因此能够通过一个步骤高纯度地纯化连接有标签 肽的融合蛋白。另外，由于使用亲水性有机溶剂等作为洗脱物质，因此能够在不使目的融合 蛋白及抗体变性的情况下进行纯化。因此，根据本发明，能够通过一步纯化操作得到充分量 的用于X射线晶体结构分析的高品质的重组蛋白。结晶化需要制备毫克级的纯度极高、化 学上均勻且保持100%生物活性的蛋白，本发明的技术适合制备用于X射线晶体结构分析 的蛋白。此外，在本发明的蛋白纯化方法中，固定化抗体可以反复用于纯化。实际上，本发 明人在本发明的标签肽融合蛋白(GFPUV-P4X3融合蛋白)的纯化中反复使用了将P20. 1 抗体固定到琼脂糖上而得到的固定化抗体来研究其影响，结果确认，即使重复使用21次其 产量不过稍有降低(参考实施例(10))。而且，由于用作洗脱物质的亲水性有机溶剂比较廉 价，因此如果使用本发明的蛋白纯化方法，则可以廉价且简便地纯化蛋白。[蛋白检测或定量方法]本发明提供使用上述本发明的抗体的蛋白检测或定量方法。本发明的蛋白检测或 定量方法包括以下的(i) (iii)的步骤即可(i)制备含有本发明的标签肽融合蛋白的样品的步骤；(ii)使本发明的抗体与由所述⑴的步骤得到的样品作用，形成标签肽融合蛋白 与抗体的结合物的步骤；(iii)对由所述(ii)的步骤得到的结合物进行检测或定量的步骤。本发明的抗体与本发明的标签肽融合蛋白中的标签肽特异性相互作用，因此如果 使用该抗体，则能够检测或定量连接有标签肽的融合蛋白。本发明的蛋白检测或定量方法可以适用于免疫印迹、夹心ELISA、流式细胞术、免 疫沉淀、免疫组化等各种免疫学技术。在本发明的蛋白检测或定量方法中，(i)的步骤中的样品的制备方法没有特别限 制，例如可以通过将表达目的标签肽融合蛋白的细胞进行裂解或粉碎，来制备含有标签肽 融合蛋白的样品。对于在(ii)的步骤中使本发明的抗体与由(i)的步骤得到的样品作用而形成标 签肽融合蛋白与抗体的结合物的方法、以及在(iii)的步骤中检测或定量结合物的方法， 列举进行夹心ELISA或免疫印迹法的情况作为例子进行如下说明。(A)夹心 ELISA在夹心ELISA中，使用本发明的抗体作为检测抗体或包被抗体，可以对标签肽融
12合蛋白进行检测或定量。(A-I)将本发明的抗体作为检测抗体时(1)通过某种方法预先对本发明的抗体进行修饰或标记。修饰或标记方法没有 特别限制，可以列举例如生物素化、过氧化物酶等酶标记、荧光素等荧光色素标记、利用 1251等放射性同位素的标记等。(2)准备与本发明的抗体不同的、与融合蛋白中的标签肽以外的蛋白部分特异性 相互作用的抗体，将该抗体在微孔板上固相化。(3)将⑴的步骤得到的样品加入到(2)中固相化后的抗体上，使标签肽融合蛋白 被抗体捕获。(4)然后，使本发明的抗体与捕获的标签肽融合蛋白作用，从而形成标签肽融合蛋 白与本发明的抗体的结合物。在使用酶标记的本发明的抗体的情况下，之后进行(6)的操作。(5)在使用生物素化的本发明的抗体的情况下，使酶标记的链霉亲和素与形成的 结合物作用，从而使抗体中的生物素与链霉亲和素结合。(6)加入酶的显色或发光底物(例如，如果是过氧化物酶则为ABTS)。由于底物被 酶分解后得到显色反应产物，因此通过测定样品的吸光度能够检测标签肽融合蛋白与抗体 的结合物。另外，吸光度与样品中的标签肽融合蛋白质量定量地相关，因此能够对融合蛋白 与抗体的结合物进行定量。另外，此时通过与显色底物一起并用底物敏化剂，可以提高检测 灵敏度。(A-2)将本发明的抗体作为包被抗体时(1)将本发明的抗体在微孔板等上固相化。(2)在固相化的抗体上加入由(i)的步骤得到的样品，使蛋白被抗体捕获，从而形 成融合蛋白与抗体的结合物。(3)使与融合蛋白中的标签肽以外的蛋白部分特异性相互作用的抗体与形成的结 合物作用，从而使(2)中形成的结合物与该抗体结合。(4)在(3)中作用的抗体未用酶标记时，进一步使用与(3)中加入的抗体特异性反 应的抗体(酶标记抗体第二抗体)进行作用。(5)加入酶的底物(通常为显色或发光底物)，检测酶反应的生成物。(B)免疫印迹法在免疫印迹法中，通过以下方法检测结合物。(1)将由⑴的步骤得到的样品进行SDS电泳，分离标签肽融合蛋白，然后转印至 硝酸纤维素膜或PVDF膜上。(2)使本发明的抗体与膜上的融合蛋白作用，从而形成结合物。使用酶标记的本发 明的抗体的情况下，之后进行(4)的操作。(3)在(2)中作用的本发明的抗体未用酶标记的情况下，进一步使用与(2)中加入 的抗体特异性反应的抗体(酶标记抗体第二抗体)进行作用。(4)加入酶的底物(通常为显色或发光底物)，检测酶反应的生成物。本发明的标签肽融合蛋白及本发明的抗体也可以应用于荧光抗体法、免疫沉淀法 等；或者检测试剂的开发；细胞成像；传感器开发等。
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[试剂盒]本发明提供用于蛋白的表达、纯化、检测或定量的试剂盒。本发明的试剂盒只要含 有本发明的重组载体或本发明的抗体即可。通过使用本发明的试剂盒，能够简便地进行蛋 白的表达、纯化、检测或定量。表达用试剂盒中必须含有本发明的重组载体，纯化、检测或定 量用试剂盒中必须含有本发明的抗体。优选含有本发明的重组载体及本发明的抗体两者的 试齐U盒。试剂盒中含有的重组载体优选以如下形式提供试剂盒的使用者通过插入编码目 的蛋白的DNA，能够制备本发明的标签肽与目的蛋白连接的标签肽融合蛋白的表达载体。使 用者通过将制备的表达载体导入适当的宿主细胞并培养宿主细胞，能够简便地表达所期望 的标签肽融合蛋白。试剂盒中含有的抗体优选为在适当的载体上固定化的状态(纯化用试剂盒的情 况下)、适当的标记(酶标记、放射性标记、荧光标记等)或修饰(生物素化等)后的状态 (检测用剂盒、定量用试剂盒的情况下)。使用本试剂盒对蛋白进行纯化、检测或定量的方 法，只要按照上述本发明的蛋白纯化方法、及本发明的蛋白检测或定量方法即可。另外，试剂盒中除本发明的重组载体或本发明的抗体以外，还可以包含第二抗体、 反应用缓冲液、底物、使用说明书等构成。[本发明的优越性]本发明的标签系统在以下方面优良(I)识别序列短，而且没有会引起非特异性吸附的带电性氨基酸。(II)作为标靶的标签肽序列与其抗体(P20. 1抗体)的相互作用具有可以一步纯 化蛋白的亲和性。(III) (II)的相互作用可以在不影响蛋白的条件(例如40%乙二醇等)下解离， 因此可以同时实现高品质的抗原纯化和柱的反复使用。(IV)由于获得了抗体与标签肽的复合物的原子分辨率立体结构，因此可以进一步 进行变更及改良。(V)也能够应用于免疫印迹法、荧光抗体法、免疫沉淀法等，不仅限于蛋白纯化，在 检测试剂的开发、细胞成像、传感器开发等方面的应用可能性高。上述⑴ (V)中，(III)在使用目前市售及批量生产的抗体的蛋白纯化系统中 完全无法实现。实施例下面，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些实施例。[1]单克隆抗体制备抗PAR4肽抗体通过常规方法如下进行制备。(1-1)肽合成及利用肽进行的免疫通过Fmoc固相法(Fmoc :9_芴甲氧羰基)合成与人凝血酶受体PAR4的N末端的 20个残基相当的以下序列的肽(序列编号2)。NH2-G⑶DSTPSILPAPRGYPGQVC-COOH使利用反相HPLC纯化后的上述肽通过半胱氨酸(Cys)残基与作为载体蛋白的钥 孔蛾血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)相连接，将其作为免疫原。
将上述肽-KLH复合物与佐剂一起免疫Balb/c小鼠，通过ELISA法测定抗体效价， 结果在25 μ gX5次的免疫后能够得到高的抗体效价。将该小鼠的脾脏细胞用于融合。(1-2)细胞融合、杂交瘤细胞建立从上述小鼠脾脏细胞中采集B细胞，通过聚乙二醇法将其与小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0株)融合，然后利用HAT选择培养基进行培养。通过ELISA法对产生克隆的孔的上清进行筛选，对强阳性的孔进行二次筛选。二 次筛选中使用后述的融合蛋白(PAR4-Fn)作为抗原。结果，得到反应性高的一个克隆。通 过有限稀释法对该克隆进行克隆，最终建立小鼠-小鼠杂交瘤细胞P20. 1 (以保藏编号FERM BP-11061保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波 市东1 丁目1番1号中央第6 (邮政编码305-8566)。保藏日2007年12月11日)。(1-3)抗体的纯化、Fab片段及琼脂糖固定化抗体的制备(1)抗体的纯化在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养1_2中建立的小鼠-小鼠杂交瘤 细胞P20. 1(FERM BP-11061)。使用蛋白A琼脂糖从该培养上清中纯化P20. 1抗体。纯化抗 体的同种型为IgGl，轻链为λ。(2) Fab 片段Ρ20. 1抗体的Fab片段使用PIERCE公司的Immunopure Fab制备试剂盒来制备。 即，将纯化后的P20. 1抗体(IgG)在37°C下用固定化的木瓜蛋白酶消化16小时，将消化产 物加入到蛋白A琼脂糖中，通过凝胶过滤进一步纯化未结合物。(3)琼脂糖固定化抗体的制备将纯化后的P20. 1抗体(约30mg)在偶联缓冲液(0. IM NaHC03、0. 3M NaCl、pH 8. 3)中进行透析。然后，将该纯化后的P20. 1抗体与用ImM盐酸洗涤过的CNBr活化的琼脂 糖4B(GE healthcare)在室温下混合1小时，由此制备琼脂糖固定化抗体。用0. IM Tris 封闭未反应的活性基团，并用0. IM pH 2. 2的Gly-HCl除去非特异性结合的抗体。由未结 合的抗体的定量结果可知，每ImL琼脂糖树脂能够固定化约2mg的P20. 1抗体。[2]标签肽融合蛋白的制备(2-1)标签肽/纤连蛋白融合蛋白的制备使用表达人纤连蛋白的第9-第10Fn3结构域部分的185个残基的构建体，制备在 其N末端或C末端附加有各种长度的P4肽序列(PAR4的N末端20个残基的一部分或全 部)的6种标签肽融合蛋白(图1中从上部开始的6种)。利用延伸PCR(extension PCR) 制备插入子(insert)，将其插入到表达载体pETlIc (Novagen公司)的NdeI-BamHI位点。 此外，使用Quick Change Mutagenesis试剂盒(Stratagen公司)制备将P4肽序列的C末 端侧的6个氨基酸残基取代为丙氨酸后的突变体(Ala突变体)的构建体(图1中从下部 开始的6种)。将上述各构建体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)株中，通过常规方法进行诱导表达。 利用阴离子交换层析从大肠杆菌可溶物中纯化生成的标签肽融合蛋白。(2-2)人生长因子/人纤维蛋白原/标签肽融合蛋白的制备已经报道了在动物细胞中表达人生长因子(hGH)与人纤维蛋白原Y链C结构 域的融合蛋白的载体(Xiao et al. Nature 432，59-67，2004)。通过延伸PCR制备在该融合蛋白的构建体的C末端附加有下述DNA的构建体，所述DNA编码P4肽来源的6残基肽 (GYPGQV :P4序列(序列编号1))重复1次、3次或5次而得到的肽。图2 (a)表示在动物细 胞中表达附加有P4序列的人生长因子(hGH)与人纤维蛋白原Y链C结构域的融合蛋白的 载体。图2(b)表示在与hGH的微基因连接的生物素化序列(BAS)和人纤维蛋白原Y链片 段(Y C)后面重复1、3或5次P4序列(6个残基)的构建体。编码附加有P4序列的标签肽融合蛋白(hGH-BAS- y C_P4)的DNA序列的一部分如 序列编号15及图3所示。另外，序列编号15所示的碱基序列中，省略了编码附加有P4序 列的标签肽融合蛋白(hGH-BAS- y C-P4)的全部DNA的5424个碱基中第1 第2100位碱 基及第3121 第5424位碱基。S卩，序列编号15所示的DNA序列为编码hGH-BAS-γ C-P4 的DNA的5424个碱基中第2101 第3120位的碱基序列。图3中下划线部表示hGH的序 列。标阴影处为His标签序列。斜体字表示连接肽部分。粗下划线部为TEV蛋白酶位点。 虚线部为BAS序列。黑体字为P4标签部分。线框围住的氨基酸序列为P4序列。其它为纤 维蛋白原Y C部分。序列编号11中给出了编码由重复3次P4序列的氨基酸序列(P4X3)构成的标签 肽的DNA序列；序列编号13中给出了编码由重复5次P4序列的氨基酸序列(P4X5)构成 的标签肽的DNA序列。附加有编码P4X3序列的DNA的构建体的DNA序列的一部分如图 4(a)所示。附加有编码P4X5序列的DNA的构建体的DNA序列的一部分如图4(b)所示。 图4 (a)所示的碱基序列中，省略了 5460个碱基中第1 第3000位的碱基部分及第3181 5460位的碱基部分。图4(b)所示的碱基序列中，省略了 5496个碱基中第1 第3000位 的碱基部分及第3181 5496位的碱基部分。在图4(a)及图4(b)中，黑体字为P4标签部 分、线框围住的氨基酸序列为P4序列、其它为纤维蛋白原、C部分。用制备的质粒转染人成纤维细胞株HEK293T，并使用含有10%胎牛血清的DMEM培 养基培养该细胞。通过Ni-NTA琼脂糖(Qiagen公司)层析从所得的培养上清中纯化人生 长因子/人纤维蛋白原/标签肽融合蛋白。使用小鼠抗hGH单克隆抗体HGH-B(美国典型 菌种保藏中心，American Type Culture Collection)及抗生物素化序列(BAS)的抗血清 (兔)，进行该标签肽融合蛋白的检测。[3]单克隆P20. 1抗体的性状分析[3-1]表位分析通过对2-1中制备的各种P4-Fn蛋白进行的ELISA法研究被P20. 1抗体识别所需 的最小的肽序列。操作规程如下。(1)向96孔板中加入稀释至10 μ g/mL的P4_Fn (或其突变体)溶液50 μ L，并静 置(4°C、16小时)。(2)用抽吸器抽吸，以200 μ L/孔加入含有BSA的Tris缓冲盐溶液(TBS ;20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, ρΗ7. 5)，室温下静置 1 小时。(3)加入2-5 μ g/mL的P20. 1抗体50 μ L，室温下静置1小时。(4)用 200 μ L/孔的 TBS 洗 3 次。(5)加入过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(1/1000稀释)50 μ L，室温下静置30分钟。(6)用 200 μ L/孔的 TBS 洗 4 次。(7)以100 μ L/孔加入过氧化物酶显色底物(ABTS)，室温下静置5 10分钟后，
16测定各孔中的溶液在405nm下的吸光度。由ELISA的结果可知，无论P4肽与Fn的N末端融合还是与C末端融合均能被 P20. 1抗体识别。使P4肽与Fn的N末端融合的5种标签肽融合蛋白的ELISA结果如图5 所示。由该结果可知，只要有P4肽的C末端侧的6个残基的部分(GYPGQV :P4序列(序列 编号1))就足以进行识别。另外，对将这6个残基逐个突变成Ala的突变体进行同样研究 的结果如图6所示。图6中，对照表示未进行包被的孔的值，WT表示包被了 P4(20)-Fn的 孔的值。G、Y、P、G、Q及V表示将这些氨基酸各自取代为丙氨酸的突变融合蛋白。由图6表 明，Y2、G4及Q5为必需，即使将Gl、P3或V6变为Ala,仍留有反应性。(3-2) P20. 1抗体的结合亲和性为了考察P20. 1抗体结合P4肽序列的亲和性，进行了利用Biacore的表面等离子 共振分析。将2-1中纯化的P4 (20)-Fn (参考图1)生物素化，用固定有链霉亲和素的传感 芯片进行捕捉后，以各种浓度使纯化P20. 1抗体流过。结果如图7及表1所示。P20. 1抗体 对P4 (20) -Fn表现出表观解离平衡常数为约3. 4nM的亲和性。同样地分析市售的Flag抗体 M2与使用Flag(DYKDDDDV(序列编号19))作为标签的Flag(DYKDDDDV(序列编号19))-Fn 的亲和性，得到的解离平衡常数的值为2. 7nM。表1
Ka(l/Ms)Kd(l/s)Kd(M)P20. 1抗体3. 65 X IO51. 23Χ1(Γ33. 38Χ1(Γ9FLAG-M21. 46 X IO53. 95Χ1(Γ42. 7Χ1(Γ9(3-3)由肽引起的竞争性解离为了研究P20. 1抗体的结合是否能够被过量的游离肽解离，在使用P4(20)_Fn蛋 白的3-1的ELISA实验中，最后的洗涤时在含有各种浓度的P4(C8)肽(PRGYPGQV(序列编 号20)的8残基肽，由Fmoc法合成)的缓冲液中反应30分钟。由图8所示的结果可知， 0. lmg/mL浓度的肽基本能够引起完全解离。(3-4) P20. 1抗体在免疫印迹中的应用通过SDS电泳分离2-1中纯化的P4 (20) -Fn (0. 12-0. 87pmol/泳道)，转印到PVDF 膜上后，使其与1 μ g/mL的P20. 1抗体反应，然后利用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG和化学 发光底物进行检测。结果如图9所示。由图9表明，通过免疫印迹，P20. 1抗体能够检测约 0. 2pmol的P4肽融合蛋白。[4]P20. 1抗体识别的肽序列的随机筛选(4-1)噬菌体展示文库的制备为了进一步大规模地探索P20. 1抗体识别的肽序列，使用了噬菌体展示法。图10 表示噬菌体展示法的概略。为了在M13噬菌体的gill衣壳蛋白的N末端插入随机化的7个 氨基酸(其中，Tyr2和Gln5固定)的文库，进行图11所示的噬菌粒的构建，制备具有IO7 的多样性的文库。(4-2) P20. 1抗体反应性克隆的选择
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通过固定有P20. 1抗体的磁珠淘选(panrming)，得到多个结合克隆。通过DNA测 序解读这些克隆的可变区的序列，得到图12所示的序列模式。由该结果可知，在要求从N 末端开始第2位的酪氨酸(也称为Tyr2)、第4位的甘氨酸(也称为Gly4)及第5位的谷氨 酰胺(也称为Gln5)的同时，表现出从N末端开始第3位的脯氨酸(也称为Pro3)的高选 择性，但第6位只要是疏水性氨基酸就是容许的，并且第1及第7位的氨基酸残基没有特别 强的选择性。即，可知P20. 1抗体一般对下述肽序列的亲和性高。Xl-Tyr2-Pro3-Gly4-Gln5-X6(上述肽序列中，Xl表示任意的氨基酸序列。？1~03可以是5、￥、(、4、113、6、0等 具有小侧链的氨基酸，X6为疏水性氨基酸即可)[5]P20. 1抗体的Fab片段-肽复合物的X射线晶体分析(5-1)确定P20. 1抗体的可变区的氨基酸序列从杂交瘤细胞克隆DNA为了确定结构确定中所必需的P20. 1抗体Fab片段的正确的氨基酸序列，使用总 RNA提取系统(Promega公司)从小鼠-小鼠杂交瘤细胞P20. 1 (FERM BP-11061)中提取总 RNA,以22. 7ng/ μ L的浓度得到100 μ L。将其用作模板，使用小鼠Ig引物对(Novagen公 司)进行RT-PCR。在其产物中，将扩增产物与pDrive克隆载体(QIAGEN PCR克隆试剂盒) 连接，并转化大肠杆菌DH5a。将其接种于LB板(添加氨苄西林、X_gal及IPTG)，得到克隆。对于所得的DNA克隆，使用RT-PCR中使用的引物来确定可变区的DNA序列。另 外，以该序列为基础设计内部引物，对恒定区也依次进行序列确定。结果所得的DNA/氨基 酸序列如序列表的序列编号3及5、以及图13及14所示。序列编号3及图13是P20. 1抗 体Fab片段的重链可变区的DNA/氨基酸序列，序列编号5及图14是轻链可变区的DNA/氨 基酸序列。(5-2)复合物的结晶化将1-3中制备的P20. 1抗体的Fab片段28μ L(以10mg/mL含有于5mM Tris, 50mM NaCl中、pH7.4)与4yL的P4(C8)肽溶液(10mg/mL)混合，并静置过夜。结晶化使用 Emerald Biostructures公司的Wizard I、II试剂盒，通过悬滴法在总计96种条件下尝试 结晶化。结果在含有20% (w/v)PEG3000的IOOmM醋酸缓冲液(pH4. 5)的条件下观察到柱 状结晶，因此在其附近微调PEG3000的浓度摸索最佳条件，最终确定为23%的PEG。所得蛋 白的结晶如图15所示。图15中，左侧的圆内是P20. 1抗体的Fab片段与P4(C8)肽的复合 物的结晶的示意图，右侧为结晶的放大照片。(5-3)结构确定使用5-2中得到的结晶，利用放射线设备Spring-8的光束线BL-44XU在1.8A的分 辨率下进行X射线晶体结构分析。数据的统计值如表2所示。表2
实验条件(Experimental conditions)光束线(Beam line)SPring-8/BL-44XU(蛋白研究光束线)波长(Wavelength)0.9000A曝光时间/帧(Exposure time/frame)3.0秒振动角 /巾贞(Oscillation angle/frame )1.5度中贞数(No of frames )150*全振动角的范围(Totaloscillationrange)225度结晶学数据(Crystaldata)晶系与空间组(Crystal system & Spacegroup)三斜晶系，Pl晶格常数(Unit cell dimensions)a=40.05A,b=65.27A，c=85.03A α=99.93 度，β=93.50 度，γ=96.46 度非对称单元中的分子数(Molecules present in the asymmetric unit)(Fab+C8 肽)x2数据测定的统计量(Data collection statistics)分辨率(Resolutionrange) (A)100.0-1.80 (1.86-1.80)观测衍射点的总数(Total no. of reflections)187728独立的衍射点总数(No. ofunique73337reflections)数据的完整性(Completeness) (%)97.9 (96.8)1>2σ(1)84.4 (57.6)冗余数据的多重性(Completeness)2.5 (2.5)Rmerge (%)(可靠性因子)4.0 (24.8)<11σ(1)> (信噪比)16.0 (4.0)以所得数据为基础，使用分子置换法进行立体结构的确定。作为分子置换法的模 板，使用与P20. 1抗体相同的为IgG 1且轻链为λ的钆特酸葡胺(Gd-DOTA)络合的单克隆 抗体2D12. 5Fab (PDB ID :1NC4)。结果能够确定晶胞中的2分子Fab的配置。为了改善相位并且使结构精密，利用5-1中确定的P20. 1抗体的一级结构。使用 该一级结构的数据及分子置换法的解，通过ARP/wARP进行自动建模，结果能够构建884个 残基中736个残基的模型，并且还能确定(assign)其中650个残基的侧链的结构。对改良 后的图谱进行模型的拟合，进行结构的精密化。统计值如表3所示。表权利要求
一种标签肽，具有下式(I)所示的氨基酸序列，X1 Tyr X2 Gly Gln X3(I)式中，X1、X2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基。
2.一种标签肽，具有下式(II)所示的氨基酸序列， (X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3) η (II)式中，Xp X2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基，η表示2 6的整数。
3.如权利要求2所述的标签肽，其中，式(II)所示的氨基酸序列为下式(III)， (Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val)m (III)式中，m表示3 5的整数。
4.如权利要求1所述的标签肽，其中，在两处以上具有下式(IV)所示的氨基酸序列， (Tyr-X2-Gly-Gln)(IV)式中，X2表示任意的氨基酸残基。
5.一种标签肽融合蛋白，其中，连接有权利要求1 4中任一项所述的标签肽。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1 4中任一项所述的标签肽。
7.—种重组载体，其中，包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.权利要求1 4中任一项所述的标签肽的抗体。
9.如权利要求8所述的抗体，其中，含有具有序列编号3所示的氨基酸序列的重链可 变区和具有序列编号5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
10.如权利要求8所述的抗体，其为具有序列编号7所示的氨基酸序列的单链抗体。
11.如权利要求9所述的抗体，其为由保藏编号为FERMBP-11061的小鼠-小鼠杂交瘤 细胞P20. 1产生的单克隆抗体。
12.一种蛋白纯化方法，其中，包括下述(i) (iii)的步骤(i)制备含有权利要求5所述的标签肽融合蛋白与该标签肽融合蛋白之外的物质的混 合物的步骤；( )使权利要求8 11中任一项所述的抗体与由所述⑴的步骤得到的混合物作用， 而形成所述标签肽融合蛋白与该抗体的结合物的步骤；(iii)使洗脱物质与由所述(ii)的步骤得到的结合物作用，从而使所述标签肽融合蛋 白从抗体上游离的步骤。
13.如权利要求12所述的蛋白纯化方法，其中，洗脱物质为亲水性有机溶剂。
14.一种蛋白检测或定量方法，其中，包括下述(i) (iii)的步骤 (i)制备含有权利要求5所述的标签肽融合蛋白的样品的步骤；( )使权利要求8 11中任一项所述的抗体与由所述(i)的步骤得到的样品作用，而 形成所述标签肽融合蛋白与该抗体的结合物的步骤；(iii)对由所述(ii)的步骤得到的结合物进行检测或定量的步骤。
15.保藏编号为FERMBP-11061的小鼠-小鼠杂交瘤细胞P20. 1。
16.一种试剂盒，用于表达、纯化、检测或定量蛋白，其中，含有权利要求7所述的重组 载体或权利要求8 11中任一项所述的抗体。
全文摘要
本发明提供具有式(I)所示的氨基酸序列的标签肽以及该标签肽的抗体。通过组合使用本发明的标签肽及抗体，能够构建可通过容易的操作高纯度且廉价地对由克隆基因表达的蛋白进行纯化的系统。X1-Tyr-X2-Gly-Gln-X3(I)(式中，X1、X2及X3相同或不同，表示任意的氨基酸残基)。
文档编号C07K4/00GK101970456SQ200880126098
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年1月31日
发明者高木淳一 申请人:国立大学法人大阪大学