供纯化用的双亲和性多肽的利记博彩app

专利名称：供纯化用的双亲和性多肽的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于纯化固体支持物上的靶生物分子的方法，包括下列步骤(a) 使(i)靶生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体的固体支持物接触。
背景技术：
治疗性蛋白质的回收和纯化占生物学药物制备成本的约50%。一般的工业纯化 方法常常包括许多单元操作步骤，如提取、沉淀、以及阴离子和阳离子交换层析。亲和层析 是优选的下游加工步骤，这是由于其回收、产量和特异性高，但是亲和层析的当前成本和限 制是非常实质性的，而且在许多情况中阻碍了此单元操作的更普遍的使用。关于常规纯化 方法(包括亲和层析)的一般描述，参见例如Jason和Ryden 1998 (Jason, J-C和Ryden, L. , ProteinPurification-Principles,high-Resolution,Methods and Applications,第 2 版，Wiley & sons Inc. New York，1998)。一般而言，常规亲和层析的特征在于具有固定于固相基质的捕捉配体。配体可逆 地结合流体诸如液体培养基或血清中存在的靶分子。通过在洗脱条件解离复合物来回收靶 分子。商品化亲和基质处于即用形式，包括与基质共价附着的捕捉配体。在常规的亲和层 析中，配体与靶蛋白之间的解离常数，即KD，在约10_5-10_7M的范围内。常常不可能使用具有 超过10_1(1-10_、的解离常数的相互作用，因为那样解离复合物所需要的条件与那些会导致 靶蛋白变性的条件相同。在先技术包括文献(ffilchek,M.和 Gorecki，M. (1973)，A New Approachfor isolation of BiologicalIy Active Compounds by Affinity Chromatography Isolation of Trypsin)中记载的亲和层析纯化方法的备选变型。FEBS Letters. 31，1，149-152描述了固定在不溶性材料上的抗体。抗体针对附 着于两个或更多个蛋白质的复合物的某些配体具有亲和力，而且不依赖于复合物自身的化 学、物理和生物学特性。固定化的抗体基质充当用于浓缩复合物的手段。然后可以通过洗 脱从柱回收吸附的复合物。作者使用与二硝基苯基化大豆胰蛋白酶抑制剂(DNP-STI)起反 应的胰蛋白酶来形成复合物。复合物被吸附至抗DNP柱，并在解离抗原-抗体结合的条件 下洗脱。然后亲和柱准备好进行下一轮纯化循环。通过在随后的步骤中将胰蛋白酶-二硝 基苯基化大豆胰蛋白酶抑制剂复合物分离成它的各个成分来获得靶胰蛋白酶。此方法与本发明的不同之处在于亲和柱是可再用的，而且洗脱过程中解离的是固 定化试剂与接头之间的结合，而不是接头与靶生物分子之间的键。由 Hammarbergh，B.等(Proc. Natl. Acad. Sci USA，86，4367-4371 (1989))所描述 的另一种概念是融合蛋白亲和力办法及其用于表达重组人胰岛素样生长因子II的用途。 该方法涉及两种不同亲和蛋白尾部(A和B)之间融合的感兴趣重组靶蛋白(X)。该蛋白质(X)具有蛋白酶敏感性位点。首先将含有重组三联融合蛋白的细胞裂解液流过含有尾部B 特异性配体的亲和柱。如此可以获得全长蛋白质和含有C端融合蛋白区的蛋白水解片段的 混合物。在第二次流过尾部A特异性亲和柱后，降解的蛋白质流过而全长融合蛋白得到保 留。对尾部的位点特异性切割后，如下获得感兴趣的蛋白质(X)，即使切割混合物流过尾部 A和B的混合亲和柱，并收集流过液。作者描述了通过将靶蛋白表达为双亲和性蛋白质构建 体之间的整合部分来获得靶蛋白的方法。这不同于本发明，因为所描述的亲和方法需要两种不同亲和柱，而且将该柱上的 固定化配体与双亲和性融合蛋白解离以回收靶生物分子。洗脱步骤和再生方法后，亲和柱 准备好进行下一轮亲和纯化循环。靶蛋白仅仅是融合蛋白的一部分，并且在酶促降解步骤 后获得。在 Ford，C. F.，Suominen, I，Glatz, C. E. (1991) Fusion Tails for the Recoveryand Purification of Recombinant Proteins.Protein Expression and Purification, 2,95-107的综述文章中，作者讨论了使用融合尾部系统来促进重组蛋白从 粗制细胞提取物或培养基的有效回收和纯化的应用和优点。在这些系统中，将靶蛋白遗传 工程化改造成含有C端或N端多肽尾部，其在回收和纯化中为特异性提供生物化学基础。融 合尾部对于增强用于工业下游加工的回收方法是有用的。然而，为了纯化靶蛋白，包括供特 异性酶促切割用的位点，其容许在回收后除去尾部。文章描述了具有一个结合配偶体的融 合蛋白的应用，所述结合配偶体对固定在基质上的配体具有亲和力。根据需要，该方法包括 酶促切割步骤以从融合物尾部回收靶蛋白。这不同于本发明，因为所描述的亲和方法要求自固定在柱基质上的配体解离融合 蛋白以回收蛋白质。洗脱步骤和再生方法后，亲和柱准备好进行下一轮亲和纯化循环。还 有，与本发明的不同之处在于靶蛋白是融合蛋白的一部分，并且仅在酶促加工步骤后获得。^fc Rigaut, G.等(1991)(A Generic Protein Purification Method for ProteinComplex Characterization and Proteom Exploration. Nature Biotechnology, 17,1030-1032)中，描述了使用串联亲和纯化(TAP)标签来纯化蛋白质复合物的通用方法。 纯化需要一个亲和步骤，接着是从复合物切割第一亲和标签的酶促步骤和自蛋白酶回收靶 蛋白复合物的第二亲和纯化步骤。总的来说，该方法牵涉组合的两个结合配偶体，均用于结 合固定于柱基质的配体和用于暴露第二结合配偶体的蛋白酶切割步骤。这不同于本发明，因为所描述的亲和方法要求自固定在柱基质上的配体解离融合 蛋白以回收蛋白质。洗脱步骤和再生方法后，亲和柱准备好进行下一轮亲和纯化循环。还 有，与本发明的不同之处在于靶蛋白是融合蛋白的一部分，并且在酶促加工步骤后获得。EP1529844描述了一种用于改变重组靶蛋白特性的方法，牵涉靶蛋白和结合配偶 体的共表达。靶蛋白和结合配偶体在细胞中形成复合物。复合物形成导致改变的特性，诸 如宿主生物体中表达的天然或重组靶蛋白的积累、稳定性和/或完整性、亚细胞定位、翻译 后修饰、纯化、和相分配性能。结合配偶体可以提供实现复合物和其中含有的靶蛋白的共纯 化的亲和标签。此描述不同于本发明，因为它描述了结合剂与靶物的共表达以便在细胞中形成复 合物。所披露的方法一般用于改变靶蛋白特性，而本发明描述了明确设计用于促进一种专 用纯化方法的双亲和性多肽，其中所述双亲和性多肽需要拥有特异性结合特性。
Linder 等，(Linder, M. ，Nevanen, T. ，Soderholm, L. ，Bengs, 0.禾口 Teeri，T.， 1998，Biotechnology and Bioengineering, 60 (5) :642_647)描述了 CBD 在融合蛋白中作
为亲和标签用于纯化的用途。观察到一些柱泄漏。Shpigel, E.等(Biotechnol. Appl. Biochem. (2000)31，197—203，“Expression， purification and application of Staphylococcal Protein A fused to cellulose-binding domain")描述了使用蛋白A-CBD双亲和性多肽纯化IgG的例子。他们宣称他们经由融合蛋白的纤维素结合域(CBD)通过选择固定于固相的蛋白A 功能性的固定化来省去昂贵的偶联方法。将融合蛋白固定在柱上，之后添加靶物。由于泄漏问题，双亲和性分子的这种选择对于生物药学应用是不合适的。Sano等(美国专利5，328，985)描述了一种在大肠杆菌(Escherichia coli)中表 达的融合蛋白，其由链霉抗生物素蛋白和蛋白A的一个或两个免疫球蛋白G(IgG)结合域组 成。链霉抗生物素蛋白-蛋白A(ST-PA)融合蛋白具有功能性生物素和IgG结合位点。Sano 进一步描述了链霉抗生物素蛋白-蛋白A融合蛋白、针对牛血清清蛋白(BSA)的单克隆抗 体和生物素化的辣根过氧物酶的复合物。Sano还描述了一种使用ST-PA融合蛋白来标记细 胞的方法。将细胞与针对细胞表面抗原(即Thy-I)的抗体一起温育。随后将嵌合蛋白生 物素化的标志物复合物添加至细胞悬液。使用此技术来将生物素化的FITC投递至在其表 面上具有Thy-I抗原的细胞的表面。然而，Sano并没有描述或提示使用ST-PA融合蛋白作为一种用于纯化目的的工 具，他也没有描述一种单次使用亲和层析柱材料的方法，也没有描述靶蛋白的回收。WO 97/19957描述了涉及出于所述目的使用ST-PA融合蛋白将毒素或核酸投递入 特定细胞类型中的发明。与Sano等(参见上文)类似，抗体识别细胞表面上的表面抗原。 ST-PA结合抗体，而且促进与结合至生物素结合位点的生物素化毒素的连接。然而，没有描 述或提示使用ST-PA融合蛋白作为一种用于纯化目的的工具。WO 01/95857披露了一种用于从哺乳动物血液提取毒性物质的方法和成分。该方 法包括制备亲和柱( 体外装置)和一种用于从哺乳动物体液体外提取毒性材料的方法， 其与诊断或治疗哺乳动物疾患或疾病有关。通过偶联生物素化的实体与含有固定化的抗生物素蛋白的基质来制备该专利中 例示的体外亲和柱。生物素化实体包括强力结合哺乳动物血液中的毒素的部分。遵循常规 的亲和层析方法从血液除去(即固定化而不通过洗脱从柱回收)毒性材料。来自流过层析 过程的液流的产物是纯化的血液，因为靶物(毒性材料)在该过程后仍固定在柱上。这不同于本发明，因为它描述了一种以高亲和力紧密结合靶物以从产物除去靶物 的方法。该纯化方法也不同于本发明，因为产物不结合亲和柱，而使流过，并随着毒性材料 (靶物)消减进行收集。毒性材料并没有得到释放或回收。WO 97/09068披露了一种改变两对生物分子之间的平衡解离常数的方法和化学 成分。所述化学成分是一种可以进行刺激以改变构象，并如此改变结合效率的聚合物。例 如，将该聚合物与固定于亲和层析柱基质的结合配偶体(配体)的特异性位点偶联。WO 97/09068没有描述或提示双亲和性成分用于亲和纯化的用途，也没有描述或提示回收靶分子。一般而言，想要会改善捕捉效率并简化纯化过程以及降低成本的方法。
发明_既述一般而言，本发明显著改善并简化下游加工，并降低亲和层析方法的成本。本发明 包括固定于基质的通用捕捉配体、靶生物分子和针对靶物和捕捉配体分别具有不同结合亲 和力的半通用双亲和性多肽。双亲和性多肽与靶生物分子起反应以形成中等结合亲和力的 复合物，并且所述复合物非共价结合至具有强结合亲和力的通用亲和基质。如下回收靶生 物分子，即从通用基质进行特异性洗脱，留下附着至基质上的捕捉配体的双亲和性多肽，这 是由于对配体的紧密结合，其阻止自固相基质泄漏。在第一方面，本发明提供了一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a) 使(i)靶生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体或双亲和性多肽结合位点 的固体支持物接触，其中双亲和性多肽的平衡解离常数之间的比率，即[KD, t/KD, J，在标准 条件至少为10° ；并(b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。在第二方面，本发明提供了一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a) 使⑴靶多肽、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体的固体支持物接触，其中所述双 亲和性多肽在标准条件下具有范围为10_2至10_13M，更特别为10_4至10_13M的针对所述靶生 物分子的平衡解离常数，即KD, t，且其中所述双亲和性多肽对所述固体支持物上的所述捕捉 配体的结合是通过切割对位取代的苄基鸟嘌呤产生硫醚键而提供的；并(b)通过洗脱来回 收所述靶生物分子。发明详述在常规的亲和层析中，将捕捉配体直接附着至支持物。主要的技术挑战是在例如 柱的配体偶联、支持材料的性质、流动、反压和物理尺寸方面优化整个系统。应当理解的是， 高效亲和柱中的数个技术限制是紧密联系的，使性能和成本优化以及按比例扩大很困难。 在传统的亲和层析中，配体优选拥有下列特征a)配体应当具有容许容易地共价附着于基质的化学特性。b)配体必须能够与靶分子形成可逆的复合物。c)配体对靶分子的亲和力的特异性必须适合于所计划的应用。d)配体_靶分子复合物在“加载条件”下的解离常数应当强得足以实现稳定复合 物的形成或者在靶分子的洗脱中给出足够的延迟。e)从靶分子解离配体应当是容易的，其通过在不会不可逆地损害任一者的情况中 改变条件(例如PH或盐浓度)来实现。此外，在传统的亲和层析中，配体通常共价附着至基质，而且还是结合靶分子的成 分。纯化的容量和质量受靶物与亲和柱中的配体之间的接触时间(即所谓的停留时 间)影响很大。除靶蛋白对固定化配体的结合速率外，扩散入柱中层析珠内的孔中和蛋白质自溶 质的物质转移会影响层析基质的动力学结合容量。靶蛋白自溶质的物质转移取决于多种因素，包括交联的类型和程度、支持材料的 可压缩性、孔的大小和靶蛋白的物理大小。流速、蛋白质浓度、柱长度、温度、缓冲液、传导率、和pH也能影响到孔扩散和吸附 剂的动力学结合容量。
由于需要快速开发下游方法和调节性的约束条件，特定类型的生物学产物(诸如 例如治疗性抗体)的停留时间在早期开发中通常是固定的。因此，常常尝试在具有例如较 大的床高度的大规模柱中调节流速以维持小规模开发过程中使用的理想的停留时间。由于技术限制和购买工艺规模层析设备所需要的大量投资，传统高效亲和层析的 按比例扩大是一项很大的挑战。本发明提出一种具有较少技术限制的更为简单和灵活的按比例扩大的方法。此外，常规亲和层析的特征在于用于提供柱材料重复使用的再生方法。这些清洗 方法需要广泛的确认以容许柱的多次使用。本发明与常规的亲和层析在数方面有所不同，例如·固定化的配体紧密结合双亲和性多肽(DAP)以便阻止在洗脱条件下的解离·其意图用于单次使用的应用从上文看清楚的是，配体在本发明中的作用是结合DAP分子，而不是靶分子。亲和层析有吸引力的益处在于它在单次单元操作中提供纯度的大量升高及靶分 子材料的最小损失。然而，亲和层析的特征还有高成本，这妨碍大型柱的使用，并且如此促 成较小柱的重复使用。这导致与柱再使用次数成比例的生产过程延长和容量损失、增加的 靶分子损失和/或对靶分子的修饰。原则上，典型的亲和层析基质可以使用多至100次运 行(rim)或更多，但是制备规模中的平均运行数表现得低数倍。基质在其理论寿命结束前 很久便被丢弃的原因之一在于制备中使用的亲和柱的尺寸是为了在远少于100次运行中 加工整个发酵批次而形成的一以便节约成本，而且降低污染和操作失败的风险。可以在加 工一个发酵批次后丢弃基质，而不是对数个发酵批次使用同一基质，这导致亲和基质上相 对较少的平均运行次数。控制流过亲和层析支持物的流速在实现结合方面是重要的。流过柱支持物的流速 不可避免地与分离效率有关；过快的液流会引起流动相比到达内部珠体积所必需的扩散时 间更快地通过珠。对于每次应用，可以选择流速来实现靶蛋白的有效结合和洗脱与快速分离之间的 最佳平衡。重力驱动的流动层析是非常缓慢的，而且蛋白质分离的分辨力(resolution)可 受次级扩散作用的不利影响。因此，现代系统具有用于控制流速的主动泵送和用于确保不 超过最大限度操作反压的反压连续监测。在常规的柱中，主要的顾虑是污垢。碎片、蛋白质和盐可以缓慢地在高性亲和层析 支持物的通道中积累污垢层，导致流速改变、物质转移率降低、反压升高和亲和配体的隐蔽 和灭活。特别地，脂质和脂蛋白材料能快速阻塞层析柱，而且常常有必要在亲和纯化前除去 它们。这对于源于腹水流体的样品是特别重要的。可以如下完成此预纯化步骤，即用例如硫酸右旋糖苷和聚乙烯吡咯烷酮进行沉淀 步骤，接着进行离心和透析或脱盐。该步骤可导致5-10%的靶蛋白损失。省略去脂步骤对于本发明的亲和纯化系统是有可能的，因为该柱是单次使用。这 会导致更高的总体靶物回收和更高效的下游加工工作流。由于依照本发明的柱的预期单次使用，洗脱步骤也得到简化。因为本发明的支持 材料不进行再次使用，可以更自由地选择洗脱条件。例如，有可能选择具有非常规的高盐浓 度、强离液剂、有机溶剂等的任何洗脱缓冲液，其会容许回收完整的靶物，并留下附着于支持物的DAP分子。支持材料的特性是否在例如结构和流动特征方面不可逆地改变以及是否 不能再使用是不重要的。选择洗脱条件的这种灵活性在使用传统的高效亲和纯化系统时常常是不可能的， 因为内部结构和表面是高度优化的，而且对聚合物膨胀或沉淀敏感。另外，由于传统亲和柱 的成本，操作人员可能不愿测试新洗脱条件，进一步降低了洗脱优化的灵活性。传统的亲和纯化操作包括平衡、样品加载、洗脱和就地清洗(cleaning-in-place， CIP)的循环。不得不对每种特定靶物纯化设计清洗步骤或卫生处理方案。如上文所描述的，操 作过程中的主要顾虑是污垢层的积累或运行间的交叉污染。清洗步骤常常包括使用化学上严格的缓冲液，如0. IM NaOH/IM NaCl或与氯化钠 或乙醇组合的0. IM磷酸，接着进行再生。充分建立的是，一般而言，动力学结合容量随着 CIP循环数目增加而降低。因此，需要寻找纯化的靶物质量，运行、CIP的数目与特定柱的大 小和成本之间的最佳状态。此外，需要对大多数药学纯化监测纯化质量的变化。如本发明所提出的，这种质量确认及对CIP和运行的优化的成本可以得到很大地 降低。在上文所概述的用于纯化例如单克隆抗体的常规亲和层析中，捕捉配体(蛋白A) 附着于固相基质，并且具有针对靶生物分子(单克隆抗体)的亲和力。本发明与常规的亲 和纯化技术相比为下游加工工业提供了优势，这是由于较低的成本、高特异性和容易使用， 而没有牺牲下游工艺的质量。本发明的本质特征是使用双亲和性多肽作为靶分子与包含配 体的固体支持物之间的接头。这些双亲和性多肽对于生物药学和诊断性蛋白质和肽的下游 加工是特别有用的。本发明提出通过消除当前系统中的数个约束条件来改善整个亲和纯化方法。通过使用本发明的双亲和性多肽(DAP)和通用支持物，大多数上述问题和限制可 以得到完全消除或减少。依照本发明，双亲和纯化技术的特征在于通用固体支持物(其在一个实施方案中 是固相基质)加上起接头分子作用的即用的特异性双亲和性多肽。双亲和性多肽与靶生物 分子起反应。随后，双亲和性多肽-靶生物分子复合物非共价连接至固定于固体支持物上 的捕捉配体，其通过使复合物与固体支持物接触来实现。通过特异性洗脱来回收靶生物分 子。双亲和性多肽在洗脱过程中仍附着于固体支持物上的配体。因此，一方面，本发明涉及一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a) 使(i)靶生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体或双亲和性多肽结合位点 的固体支持物接触，其中双亲和性多肽的平衡解离常数之间的比率，即[KD, t/KD, J，在标准 条件下至少为10°，并(b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。双亲和性多肽充当固体支持物与靶分子之间的连接配偶体。在一个具体的实施方 案中，双亲和性多肽针对固定化配体的亲和力比针对靶分子的亲和力强。此外，结合亲和力 的这种差异可以表示为平衡解离常数之间的比率。在一个实施方案中，此比率至少是1。依照本发明的双亲和性多肽包含至少两个结合位点，其中一个结合位点具有针对 配体的亲和力而另一个结合位点具有针对靶分子的亲和力。这些结合位点是基于多肽的， 意味着它们包含完整的蛋白质或蛋白质片段。此类片段应当至少包含蛋白质中含有特定靶
9物结合位点的部分。双亲和性多肽可以是融合多肽或者可以是以任何合适的方式(例如通 过接头区段)化学连接的两种或更多种多肽。因此，本发明在进一步的实施方案中涉及一种双亲和性多肽，其具有范围为10_2 至ICT13M(例如I(T8M)的针对靶生物分子的平衡解离常数KD,t，和范围为10_9至IiT16M(例如 IO-10M)的针对捕捉配体的平衡解离常数KD,s，同时比率KD,t/KD,s应当匹配以使得该比率至少 为10°，更特别地至少为101，更特别为102，更特别为103，并且甚至更特别为104。换言之，上文意味着在优选的实施方案中DAP对靶物的结合比DAP对配体的结合 弱。特别地，所述双亲和性多肽具有范围为10_4至10_13M，更特别地，范围为10_6至 10_13M的针对所述靶多肽的平衡解离常数KD, t，和范围为10_9至10_16M，更特别地，范围为 10_"至IiT16M的针对所述捕捉配体的平衡解离常数KD, s。一般而言，针对配体或柱的结合不能过于强烈。因此，在范围上限的数值就Kd,3而 言是不重要的。在本发明的语境中，依照如下反应测量平衡解离常数 A和B表示结合配偶体靶生物分子和双亲和性多肽或双亲和性多肽和固定在固 相基质上的捕捉配体。上述反应的速率常数表示两种分子A和B结合和解离的速率。
当速率在平衡ka[A] [B] = kd[AB]处相等时，其得到
应当依照表观平衡解离常数来评估要在双亲和性多肽中采用的候选结合域，所述 表观平衡解离常数基于给定的DAP分子中每种双亲和力的总体结合亲和力，而不管它是否 含有针对每种特异性(靶物/捕捉配体)的一个或数个结合域。例如如果A和B分别表示 蛋白A(具有四至五个结合域)和抗生物素蛋白(具有四个结合位点)，那么上述范围对与 一个抗生物素蛋白分子融合的一个蛋白A分子应当适用。然而，这并不排除如下的可能性， 即例如，DAP分子可以由针对靶物的数个结合候选物和针对基质上的配体的数个候选物组 成。例如在另一个实施方案中，DAP可以由与一个或多个抗生物素蛋白分子连接的3个蛋
10白A分子组成。因此，在本发明的语境中，应当基于共同结合域的表观结合常数来评估指定 的范围，如上文所定义的。在本发明的语境中，通过使用Biacore仪进行的表面等离振子共振(SPR)技术来 测定指定的平衡解离常数，如在实施例中详细例示的。本文中所描述的条件表示标准条件。 作为用于选择要在DAP分子中组合的不同结合域的合适起始点，可以使用发表的KD。应当基于特异性结合条件过程中的KD，而且还要考虑所计划的洗脱条件(此时靶 物得到回收，而DAP分子保留在支持物上)来选择两个结合对。如上文所描述的，通过使用表面等离振子共振(SPR)来实现DAP分子的背景中的 各个结合域的解离亲和力的测定。可以用Biacore系统来完成此类评估。Biacore具有商 业仪器，其中基于sra的测量对蛋白质-蛋白质相互作用进行测定。进行如下评估，其具有 固定在Biacore仪中使用的传感器芯片上的完整DAP。Biacore系统在其与其它分子相互 作用的特异性、其相互作用(结合和解离)的速率、及其亲和力(它们何等紧密地结合另一 种分子)方面限定蛋白质的特征。此技术已经得到描述，例如用于测定特异性抗体与其靶 物之间的结合相互作用(参见例如R0nnmark, 2002，Eur. J. Biochem.，269 =2647-2655)。在下文的实例中，已经评估数种DAP候选物，而且已经对它们测量了完整的DAP在 标准条件(如实施例中所描述的)下的结合亲和力。也可以使用其它方法，然而，结果则可 能有所不同。下文已经描述了备选方法的列表。非共价蛋白质-配体相互作用的定量测量是公知的。适合于本发明定量测量特定 关联性的结合常数的方法包括表面等离振子共振(SPR)和圆二色性(CD)的各种型式。其它方法包括用于动力学滴定的质谱法，如ESI-MS滴定、HPLC-ESI-MS滴定或 MALDI-SUPREX 滴定。其它方法基于测定配体在结合位点处的解离常数，其间接通过用放射性配体竞争 性替换或者通过测量NMR化学位移作为浓度的函数，对例如信号猝灭的荧光光谱学分析、 对配体占有的X射线晶体学测量、等温量热学(ITC)或酶抑制来实现。其它方法还使用经标记的配体，例如经酶标记的配体的毛细管电泳及激光诱导的 荧光检测。或者，可以通过使用重新设计、数据挖掘和复杂算法从计算技术找到结合常数。在本发明的语境中，如权利要求书中所规定的适合于平衡解离常数的范围应当适 用于完整的双亲和性多肽，而不适用于分开测量的单个结合部分。此外，若单一候选结合域具有比依照本发明的需要弱的针对靶物或配体的结合亲 和力，则它仍可以通过将数个此类候选结合域组合成一个DAP而成为可适用的。这是由于价效果。有可能由于亲和力增加而获得增强的结合强度。组合成多聚 体的具有低固有亲和力的单一结构域常常产生亲和力效果，其导致较慢的解离速率和功 能亲和力升高 100 倍以上(MacKenzie，C. R.等(1"6)，Analysis by surface ρlasmon resonance of the influence of valence on the ligandbinding affinities and kinetics of and anti carbohydrate antibody. Journal ofBiological Chemistry,271, 1527-1533)。有可能从单价和二价结合测量效果，但是在较高的结合价时，情况变得如此复 杂以至于不可能区别不同结合价。然而，可以获得相对数据，并在本发明的语境中使用。本发明提供了一种纯化方法，其中在一个具体的实施方案中可以在自由溶液(free solution)中完成靶分子与双亲和性多肽之间的第一反应。与界面反应相比，自由溶 液中的反应结合动力学快约 1000 倍(Nygren，H.禾口 Stenberg，Μ. (1989) Immunochemistry at interfaces. Immunology, 66, 321-327)。随后，靶分子-双亲和性多肽复合物被呈递至并有效结合至固体支持物上的配 体。强力的结合(配体针对双亲和性多肽的快速结合速率和缓慢的解离速率)消减靶 物-DAP复合物的移动相。经由由双亲和性多肽的第二结合功能性促进的这种连续方法从 溶液回收靶分子。由于平衡解离常数的所述差异，可以在不洗脱双亲和性多肽的情况中有效洗脱靶 多肽。在一个实施方案中，可以通过改变溶液中的PH、离子强度、或离液离子，或其任意组合 来实施洗脱。可以通过改变条件，如pH、离子强度、温度和极性特性来影响Kd值。不幸地，Kd的 文献数值并不总是在相关洗脱条件列出的。虽然如此，本领域技术人员会能够找到如下的 洗脱条件，其在对固体基质的结合足够强的情况中仅会破坏最弱的结合而不干扰较强的结 合(即在标准结合条件测量时，KD,s< 10_9M，而Kd值之间的比率为至少1)。关于解离常数、特异性、结合和可能的洗脱条件，用于选择本发明的靶物特异性结 合对的标准类似于那些用于传统亲和层析的。然而，因为洗脱条件通常不同于在本发明中 在Biacore仪上测量Kd时所应用的条件，已经在标准条件(其等于实施例中使用的条件) 下测量了为DAP的两种独特结合亲和力的可应用范围设定的极限。用于选择本发明的特异性配体结合域的标准略不同于传统亲和层析中使用的标 准，因为不要从支持物洗脱DAP分子。特异且强力的，但是在正常洗脱条件下不能被破坏的结合域不适合于传统的亲和 层析。可以在本发明中使用此类结合域。例子包括非常特异性的生物素-链霉抗生物素蛋 白结合，其对于大多数实际应用在洗脱条件下不能被逆转，而且因此完全适合作为本发明 的结合对之一。一般而言，DAP与配体之间的结合应当比DAP与靶物之间的结合强，而且强得足以 阻止靶物洗脱过程中DAP分子自支持物的泄漏。优选的配体-DAP结合对是强力的，而且没有展现出或者展现出很少的由于改变 PH、离子强度、溶剂、离液剂、温度等引起的结合强度降低。应当清楚的是，在使用本发明的系统改变纯化规模时，将所添加的DAP量针对靶 蛋白的量和浓度进行调节。因为DAP分子可以作为浓缩物提供，可以在例如pH和盐方面调 节结合条件。还有，可以选择温度和时间来给出最佳的结合和随后的纯化。通用柱的大小和容量选择为大得足以捕获DAP分子。潜在地，平行或捆式(in a bundle)使用数个柱。若纯化另一种靶物，则选择另一种合适的DAP分子。可以使用同一或另一种柱。在一个实施方案中，双亲和性多肽是融合多肽。可以或是通过化学连接两种合适 的蛋白质来制备此类融合多肽，或是备选地在另一个实施方案中融合蛋白可以作为重组多 肽合成。可以以任何合适的方式(例如通过接头区段)来连接融合多肽，并且融合多肽应 当至少包含选定蛋白质的结合域。应当以不会使其不稳定(导致降解)的方式选择接头 肽。接头可以是例如高度0-糖基化的接头，如已知来自真菌糖酶的催化域和碳水化合物结合域之间的接头，或者它可以是富含脯氨酸的接头。双亲和性多肽包含至少一种结合域，其能够以想要的结合特异性结合靶生物分 子，如所描述的。结合域可以包含在完整的蛋白质中或者它可以是蛋白质中保留了其结合 特异性的片段。文献中已经描述了许多如下蛋白质，它们展示针对生物分子(例如肽、蛋白 质、DNA、RNA、碳水化合物)的亲和力，而且所有此类蛋白质或其片段在本发明的语境中作 为双亲和性多肽的候选物潜在是有用的。因此，在一个实施方案中，所述针对靶生物分子的结合域可以选自但不限于下组 蛋白A、蛋白A片段、蛋白A衍生的结构域(例如称为亲和体⑥的结构域)、抗体、抗体片段、 脂笼蛋白、和凝集素。已经将组合蛋白质工程应用于开发如下的人工蛋白质，其能以高亲和力结合选定 的靶物，并且作为抗体的备选使用(Nygren，P.-A.和Skerra，A. (2004). Binding proteins from alternative scaffolds. J. Immunol. Methods, 290,第 3 页-第 28 页；Binz, H. K.禾口 Pliickthun, Α. (2005). Engineered proteins as specif icbinding reagents. Curr. Opin. Biotech. 16，第459页-第469页)。在本发明的语境中，术语“亲和体(亲和体)”定义为 一类对其针对想要靶物的特异性结合活性进行了选择且基于Z结构域(其是通过葡萄球菌 蛋白A(SPA)的B结构域中的单一氨基酸取代衍生的58个残基的三螺旋束)的工程化改 造的蛋白质(Nilsson, B. , Moks, T. , Jansson, B. , Abrahmsen, L. , Elmblad, A. , Holmgren, Ε.等(1987) Protein Eng. 1，第107页-第113页)。Z结构域如五种同源SPA结构域那样 结合免疫球蛋白的Fc区，但是不像亲本结构域，它不结合Fab区。此类亲和体是蛋白A衍 生的结合域的例子。双亲和性多肽还包含至少一种结合域，其能够结合固定在固体支持物上的捕捉配 体。此第二结合域可以包含在完整的蛋白质中，或者它可以是蛋白质中保留了其结合特异 性的片段。在一个实施方案中，第二结合域选自但不限于下组抗生物素蛋白、链霉抗生 物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、类固醇受体、抗体、抗体片段、淀粉葡糖苷酶 (AMG)、酶的结构域(例如纤维素结合域，CBD)、脂笼蛋白、和凝集素。如上文所述，第二结合 域的这些候选物意图作为例示本发明的例子，然而，这些例子不应看作仅有的可用组合。在一个实施方案中，抗体选自下组美洲驼(llama)抗体和骆驼抗体。在一个具体的实施方案中，依照本发明的双亲和性多肽包含与抗生物素蛋白、链 霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白的至少一个生物素结合域融合的蛋白A的至少一个 结合域。在一个具体的实施方案中，依照本发明的双亲和性多肽包含与抗生物素蛋白、链 霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白的至少一个生物素结合域融合的蛋白A衍生的结合 域的至少一个结合域。在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与抗生物素蛋白、链霉抗生物素 蛋白或中性抗生物素蛋白的至少一个生物素结合域融合的亲和体的至少一个结合域。在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与抗生物素蛋白、链霉抗生物素 蛋白或中性抗生物素蛋白的至少一个生物素结合域融合的抗体的至少一个结合域。在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与AMG、CBD或(VhhRR6(R2))融合 的蛋白A的至少一个结合域。
在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与AMG、CBD或(VhhRR6(R2))融合 的蛋白A衍生的结合域的至少一个结合域。在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与AMG、CBD或(VhhRR6(R2))融合 的亲和体的至少一个结合域。在另一个具体的实施方案中，双亲和性多肽包含与AMG、CBD或(VhhRR6(R2))融合 的抗体的至少一个结合域。可以化学连接双亲和性多肽，如实施例中所例示的；然而，用于生成双亲和性多肽 的更加成本有效的方式会是将它表达为重组融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，将融合多肽作为重组多肽生成。还涵盖的另一种可能性是在宿主细胞中共表达融合蛋白和靶生物分子，这使得有 可能将粗制细胞培养提取物直接加载到固体支持物上。在进一步的实施方案中，分开但在同一类型的宿主细胞中表达靶生物分子和DAP。在一个具体的实施方案中，将融合蛋白作为重组蛋白表达，具体地，在一个实施方 案中，融合蛋白是与蛋白A连接的重组链霉抗生物素蛋白。可以在大肠杆菌(E.coli)中 胞内生成此类融合蛋白，如记载于Sano (T. Sano和C. R. Cantor (1991) BioTechnology 9第 1378页-第1381页)，优先使用携带两个IgG结合域的构建体pTSAPA_2来实现。然而，此 构建体在工业方面不可行，因为内含体在大肠杆菌中的胞内生成及回收没有给出工业相关 产率，而且生产方法是高度复杂的。基于例如芽孢杆菌(Bacillus)或曲霉(Aspergillus) 中生成的分泌型融合物的方法具有高得多的工业实用性。优选地，编码依照本发明的融合蛋白的核苷酸序列可以通过将包含所述序列的核 苷酸序列或核酸构建体插入适合于表达的载体中来表达。在创建表达载体时，编码序列位 于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作连接。重组表达载体可以是任何如下载体(例如质粒或病毒)，它们可以方便地进行重 组DNA方法，而且能引起核苷酸序列表达。载体的选择通常会取决于载体与要在其中导入 载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于 染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可以含有任何用于 确保自我复制的手段。或者，载体可以是在导入宿主细胞中时整合入基因组中，并与整合了 该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或者共同含有要导入宿 主细胞基因组中的全部DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。本发明的载体优选含有一种或多种选择标志，其容许简单选择经转化的细胞。选 择标志是如下的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的 原养性等。条件必需基因可以发挥非抗生素选择标志的功能。细菌条件必需非抗生素选择标 志的非限制性例子是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、或其它芽孢杆菌的dal基因，其仅当在没有D-丙氨酸的情况中培养细菌 时是必需的。当在存在半乳糖的情况中培养或者在引起半乳糖存在的培养基中培养细胞 时，编码牵涉UDP-半乳糖周转(turnover)的酶的基因也可以在细胞中发挥条件必需标志 物的功能。此类基因的非限制性例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的编码UTP依赖性磷酸化酶(EC2. 7. 7. 10) ,UDP-葡萄糖依赖性尿苷酰转移酶(EC 2. 7. 7. 12)、或UDP-半乳 糖差向异构酶(EC 5. 1.3.2)的基因。芽孢杆菌的木糖异构酶基因诸如xylA在以木糖作为 唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中也可以作为选择标志使用。对于利用葡糖酸盐必要 的基因，即gntK和gntP在以葡糖酸盐作为唯一碳源的基本培养基中培养的细胞中也可以 作为选择标志使用。条件必需基因的其它例子是本领域中已知的。抗生素选择标志赋予针 对抗生素诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤 的抗生素抗性。合适于酵母宿主细胞的标志物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPUP URA3。 用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨 酸氨甲酰基转移酶)、bar (草胺磷乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸 还原酶)、PyrG(乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻 氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)的 bar 基因。本发明的载体优选含有如下元件，其容许载体整合入宿主细胞的基因组中或者容 许载体在细胞中独立于基因组自主复制。为了整合入宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或用 于通过同源或非同源重组整合入基因组中的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外 的核苷酸序列，用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞的基因组中染色体的精确位置 处。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应当优选含有足够数量的核酸，诸如100 至10，000个碱基对，优选400至10，000个碱基对，并且最优选800至10，000个碱基对，其 与相应的靶序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因 组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一 方面，可以通过非同源重组来将载体整合入宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所讨论的宿主细 胞中自主复制。复制起点可以是任何介导自主复制的质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术 语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序 列。细菌复制起点的例子是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、 和pACYC184的复制起点，和容许在芽孢杆菌中复制的pUBllO、pE194、pTA1060、和ρΑΜβ 1 的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和 CEN3的组合、和ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的例子是AMAl和ANSI (Gems等，1991，Gene 98 :61-67 ;Cullen 等，1987，Nucleic Acids Research 15 9163-9175；WO 00/24883)。可 以依照WO 00/24883中披露的方法来实现AMAl基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加基因产物的生 成。可以如下获得多核苷酸拷贝数的增加，即将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞
15基因组中，或者与所述多核苷酸一起包括可扩增的选择标志基因，其中可以通过在存在合 适选择剂的情况中培养细胞而选择含有选择标志基因的扩增拷贝并因此含有所述多核苷 酸的额外拷贝的细胞。用于连接上文所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术 人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，见上文)。本发明还涉及在多肽的重组生产中有利使用的重组宿主细胞，其包含本发明的多 核苷酸。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞中，使得载体作为染色体整合体或 作为自我复制型染色体外载体维持，如较早所描述的。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过 程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会很大程度 依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如真核生 物。有用的单细胞微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆 菌属(Bacillus)细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆 菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌 (Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽 ？包杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热月旨肪芽孢 Iflif (Bacillus stearothermophilus)、才古草芽 包杆菌(Bacillus subtilis)、禾口苏云金芽 孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属(Sti^ptomyces)细胞，例如浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者革兰氏阴性细菌， 诸如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，芽 孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌。将载体导入细菌宿主细胞可通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen， 1979，Molecular General Genetics 168 :111_115)、使用感受态细胞(参见例如 Young 和 Spizizin,1961,Journal of Bacteriology 81 :823_829，或 Dubnau 禾口 Davidoff—Abelson， 1971, Journal of Molecular Biology 56 :209_221)、电穿孔(参见例如 Shigekawa 和 Dower, 1988, Biotechniques 6 :742_751)、或接合(参见例如 Koehler 禾口 Thorne，1987， Journal of Bacteriology 169 :5771_5278)来实现。宿主细胞还可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。如本文中所使用的，“真菌”包括以下 门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、禾口接 合菌门(Zygomycota)(如由 Hawksworth 等，于 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,第 8 版，1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 所定义 的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上文，第171页中所引用)，和所有 有丝分裂真菌(Hawksworth等，1995，见上文)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。如本文中所使用的，“酵 母，，包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)禾口 属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽抱纲 (Blastomycetes))的酵母。因为酵母的分类在未来可能改变，出于本发明的目的，酵母 应当定义为如 Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M.,禾口 Davenport, R. R.编，Soc. App. Bacteriol. Symposium SeriesNo. 9,1980)中所描述的。在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵 母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母 (Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵 母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗 酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母 (Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵 母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉 (Yarrowia lipolytica)细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌 (Eumycota)和卵菌亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝 状真菌一般的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖 和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧 的。比较而言，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行， 而碳分解代谢可以是发酵的。在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢酶属(Acremonium)、 曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟 赌菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属 (Cryptococcus)、线黑粉酵母菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属 (Humicola)、_ 包胃 M (Magnaporthe)、^； β M (Mucor) > ^β M (Myceliophthora)、 新考玛月旨霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、 青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属 (Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、 嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属 (Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、 ft β (Aspergillus fumigatus) > I ffi β (Aspergillus foetidus)、 H ^ ft β
(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉细胞。在 另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷 键抱(Fusarium cerealis)、库威键抱(Fusariumcrookwellense)、大刀键抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗键抱(Fusariumgraminearum)、禾赤键抱(Fusarium graminum)、异 ？包键抱(Fusariumheterosporum)、合欢木键抱(Fusarium negundi)、尖键抱(Fusarium oxysporum)、多枝键抱(Fusarium reticulatum)、粉红键抱(Fusarium roseum)、接骨木键 抱(Fusarium sambucinum)、肤色键抱(Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱键抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圆德抱(Fusarium torulosum)、 拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。 在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑剌烟管菌(Bjerkmdera adusta)、干拟 (Ceriporiopsis aneirina)、干拟錯菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、 Ceriporiopsis pannocinta、 Ceriporiopsis rivulosa、 Ceriporiopsis subrufa 或虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛 革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa) ΛΤ^^^β (Mucor miehei)(Myceliophthora thermophila)
糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)、福身寸身寸脉菌(Phlebia radiata)、朿Ij序侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、杂色栓 菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei) 或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。可以通过牵涉原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的 方式转化真菌细胞。适合于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的方法记载于EP 238 023和 Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81 :1470_1474。 适合于转化镰孢属物种的方法记载于Malardier等，1989，Gene 78 147-156和WO 96/00787。可以使用由如下文献描述的方法来转化酵母=Becker和Guarente，于Abelson， J. N.禾口 Simon，M.I.编缉的Guide toYeast Genetics and Molecular BiologyiMethods in Enzymology，第 194卷，第 182页-第 187页，Academic Press，Inc.，New York ；Ito等，1983， Journal ofBacteriology 153 :163 ；及 Hinnen 等，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75 :1920o可以以数种任选方式来实施靶生物分子、双亲和性多肽(DAP)、与固体支持物之间 的接触。在一个实施方案中，可以在一步中使所有成分接触，例如通过在固体支持物上加载 靶多肽和融合蛋白而不在溶液中预温育。然而，可以使双亲和性多肽与靶物接触，之后在固 体支持物上加载此复合物。在此实施方案中，首先使靶生物分子与双亲和性多肽接触(例 如在溶液中)，随后使所形成的复合物与固体支持物接触。根据固体支持物的性质，此原则 的优选实施方案可有所不同。在一个优选的实施方案中，固体支持物是固相基质。这包括常规的固相基质。在 处于柱形式的固相基质的情况中，在一个实施方法中，可以首先使靶物与双亲和性多肽在 溶液中接触，随后通过将该复合物加载至柱上来与固相基质接触。然而，可以预见的是，例如可以首先在固体支持物上加载双亲和性多肽，随后加载 靶生物分子。在另一个实施方案中，固体支持物处于颗粒形式，在该情况中接触次序不太重要， 并且可以在一步中或者在数步中在溶液中方便地进行所有成分的接触。将依照本发明的捕捉配体共价附着至固体支持物。如上文所解释的，依照本发明 的配体与传统亲和层析(其中配体的目的是结合靶物)中使用的配体不同。在本发明中， 配体应当结合DAP。配体是本领域中公知的，并且下文是可以依照本发明应用的给定例子。在本发明的语境中，在一个具体的实施方案中，代替附着至固相的配体，固相可以备选地包 含针对DAP的结合亲和力或结合位点。例子可以是作为固相的纤维素和作为DAP的一部分 的CBD (纤维素结合域)。在一个实施方案中，配体选自但不限于下组生物素、阿卡波糖、类固醇、半抗原、 表位肽、染料、和酶抑制剂。在一个具体的实施方案中，配体是生物素。可以将配体化学附 着至固体支持物，如实施例中所描述的，其中例示阿卡波糖与活性红(reactive red) 6的化 学附着。亲和配体与支持物的偶联强烈地影响传统亲和层析柱的特异性、容量和成本。共价偶联技术中的当前技术状态容许结合配体与支持物的化学和区域选择性偶 联，其常使用间隔物或接头将配体锚定至表面来进行。非常注意避免使用接近结合位点的或在配体与靶分子之间的相互作用中发挥作 用的官能团。若配体上不存在合适的官能团，则可以进行对配体的进一步衍生化以添加合适 的官能团。许多参考文献描述了合适的化学，包括Greg T. Hermanson，Academic Press, 2008 ^"Bioconjugate Techniques，，禾口 Shan S. Wong, CRC Press, 1991 的"Chemistry of Protein Conjugation and Cross—linking，，。通常接受的是，高浓度的偶联配体常常对亲和层析具有不利影响，而且介质的结 合效率可能由于活性位点间的位阻而降低。这在大分子诸如抗体、抗原和酶与小配体相互 作用时是特别显著的。另外，靶物质可以变得更强力地结合紧密包装的配体，使洗脱困难，而且非特异性 结合的程度在非常高的配体浓度时升高，如此降低亲和柱的选择性。已知配体-表面的界面相互作用对于亲和配体性能是重要的。配体与表面之间的 间隔臂长度是至关重要的。若它太短，则臂是无效的，而且配体不能结合样品中的靶物。若 它太长，则蛋白质可非特异性结合间隔臂，而且降低分离的选择性。常使用长4-12个原子 的亲水性臂。MabSelect 介质和 HiTrap MabSelect (GE Healthcare)是使用重组蛋白 A 与基 质的定向偶联的亲和柱的例子，所述定向偶联是经由工程化改造的C端半胱氨酸和亲水性 间隔臂实现的。本发明提出使用可溶性双亲和性多肽，其可以是经表征的，并以对于特定靶物 浓度适合的任何浓度使用。将精细的(delicate)靶物特异性结合配体与固体支持物偶 联的技术挑战被更简单的可溶性分子制备所取代，使得有可能利用分析方法的全部储备 (arsenal)0亲和层析有许多类型的支持材料。珠的大小和均勻性、内部通道的分布和表面的性质均已经得到优化以产生多种类 型的支持物。—般而言，较小的颗粒大小和较大的孔隙率确保动力学结合容量升高。另一方面， 对机械崩塌的抗性降低。可压缩的和不能压缩的支持材料这两者都需要坚固(robust)得足以在不改变流 速(会影响停留时间)的情况下经受得住多个循环。
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固体支持物处于珠、凝胶或颗粒形式。在供传统亲和纯化用的柱中固体支持物材 料的填充质量和操作期间的流速大大地影响性能。使用专门的设备来成功填充直径5-lOcm以上的大柱。通常购买预填充的且处于 标准大小的高性能柱。随后，按比例扩大过程中的实际尺寸取决于可用于纯化特定靶分子 的柱系统。本发明提出了一种使用靶DAP分子和通用柱的一般方法。决定大规模纯化的成本和质量的最重要因素之一是吸附剂的化学和机械稳定性。用固定的蛋白质配体进行的传统亲和柱由于例如氧化或微生物生长而对进一步 降解易感。因此，由于大亲和柱的成本，已经非常注意控制各次使用之间的贮存条件。常常用 含有抗微生物剂、醇或类似物的特殊缓冲溶液来清洗和贮存该柱。这些贮存溶液必须在使 用前洗掉。一些亲和配体还对蛋白酶敏感，并且该柱寿命会降低，除非严格地遵循特殊的清 洗和再生方法。因此，设计有效亲和纯化方法的自由略受限制。依照本发明的单次使用柱系统或使用合成配体的柱系统不会具有上述技术限制。在本发明的一个实施方案中，固体支持物处于固相基质的形式。固相基质可以包 含(作为基质骨架)本身已知在蛋白质和其它生物分子的固相分离中可应用的任何天然 的或合成的和有机的或无机的材料，例如天然的或合成的多糖诸如琼脂-琼脂和琼脂糖； 纤维素、纤维素醚诸如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素；淀粉；树胶诸如瓜尔豆胶、和阿拉伯 胶、印度胶、西黄蓍胶、刺槐豆胶、黄原酸胶；果胶；粘蛋白；右旋糖苷；壳多糖(chitin)；壳 聚糖(chitosan)；褐藻酸盐；角叉菜胶；肝素；明胶；合成的聚合物诸如聚酰胺诸如聚丙烯 酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亚胺；聚酯；聚醚；聚合乙烯基化合物诸如聚乙烯醇和聚苯乙 烯；聚烯烃；无机材料诸如含硅材料诸如二氧化硅，包括无定形硅和石英；二氧化硅；金属 硅酸盐、可控多孔玻璃(controlled pore glass)和陶瓷；金属氧化物和硫化物，或这些天 然的或合成的和有机的或无机的材料的组合。优选地，基质骨架选自琼脂-琼脂、琼脂糖、纤维素、纤维素醚诸如羟丙基纤维素、 羧甲基纤维素、聚酰胺诸如聚(甲)丙烯酰胺、聚乙烯醇、二氧化硅、和可控多孔玻璃。作为基质骨架特别感兴趣的固相材料是例如琼脂或琼脂糖珠诸如来自GE Healthcare, USA 的 S印harose 和 Superose 珠和来自 Biorad, USA 的 Biogel A ；基于右旋 糖苷的珠诸如S印hadex，GE Healthcare ；基于纤维素的珠和膜诸如来自Iontosorb，Czech Republic 的 Perloza 纤维素；复合珠诸如 Sephacryl 禾口 Superdex，GE Healthcare, USA ； 合成有机聚合物的珠诸如来自TosohLifesciences LLC, USA的Fractogel ；来自Applied Biosystems, USA 的 POROS 介质、来自 Biorad 的 Bio-Rex、Bio—Gel P 禾口 Macro Pr印、来 自 TESSEK 的 HEMA 和 S印aron 和来自 Pall Corporation, USA 的 Hyper D 和 Trisacryl 介质、Enzacryl和二氢噁唑酮(Azlactone)，3M，USA ；含硅材料诸如可控多孔玻璃、来自 Millipore, USA 的 PROSEP 和 Spherocil，Pall Corporation, USA 的珠；和珠或膜形式的 涂覆的二氧化硅复合物诸如来自Arbor Technologies, USA的CycloS印、ACT I-DISK ^P ACTI-MOD。然后将配体(例如生物素或低分子量(LMW)的类似的特定分子)共价附着至此材料。配体分子与固体支持物的数种偶联化学可以选自关于该主题的教科书(Protein Purifuication，1998，第 2 片反 Janson, J-C.，Ryden, L，Wiley & sonsinc. New York)。基于 特定的纯化任务，将配体衍生物的最佳候选物与固体支持物(例如固相基质或颗粒)的最 佳选择偶联。经由实际的实验室测试和中试(pilot testing)来分析亲和固体基质的生成 过程性质。可以通过本身已知对于此目的可应用的任何类型的共价键来将配体附着至固相 材料，其或是通过配体与固相材料之间的直接化学反应或是通过用本身已知的合适试剂 对固相材料或配体进行在先的活化，使得有可能连接基质骨架与配体来实现。此类合适的 活化试剂的例子是环氧氯丙烷、环氧溴丙烷(印ibromohydrin)、烯丙基缩水甘油醚；二环 氧化物诸如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂肪族化合物诸如二氯丙醇、二乙烯砜；羰 基二咪唑；醛诸如戊二醛；醌；溴化氰；高碘酸盐诸如偏高碘酸钠；碳二亚胺；氯三嗪诸如 氰尿酰氯；磺酰氯诸如甲苯磺酰氯和三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride) ；N-羟基琥珀 酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐飕唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰 胼。这些之中，优选留下与单键不同的间隔基团SPl的活化试剂，例如环氧氯丙烷、环氧溴 丙烷、烯丙基缩水甘油醚；二环氧化物；卤素取代的脂肪族化合物；二乙烯砜；醛；醌；溴化 氰；氯三嗪；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰胼。在一个实施方案中，固体支持物处于颗粒形式。颗粒可以选自下组微球、乳胶颗 粒或珠。颗粒可以由下组制成，但不限于下组例如聚苯乙烯、二氧化硅、萘(naphtaleen)、 聚甲基丙烯酸丁酯。通用固体支持物可以以与离子交换基质相当的成本产生，而重组双亲和性蛋白质 也可以作为重组融合蛋白通过发酵低成本产生。由于新型下游方法材料的成本降低，纯化 技术可以作为一次性用具(disposable)提供，其消除对昂贵的就地清洗(CIP)和某些确认 的需要。成本降低的另一种结果是任选的大柱体积应用，其节约制造劳力费用、阻止重复的 纯化再运行并限制下游加工厂(downstream process plant)的时间占有。包括捕捉配体的通用固体支持物的使用和由于溶液中的复合物形成引起的结合 效率和容量的潜在改善形成了超过常规亲和层析的数个优点。下面列出这些优点。 在亲和纯化靶分子前没有用于制备亲和柱材料的费时且昂贵的蛋白质配体化学 缀合反应、纯化和QC步骤。·与本商业亲和基质(例如蛋白A)相比，通用基质对于加工是更加成本有效的。 使用双亲和性多肽原则的所有亲和纯化仅需要一类捕捉柱材料。通过简单的低成本缀合方 法将低分子量配体(例如生物素、染料分子或类似的特异性低分子量(LMW)分子)共价附 着以生成通用固相基质。·双亲和性多肽融合蛋白的优选发酵是“简单的”，其基于已知的技术，而且提供 DAP中各结合域之间需要的缀合。· DAP分子的制备成本与重组蛋白A分子相当或者比重组蛋白A分子便宜。·纯化目的所需要的DAP融合蛋白和通用基质花费出于类似目的消耗即用的蛋白 A亲和基质的一部分。· DAP在纯化过程期间将靶分子运输并固定于通用基质。这不需要如常规亲和层 析中所知的昂贵且费时的专用配体的固定化来制备特异性纯化基质。
·所呈现发明中的成分的低成本促成一次性亲和纯化方法，其特征为ο消除CIP步骤ο消除确认步骤ο节约在调节问题上的时间ο排除下游方法循环的重复ο限制操作失败ο降低加工过程中的劳力费用ο缩短制备运行时间ο限制污染风险ο容易使用ο由于灵活性工厂设计而降低能力成本投资ο更好的下游方法经济 将常规的多轮蛋白质分离方法替换成使用一次性亲和纯化技术的单一步骤。在本发明的一个具体的改良形式中，可以预见DAP分子能共价结合固体支持物。 这仍会容许使DAP与靶物在溶液中起反应的可能性。在一个实施方法中，通过切割对位取 代的苄基鸟嘌呤，产生硫醚键来形成此类共价键。因此，本发明的这种改良形式的一个实施方案涉及一种用于纯化靶生物分子的方 法，包括下列步骤(a)使⑴靶多肽、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体的固体支 持物接触，其中所述双亲和性多肽在标准条件下具有范围为10_2至10_13M，更特别为10_4至 IO-13M的针对所述靶生物分子的平衡解离常数KD,t，且其中所述双亲和性多肽对所述固体支 持物上的所述捕捉配体的结合是通过切割对位取代的苄基鸟嘌呤产生硫醚键而提供的；并 (b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。下文例示用于纯化靶分子(多克隆抗体)的亲和纯化技术的基本原理。 实施例实施例1 通过化学綴合来制备双亲和性接头基于发表的结合亲和力数值，选择同时适合于结合配体基质(KD,3约10_9至I(T16M) 和结合靶生物分子(产物，KD, t约10_2至I(T13M)的双接头结合功能性。为了调查KD,s的影 响，还测试一些具有上述区间外的KD,s值的成分。为了制备由蛋白A和生物素结合蛋白(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或 中性抗生物素蛋白)制成的缀合物，分别化学活化所述两种蛋白质作为第一步，然后在之 后第二步中通过交联连接在一起。蛋白A在表面上没有可接近的巯基(-SH)，所以通过SATA(N-琥珀酰亚氨基S-乙 酰基硫代乙酸盐)与蛋白A上的伯胺(-NH2)官能团的反应来引入这些。SATA(或SATP)是 一种用于将受保护的巯基引入蛋白质、肽和其它分子中的试剂。它们是S-乙酰基硫代乙酸 和丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。自NHS酯与伯胺的反应形成稳定的、共价的酰胺键。 通过亲核攻击使胺与NHS酯起反应，其中N-羟基琥珀酰亚胺作为副产物释放。使用盐酸羟 胺来实现脱保护(脱酰作用)以生成交联和其它应用中使用的巯基。使用Sulfo-SMCC将马来酰亚胺基团引入抗生物素蛋白。Sulfo-SMCC是一种含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和马来酰亚胺基团的异双功能交联剂。NHS酯在pH 7_9与伯 胺反应以形成共价的酰胺键。常常在两步反应方案中使用SMCC和Sulfo-SMCC来制备蛋白 质-蛋白质缀合物。首先，将含有胺的蛋白质与数倍摩尔过量的交联剂反应，接着通过脱盐 或透析除去过量(未反应的)试剂；最后，添加含有巯基的分子来与已经附着至第一蛋白质 的马来酰亚胺基团反应。如下获得通过交联制备的缀合物，即使马来酰亚胺与巯基基团在pH6. 5-7. 5反应 以形成稳定的硫醚键。上述方法的备选是使用商品化Mal imi de活化的中性抗生物素蛋白替换活化 的抗生物素蛋白。马来酰亚胺活化的中性抗生物素蛋白 蛋白(Maleimide Activated NeutraAvidin Protein)用于直接制备中性抗生物素蛋白 蛋白(NeutraAvidin Protein)) (NAP)与含有游离巯基(-SH)基团的蛋白质、肽和其它分子的缀合物。诵邀- 咯双麵十牛碰(DAP)用于将蛋白A和抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白化学交联成缀合物的方法，所 述缀合物具有DAP接头这种要求的特性。材料SATA (N-琥珀酰亚氨基S-乙酰基硫代乙酸盐)，(Pierce，No. 26102)D-Salt Excellulose 脱盐柱，5ml (Pierce No. 20449)盐酸羟胺(Pierce，No.26103)，DMSO (二甲亚砜，Pierce，No. 20688), Sulfo-SMCC (磺基琥珀酰亚氨基4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)(Pierce，22322)，蛋白 A (GE Health Care，17-0872-50)，抗生物素蛋白(Kem-En-Tec，4020H)，马来酰亚胺活化的 中性抗生物素蛋白(Pierce，No. 31007)，PD-IOSephadex G_25M(GE ； 17-0851-01)，HiPrep 26/60S印hacryl S-100HR (MW 范围 1. 000-100. 000) (GE，17-1194-01)抗 IgG 亲和体(Affibody，10. 0623. 01. 0050)二硫苏糖醇([3483-12-3]，Sigma-Aldrich D0632)。缓冲液PBS 反应缓冲液:200-500ml PBS 0. IM 磷酸盐，0. 15M NaCl，pH 7. 2脱乙酰基溶液=PBS中的0. 5M羟胺，25mM EDTA, pH 7. 2PBS-EDTA 溶液:200_500ml PBS 0. IM 磷酸盐、0. 15M NaCl、5mM EDTA, ρΗ7· 2。磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7. 2 ；或其它添加EDTA至l_5mM的不含胺和巯基 (amine-and sulfhydrylfree)缓冲液(pH6. 5-7. 5)帮助螯合二价金属，由此降低含有巯基 的蛋白质中的二硫化物形成。用于对蛋白A进行巯基修饰的方法A.蛋白A与SATA(或SATP)的反应反应前立即将6. 4mg SATA在0. 5ml DMSO中溶解(产生约55mM溶液)。然后将1. Oml蛋白A溶液(2，6mg/mL)与10 μ 1 SATA溶液组合。将内容物混合，
并于室温温育30分钟。可以通过使用SATA与蛋白质的不同摩尔比率来改变巯基并入的水平。缺省反应 使用60nmol蛋白A和550nmol SATA,即SATA与蛋白质的摩尔比率为9:1。可以通过每 ml蛋白质溶液添加比10 μ 1更多或更少的SATA溶液来提高或降低反应中的SATA量。
B.脱盐以从过量的试剂和副产物纯化酰化的蛋白A用2个柱体积的反应缓冲液平衡脱盐柱。对每Iml要处理的反应体积使用至少 5ml脱盐柱。将1. Olml反应混合物应用至该柱。立即开始Iml级分的收集。在反应混合物已 经完全进入柱床并收集第一级分后，将至少IOmL反应缓冲液添加至该柱，并作为多个单独 的Iml级分随着它们自柱排出继续收集。含有蛋白A的级分被鉴定为在280nm具有峰吸光度的级分。用5ml脱盐柱，级分 2和3含有大部分蛋白质，而过量SATA在后面的级分中出来。合并含有经修饰的蛋白A的 级分。可以不定期地贮存经修饰的蛋白A，用于后面的脱乙酰和生成巯基基团(部分C)。C. #经SATA修饰的蛋白A脱乙酰以牛成巯某某闭将1. Oml经SATA修饰的(乙酰化的)蛋白A与100 μ 1脱乙酰溶液组合。将内容 物混合，并于室温温育2小时。使用脱盐柱来从脱乙酰溶液中的羟胺纯化经巯基修饰的蛋白质。使用与在部分B中相同的方法完成脱盐，进入含有IOmM EDTA的反应缓冲液中以 使二硫键形成最小化。合并含有经修饰的蛋白A的级分。蛋白质浓度应当为约1.3mg/ml。 为了使二硫化物形成最小化，立即实施部分D。脱盐之前或之后，可以使用Ellman氏试剂(PierCe，No 23460 (用于巯基基团检测 的试剂盒))来测定蛋白质的巯基含量。P.经SATA修饰的蛋白A与马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白 的綴合。此方法使用与抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白约等摩尔量的活化蛋白A。实施例Ia 用于对抗生物素蛋白进行马来酰亚胺修饰和制备DAP分子[蛋白A-抗 生物素蛋白]的方法一般而言，超过含有胺的蛋白质的量10至50倍摩尔过量的交联剂导致足以使数 种含有巯基的蛋白质能够与每种含有胺的蛋白质缀合的马来酰亚胺活化。较稀的蛋白质溶液需要较大倍数摩尔过量的试剂来达到相同活化水平。经验测试 对于为预期应用确定最佳活化水平和最终缀合比率是必要的。为了最好的结果，确保如上文所描述的那样制备蛋白A-SH，并准备好在步骤5中 与马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白组合。在5mL PBS缓冲液中制备32mg抗生物素蛋白，并在ImL PBS/EDTA缓冲液中制备 4.36mg磺基-SMCC。然后将500 μ L活化溶液转移至抗生物素蛋白溶液。于室温温育混合 物30分钟。使用用PBS-EDTA缓冲液平衡的脱盐柱除去过量的交联剂。将蛋白A-SH与脱盐的马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白组合，并以对应于约1 1 的摩尔比率混合。将反应混合物于室温温育过夜。一般而言，容许反应进行数小时或过夜没有害处，虽然通常反应会在约30分钟中 完成。为了在完成前停止缀合反应，添加含有如下浓度的还原性半胱氨酸的缓冲液，所述浓 度比蛋白A-SH的巯基高数倍。
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实施例lb =DAP分子[蛋白A-中性抗生物素蛋白]的制备为了最好的结果，确保如上文所描述的那样制备蛋白A-SH，并准备好与马来酰亚 胺活化的抗生物素蛋白组合。马来酰亚胺活化的中性抗生物素蛋白(Pierce，No 31007)是商品化的，用于直接 制备中性抗生物素蛋白 蛋白(NAP)与含有游离巯基(-SH)基团的蛋白质、肽、和其它分子 的缀合物。中性抗生物素蛋白""蛋白是一种具有数种关键特征的经修饰抗生物素蛋白衍生 物，所述数种关键特征给生物素结合蛋白提供格外低的非特异性结合特性。中性抗生物素 蛋白""蛋白不含碳水化合物，使凝集素结合活性变成不可检出的水平。另外，NAP的等电点 是6. 3士0. 3，其比天然抗生物素蛋白低得多，且不像抗生物素蛋白那样酸。添加1. OmL超纯水以悬浮5mg冻干的中性抗生物素蛋白。将蛋白A-SH和马来酰亚胺活化的中性抗生物素蛋白组合，并以对应于1 1的摩 尔比率混合。将反应混合物于室温温育过夜。一般而言，容许反应进行数小时或过夜没有害处，虽然通常反应会在规定时间中 完成。为了在完成前停止缀合反应，添加含有如下浓度的还原性半胱氨酸的缓冲液，所述浓 度比蛋白A-SH的巯基高数倍。实施例Ic :DAP分子[亲和体(IgG)-抗生物素蛋白]的制备用磺基-SMCC活化抗生物素蛋白(IOmg)，如实施例Ia中所描述的。将抗IgG亲和体二硫化物二聚物还原成单体将抗IgG亲和体(5mg)在PBS缓冲液(5mL)中溶解，并将3. SmL此溶液转移至含 有12. 3mg 二硫苏糖醇(DTT)的小瓶，给出DTT终浓度为20mM的溶液。于RT将此混合物翻 转2小时。接着，如下除去过量的DTT，即将反应混合物分成两部分，使每部分流过PD-10柱 (床体积8mL)。该柱在使用前已经用25mL PBS缓冲液平衡。在2X9_10个级分(各含有 ImL)中从该柱洗脱单体抗-IgG亲和体。通过测量级分的A·，蛋白质位于来自每个柱的2个级分中。将这些级分合并，并与脱盐的马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白溶液(20mL)以对 应于约1 1的摩尔比率(抗生物素蛋白以单体计算；MW= 17.000)混合，并容许偶联于 室温在温和翻转偶联混合物的情况中进行过夜。次日，在Amicon Ultra(截留3kDa)中将1500 μ L的缀合混合物浓缩至总体积 400 μ L，将其用于通过SDS PAGE进行分析。这显示所有抗生物素蛋白都已反应，而且仍有 一些未反应的抗IgG亲和体存在。冷冻缀合混合物，直至通过SEC进行纯化。可以使用上述方案来制备亲和体_抗生物素蛋白双亲和性多肽的所有衍生物。实施例ld:DAP分子[亲和体(胰岛素)_抗生物素蛋白]的制备用磺基-SMCC活化抗生物素蛋白(9mg)，如实施例Ia中所描述的。将抗胰岛素亲和体(His6-Z0008IO-Cys ；PB00014) 二硫化物二聚物还原成单体，如 实施例Ic中所描述的。
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将来自PD-10柱的合并级分与脱盐的马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白溶液 (16. ImL)以对应于约1 1的摩尔比率混合，并容许偶联于室温在温和翻转偶联混合物的 情况中过夜进行。次日，通过SDS PAGE分析缀合混合物。这显示所有抗生物素蛋白都已反应，而且 仍有一些未反应的抗胰岛素亲和体存在。冷冻缀合混合物，直至通过SEC进行纯化。实施例Ie :DAP分子[亲和体(胰岛素)_抗生物素蛋白]的制备用磺基-SMCC活化抗生物素蛋白(9mg)，如实施例Ia中所描述的。将抗胰岛素亲和体(胰岛素，His6-ZOl 139-Cys ；PB00022) 二硫化物二聚物还原成 单体，如实施例3c中所描述的。将来自PD-10柱的合并级分与脱盐的马来酰亚胺活化的抗生物素蛋白溶液 (16. ImL)以对应于约1 1的摩尔比率混合，并容许偶联于室温在温和翻转偶联混合物的 情况中过夜进行。次日，通过SDS PAGE分析缀合混合物。这显示所有抗生物素蛋白都已反应，而且 仍有一些未反应的抗胰岛素亲和体存在。冷冻缀合混合物，直至通过SEC进行纯化。種· 2 用輔f ΜΦ表汰白_目双麵馳雜。菌株米曲霉BECh2在WO 00/39322，实施例1中进行描述，其也指W098/12300，实施例 1中所描述的JaL228。JaLl 168在实施例2g中进行描述。JaL1171在实施例2g中进行描述。JaLl 174在实施例2g中进行描述。JaLl 176在实施例2g中进行描述。JaL1181在实施例2g中进行描述。JaL1210在实施例2g中进行描述。MT173 是 MC1000 的一种衍生物(Casadaban 禾口 Cohen J. Mol. Biol. 138(1980) 179-207)，其为 ara+禾口 leuB6。基因AMG 指黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Boel 等 EMBO Journal 3(1984) 1581-1585)Z 指来自金黄色葡萄球菌蛋白A的Z结构域(Nilsson等ProteinEngineering 1(1987)107-113)ο前CBDtal5)指大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)内切葡聚糖酶 IKDSM971)信号(前)+纤维素结合域(CBD) +接头区。CBD(egv)指特异腐质霉内切葡聚糖酶V(DSM1800)接头区+纤维素结合域。VhhRR6 (2)指来自针对半抗原偶氮染料活性红(RR6)起反应的美洲驼单链抗体 的可变区(Frenken 等 J. Biotechnology 78(2000) 11-21。JIMp775 在 EP 238023 中进行描述。
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pA2C315以保藏号DSM971保藏于DSM。该质粒含有编码内切葡聚糖酶II基因的 来自大型亚灰树花菌的cDNA克隆。pCAMG91 记载于 Boel 等 EMBO Journal 3 (1984)，1581-1585。pJaL790 在 W02005070962，实施例 1 中进行描述。pJaLl 153在实施例2c中进行描述。pJaL1154在实施例2a中进行描述。pJaLl 158在实施例2d中进行描述。pJaLl 159在实施例2a中进行描述。pJaLl 164在实施例2c中进行描述。pJaLl 165在实施例2d中进行描述。pJaLl 168在实施例2e中进行描述。pJaLl 169在实施例2b中进行描述。pJaLl 170在实施例2f中进行描述。pJaL1171在实施例2b中进行描述。pMT2786 在 W02006050737，实施例 2 中进行描述。pSX320 在 EP 0 531 372 中进行描述。引物和DNA序列合成的DNA 1(SEQ ID NO 1)合成的DNA 2 (SEQ ID NO 4)衔接头序列1 (SEQ ID NO 5)衔接头序列2 (SEQ ID NO 6)引物 8683(SEQ ID NO 10)引物 CBD Z-NA (SEQ ID NO 11)引物 Z-NA(SEQ ID NO 12)引物 Z-CA(SEQ ID NO 13)引物 Z-CA CBD (SEQ ID NO 14)引物 8654(SEQ ID NO 15)引物 CBD Z-NB (SEQ ID NO 19)引物 Z-NB (SEQ ID NO 20)引物 Z_CB(SEQ ID NO 21)引物 Z-NB CBD (SEQ ID NO 22)Jj^PCR、克隆、连接核苷酸等的一般方法对于本领域技术人员是公知的，并且可 以例如参 JAL"Molecular cloning :A laboratory manual，，，Sambrook 等(1989)，Cold SpringHarbor lab. , Cold Spring Harbor, NY ；Ausubel, F. Μ.等(编)；"Current protocols in Molecular Biology，，，John Wiley and Sons, (1995) ；Harwood, C. R., and Cutting, S. M.(编)；"DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes I and II”， D.N. Glover 编(1985) ；"Oligonucleotide Synthesis”，Μ· J. Gait 编(1984) ；"Nucleic Acid Hybridization", B. D. Hames & S. J. Higgins eds(1985) ；"A Practical Guide ToMolecular Cloning", B.Perbal, (1984)。PCR 扩增在含有2. 5个单位的Taq聚合酶、IOOng pS02、250nM每种dNTP、和IOpmol上文所 述两种引物中每一种的100微升体积中在50mM KClUOmM Tris-HClpH 8. 0、1.5mM MgCl2W 反应缓冲液中实施所有PCR扩增。在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中实施扩增，并且扩增的组成为3分钟 于94°C的一个循环，接着是1分钟于94°C，30秒于55°C，和1分钟于72°C的25个循环。曲霉转化如Christensen 等；Biotechnology 1988 6 1419-1422 所描述的那样完成曲霉转 化。简言之，在丰富营养肉汤中培养米曲霉菌丝体。通过过滤分开菌丝体与培养液。将酶 制剂Novozyme (Novo Nordisk)添加至渗透稳定化缓冲液(诸如用磷酸钠缓冲至pH 5.0 的1. 2M MgSO4)中的菌丝体。将悬浮液于37°C在搅拌条件下温育60分钟。将原生质体过滤 通过Mira-Cloth以除去菌丝体碎片。收获原生质体，并用STC(1. 2M山梨糖醇，IOmM CaCl2, IOmM Tris-HCl pH 7.5)清洗两次。最后，将原生质体在200-1000微升STC中重悬。为了转化，将5微克DNA添加至100微升原生质体悬液，然后添加200微升PEG溶 液(60% PEG 4000, IOmM CaCl2, IOmM Tris-HCl pH 7. 5)，并将混合物于室温温育 20 分钟。 收获原生质体，并用1. 2M山梨糖醇清洗两次。最后，将原生质体在200微升1.2M山梨糖醇 中重悬。在含有1. OM蔗糖作为碳源、IOmM硝酸钠作为氮源的基本平板上对含有完整niaD 基因的转化体选择其使用硝酸盐作为唯一氮源的能力(Cove D.J. 1966. Biochem. Biophys. Acta. 113 51-56)。于37°C生长4_5天后，稳定的转化体作为正在有力生长并形成孢子的 菌落出现。经由分生孢子将转化体纯化两次。培养基和试剂YPM培养基(2g/l酵母提取物，2g/l蛋白胨，和2%麦芽糖)曲霉转化体的生长用来自各转化体的孢子接种含有10ml YPM培养基的摇瓶，并于30°C，以200rpm温
育4天。SDS-PAGE所使用的SDS凝胶是来自BIO-RAD的Criterion XT预制凝胶(10% Bis-Tris)， 将其运行，并用考马斯蓝染色，如制造厂所推荐的。实施例2a曲霉表达盒 p.TaLl 159 (前 CBD(C315)-KR: :VhhRR6(R2) :Z: :Z)的构建质粒pJaL1154含有pUC19中编码融合蛋白的合成DNA SEQ ID NO 1，所述融合蛋 白由下列各项组成来自C315的信号+纤维素结合域+接头、氨基酸KR、针对活性染料RR6 生成的美洲驼单链抗体的可变区、和来自蛋白A的Z结构域的重复(前CBDfc3is-KR: VhhRR 6(R2) :Z: :Z)。构建表达载体pJaL1159，用于转录融合蛋白前 CBDfc315)-KR: :VhhRR6 (R2) :Z: :Z(S EQ ID NO 2)。用BamHI-XhoI消化含有融合蛋白的质粒pJaLl 154。将966bp片段进行凝胶 纯化，并连接入用BamHI-XhoI消化的曲霉表达盒pMT2786 (6936bp片段)中。使用酿酒酵母 Leu2基因作为选择标志将连接混合物转化入大肠杆菌MT173中来创建表达质粒pJaLl 159。
28使用 QIApi^p Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指令来回收所 扩增的质粒。质粒PMT2786包含基于与构巢曲霉磷酸丙糖异构酶非翻译前导序列融合的黑曲 霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶终止子(AMG终止子) 的表达盒，在作为氮源的乙酰胺上实现生长的来自构巢曲霉的选择标志amdS和具有供大 肠杆菌中选择用的酿酒酵母Leu2基因。实施例2b曲霉表汰盒p.TaLl 171 前 CBDtol5)-KR: :VhhRR6 (R2) :Z 的构津。为了构建融合蛋白前CBD(C315)-KR: :VhhRR6(R2) :Z(SEQ ID NO 3)，用 BglII 消化 质粒pJaL1154，将3472bp片段进行凝胶纯化，并与其自身连接，产生pJaL1169。将来自 PJaLl 169的795bp BamHI-XhoI片段纯化，并连接入用BamHI和XhoI消化的曲霉表达盒 pMT2780(6936bp片段)中。使用酿酒酵母Leu2基因作为选择标志将连接混合物转化入大 肠杆菌 MT173 中来创建表达质粒 pJaL1171。使用 QIApi^p Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指令来回收所扩增的质粒。实施例2c曲霉表汰盒p.TaLl 164AMG(1_526aa) :Z: :Z 的构津质粒pJaLl 153含有pUC19中编码融合蛋白的合成DNA SEQ ID NO 4，所述融合蛋 白由下列各项组成编码氨基酸488-526的黑曲霉AMG DNA和来自蛋白A的Z结构域的重
复(AMG(488_526aa) Z Ζ)。质粒pToClOO含有受来自p775的TAKA启动子调节的黑曲霉AMG(Boel等EMBO Journal 3 (1984)，1581-1585)，并且同时在AMG起始密码子前面引入BamHI位点。通过将 下列片段连接在一起来构建pToClOO 来自p775的4306bp BamHI-NcoI片段、接头SEQ ID NO 5 和 SEQ ID N0. :6、来自 pCAMG91 的 860bp BssHII-Pstl 和来自 pCAMG91 的 1410bp PstI-NcoI 片段。构建表达载体pJaLl 164，用于转录融合蛋白AMG(1_526aa) ::Z: :Z(SEQ IDNO 7)。分别 从质粒 pToClOO 和 pJaL1153 凝胶纯化 1723bp BamHI-DraIII 片段和 458bp DraIII-XhoI 片 段，并连接入用BamHI-XhoI消化的曲霉表达盒pMT2786(6936bp片段)中。使用酿酒酵母 Leu2基因作为选择标志将连接混合物转化入大肠杆菌MT173中来创建表达质粒pJaLl 164。 使用 QIApi^p Spin MiniprepKit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指令来回收所 扩增的质粒。实施例2d曲霉表达盒p.TaLl 165AMG(1_526aa) :Z 的构建为了构建编码融合蛋白AMGa_526aa)::Z(SEQ ID NO 8)的表达质粒，用BglII消化质 粒PJaLl 153，将2969bp片段进行凝胶纯化，并与自身连接，产生ρJaLl 158。将来自pToClOO 的1723bp BamHI-DraIII片段和来自pJaL1158的287bp片段进行纯化，并连接入用BamHI 和XohoI消化的曲霉表达盒pMT2786 (6936bp片段)中。使用酿酒酵母Leu2基因作为选择 标志将连接混合物转化入大肠杆菌MT173中来创建表达质粒pJaL1165。使用QIApr印 Spin MiniprepKit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指令来回收所扩增的质粒。实施例2e
曲霉表汰盒0似11168前〔80(。315)::2::Z: =CBD^1 的构津如下通过扩增来完成编码融合蛋白前CBD(C315)::Z::Z::CBD(ect)(SEQID NO 9) 的表达质粒pJaL1168的构建，即1)使用pA2C315作为模板和引物对8683/CBD =Z-NA(SEQ ID NO 10和11)进行的前CBDfc315)区的PCR，2)使用pJaL1153作为模板和引物对Z-NA/ Z-CA(SEQ ID NO 12和13)进行的Z: Z区的PCR和3)使用pSX320作为模板和引物对Z-CA CBD/8654 (SEQ ID NO 14 和 15)的 CBDteev)区的 PCR，分别产生 337bp、382bp 和 344bp 的 3 种DNA片段。将3种片段混合，并作为模板用于通过用引物对8653/8654进行的PCR来扩 增983bp片段。用BamHI-HindIII消化PCR片段，将798bp片段进行纯化，并将克隆连接入 用BamHI-HindIII消化的曲霉表达盒pJaL790(7386bp片段)中。使用酿酒酵母Ura3基 因作为选择标志将连接混合物转化入大肠杆菌DB6507中来创建表达质粒pJaL1168。使用 QIApr印⑧Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指令来回收所扩增 的质粒。质粒pJaL790包含基于与构巢曲霉磷酸丙糖异构酶非翻译前导序列融合的黑曲 霉中性淀粉酶II启动子(Na2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子) 的表达盒，在作为氮源的乙酰胺上实现生长的来自米曲霉的选择标志amdS。实施例2f曲霉表汰盒DTaLl 170 前 CBD(C315)_KR: :Z: :Z: :CBD(C315): :CBD(FGV)的构津质粒pJaL802是一种建立在pJaL790上的曲霉表达质粒，所述pJaL790含有编码 融合蛋白前 CBDtal5) CBD(ECT) (SEQ ID NO 17)的 DNA (SEQ ID N016)。如下通过扩增来完成编码融合蛋白前CBD (C315)-KR: :Z::Z: CBDfc315) CBD (ECT) (SEQ ID NO 18)的表达质粒pJaL1170的构建，即1)使用pA2C315作为模板和引物对8683/CBD Z-NB (SEQ ID NOlO和19)进行的前CBDtal5)-KR区的PCR，2)使用pJaL1153作为模板和引物 对Z-NB/Z-CB (SEQ ID NO 20和21)进行的Ζ: :Z区的PCR和3)使用pJaL802作为模板和 引物对 Z-CB:CBD/8654 (SEQ ID NO 22 和 15)的 CBD(C315)-CBD(ECT)区的 PCR，分别产生 343bp、 382bp和443bp的3种DNA片段。将3种片段混合，并作为模板用于通过用引物对8653/8654 进行的PCR来扩增1088bp片段。用BamHI-HindIII消化PCR片段，将894bp片段进行纯 化，并将克隆连接入用BamHI-HindIII消化的曲霉表达盒pJaL790(7386bp片段)中。使用 酿酒酵母Ura3基因作为选择标志将连接混合物转化入大肠杆菌DB6507中来创建表达质粒 pJaL1170。使用 QIApr 印 Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依照制造商的指 令来回收所扩增的质粒。实施例2gDAP在米曲霉菌株中的表达如方法部分中所描述的那样用表达质粒pJaLl 159、ρJaLl 164, pJaL1165、 pJaL1168、pJaL1170 和 pJaL1171 转化米曲霉菌株 BECh2。用来自所产生转化体的孢子和宿主BECh2接种含有IOml YPM培养基(2g/l酵 母提取物，2g/l蛋白胨，和2%麦芽糖)的摇瓶，并于30°C在摇动(200rpm)条件下温育4 天。在 SDS-PAGE 上分析上清液(10 μ 1) 从各种质粒 pJaL1159、pJaL1164、pJaL1165、 pJaL1168、pJaL1170和pJaL1171生成想要的蛋白质的转化体分别称作JaL1210、JaL1168、 JaLl 171、JaLl 174、JaLl 176和JaLl 181。通过SDS-PAGE来确认来自每种转化体的预期大小的产物。SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27 和 SEQ ID N028 中分别显示了 JaL1210 (VhhRR6 (R2) :Z: :Z)、JaL1168 (AMG(1_526aa) :Z: :Z)、 JaLll71 (AMG(1_526aa): :Z)、JaLll74 (CBD(C315): :Z: :Z: :CBD(egv))、JaLl 176 (Z: :Z: :CBDfc315)::CBD (egv))和JaL1181(VhhRR6(R2)::Z)中生成的每种构建体的氨基酸序列。種· 3 翻双麵剛聿赫地龙荆包白腫汰。培养基LB琼脂、TY Buillon培养基和BPX摇瓶培养基都已经在专利公开文本WO 94/14968中描述过。CAL 18-2 培养基(11)酵母提取物(#0127-17-9 Difco Laboratories, MI, USA)40g ；硫酸镁(#5886 Merck, Darmstadt,德国)1. 3g ；Glucidex 12 (RoquetteFeres, 法国)50g;磷酸二氢钠(#6346 Merck，Darmstadt，德国)20g;EDF-痕量金属(配方参 见下文)6. 7ml ;Na2Mo04-痕量金属(配方参见下文)6. 7ml ;Pluronic PE6100 (BASF，德 国)0. Iml ；用离子交换水调节至1000ml。混合所有，调节体积，测量pH，并使用NaOH将其 调节至PH 6.0。通过于121°C高压灭菌20分钟为培养基灭菌。EDF-痕量金属(11)硫酸 猛(II) (#5963 Merck, Darmstadt，德国)4· 48g ；氯化铁(III) (#3943 Merck, Darmstadt, 德国)3· 33g ；硫酸铜(II) (#2790 Merck, Darmstadt，德国)0· 625g ；硫酸锌(#8883 erck, Darmstadt，德国)7. 12g ；用离子交换水调节至1000ml。混合所有，调节体积。将溶液过滤 灭菌，并于 4°C保持。Na2MoO4-痕量金属(11)钼酸钠(#6521Merck，Darmstadt，德国)2. Og ； 用离子交换水调节至1000ml。混合所有，调节体积。将溶液过滤灭菌，并于4°C保持。菌株和供体生物体枯草芽孢杆菌PL1801。此菌株是具有破坏的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌 DN1885(Diderichsen, B. , Wedsted, U. , Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, anexoenzyme from i Bacillus brevis. J. Bacteriol.，172，4315—4321)。枯草芽孢杆菌PP289-5。此菌株是US5843720中所描述的用于向地衣芽孢杆菌结 合质粒的供体菌株。专利W02005/123915中所描述的地衣芽孢杆菌MDT223基因Z 指来自金黄色葡萄球菌蛋白A的Z结构域(Nilsson等ProteinEngineering 1(1987) 107-113) ο Z基因是一种由引物装配的合成基因(SEQ IDNO 29)。链霉抗生物素蛋白基因指编码来自阿维丁链霉菌(Str印tomyces avidinii) 的链霉抗生物素蛋白的基因，如 Argarana(Argarana 等(1986)Nucleic AcidsRes. 14， 1871-1882)所描述的。编码链霉抗生物素蛋白的基因是一种合成基因(SEQ ID NO 30)。可以以下列文献所描述的多种方法通过PCR装配重叠的寡核苷酸来构建合成基 因例如 Stemmer 等，Gene 164，第 49 页-第 53 页，1995 ；Dillon 和 Rossen，BioTechniques 9,298-300,1990 ；Prodromou 禾口 Pearl，ProteinEngineering 5,827-829,1992 ；Chn 等， Journal of Amarican Chemical Society 11，8799-8800，1994等。此类基因也可以简单地 经由多个商业公司之一购买。质粒
pSJ6208是SEQ ID NO 31中所描述的一种大肠杆菌pUC衍生物。pSJ6321是一种具有红霉素标志基因的pE194衍生物。质粒还包含cryIIIA稳定 子序列、编码与蛋白酶融合的amyL的信号肽的DNA，接着有amyL的下游序列(SEQ ID NO 32)。pM0L2743在本实施例中进行描述(SEQ ID NO 33)pM0L2744在本实施例中进行描述(SEQ ID NO 34)pM0L2746b在本实施例中进行描述(SEQ ID NO 35){共地,衣芽袍力干菌表汰用本z::z ^m^mmmmmit通过引物SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 37来扩增编码Z: Z域的合成基因(SEQ ID NO 29)SEQ ID NO 36 TCATTCTGCAGCAGCGGCGGATAACAAATTTAACAAAGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAASEQ ID NO 37 AACTAAGCGGCCGCTAGCGACTACACTTTAGGAGCTTGCGCGTCATTAAGCT用PstI-EagI消化PCR片段，将368bp片段纯化，并连接入用PstI-EagI消化的大 肠杆菌pUC衍生质粒pSJ6208 (SEQ ID NO 31)中给出3389bp片段。将连接混合物转化入 大肠杆菌 SJ2 中(Diderichsen, B. , Wedsted, U. , Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , Sjoholm, C. (1990). Cloning of aldB, which encodes acetolactatedecarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis)。使用 QIApi^p SpinMinipr印 Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA)依 照制造商的指令来回收包含亚克隆的Z:: Z基因的质粒pM0L2743 (SEQ ID NO 33)。用HindIII消化编码链霉抗生物素蛋白的合成基因(SEQ ID NO 30)，给出 620bp的片段。用HindIII限制性处理质粒pM0L2743，并用碱性磷酸酶处理以避免再连 接(relegation)。将两种片段连接，并转化至大肠杆菌SJ2。对菌落筛选链霉抗生物素蛋 白基因的存在，并挑出如下克隆，其中链霉抗生物素蛋白基因以正确的取向插入，产生质粒 pM0L2744(SEQ ID NO 34)。在此质粒中，编码Ζ: :Z域和链霉抗生物素蛋白的基因是在翻译 上融合的。将编码τ·.·.τ·.·.链霉抗生物素蛋白的杂合基因转移至整合载体，其设计用于容许 淀粉酶表达盒整合入地衣芽孢杆菌菌株的染色体(其已经含有在amyL基因座上整合的 人工串联启动子)中，如W02005/123915的实施例6中所描述的。这是通过连接三种片 段实现的。第一片段是PstI-BglII限制性消化pM0L2744，产生931bp片段。第二片段是 BglII-BamHI限制性消化质粒pSJ6321 (SEQ ID NO 32)，分离4288bp片段。第三片段是 BamHI-PstI消化pSJ6321，分离1234bp片段。将三种片段连接，并通过转化入PL1801中来 导入，产生整合载体pM0L2746b(SEQ ID NO 35)。然后通过感受态、电穿孔或接合进入蛋白酶缺陷型地衣芽孢杆菌中来再转化此 pM0L2746b质粒，并使用已经插入的cryIIIA序列和amyl下游序列通过双同源整合插入至 amyL基因座处。所得的地衣芽孢杆菌菌株具有人工串联启动子和cryIIIA序列，其驱动从 amyL基因座表达Z::Z::链霉抗生物素蛋白。地衣芽孢杆菌宿主优选为蛋白酶缺陷型以容 许表达Z::Z::链霉抗生物素蛋白杂合蛋白。可以通过使用双同源重组的标准技术来缺失 下列蛋白酶mpr、aprE、nprE、vpr、bpr、epr、wprA 禾口 ispA。
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将具有编码Z::Z::链霉抗生物素蛋白杂合DAP蛋白的表达盒的蛋白酶缺陷型地 衣芽孢杆菌宿主在具有上文所述CAL18-2培养基的IOOml摇瓶中于30°C，300rpm发酵2天。 在第1天和第2天取出样品以在SDS凝胶上评估DAP表达。数据显示在正确大小30Kda处 的蛋白质条带。用限制酶Rsa I和Hind III消化PCR片段，并将所得的489bp片段通过DNA连接 克隆入用限制酶Nru I和Hind III消化的5327pStrExpl中，并克隆入枯草芽孢杆菌PL1801中。编码融合蛋白的可读框的DNA序列在SEQ ID NO 38中显示，而蛋白质序列在SEQ ID NO 39中显示。实施例4 =DAP构津体在枯草芽孢杆菌中的表汰如专利WO 2000/075344中所描述的那样在摇瓶中培养枯草芽孢杆菌PL1801的转 化体，并从上清液回收融合蛋白。如本文中别处所显示的那样确认融合蛋白的抗体结合和 生物素结合特性。实施例5 :DAP的纯化5a.通过大小排阻层析纯化的化学合成的DAP将来自实施例1的缀合混合物在大小排阻柱上加载以通过除去反应物来纯化DAP 分子。在预填充的Superdex 200 16/60柱上实施大小排阻层析。在柱上加载ImL DAP反 应溶液。泵流速为1. OOmL/分钟，洗脱液是150mM NaCl, 50mM Hepes pH 7. 0，并收集ImL的 级分。基于280nm处的吸光度测量来合并各级分以除去反应物。使用具有NWCO为3000的Amicon超速离心管将所收集和合并的级分浓缩10x。5b.通过IgG-S印harose亲和层析得到的重组DAP如下自发酵培养液纯化重组DAP分子，即进行无菌过滤，随后通过IgG亲和层析进 行柱纯化。通过遵循由卖家提供的方法来制备IgG-S印harose柱用3L ImM HCl 将 15g 来自 GE Healthcare 的 CNBr 活化的 S印harose 4B 清洗 15 分钟。将清洗过的介质添加至25mL 20mg/mL来自DAKO A/SA(X0903)的IgG溶液和50mL 0. 75M NaCl,0. 15M NaHC03pH 8. 3。将混合物于室温温和旋转95分钟。用75mL含有0. 5M NaCl的0. IM NaHCO3PH 8. 3洗去过量的IgG，之后将介质在0. IM Tris/HCl pH 8. 0中温育 2小时。在20%乙醇中贮存介质，直至使用。用于纯化重组DAP的通用方法通过利用所有重组DAP构建体共享的IgG结合域的通用亲和层析方法来纯化来自 实施例2和3的重组DAP分子。自无菌过滤的发酵培养液纯化DAP分子。在用约30mL IgG-S印harose填充的XK26/20柱上实施层析。无菌过滤发酵培养 液，并加载65mL 80mL，这取决于经过滤的发酵培养液的体积。泵流速在样品加载期间 为1. 50mL/分钟，而在清洗和洗脱期间为2mL/分子。缓冲液A是0. IM NaH2PO4 pH 7. 2， 0. 15M NaCl，而缓冲液B 0. IM柠檬酸pH 3. 5。样品加载后用15个柱体积缓冲液A清洗柱。 用5个柱体积缓冲液B洗脱结合的材料，之后用10个柱体积缓冲液A使该柱再生。收集 IOmL的级分。合并280nm处具有吸光度升高的洗脱液，并使用IM Tris将pH调节至7. 2。 从280nm处的吸光度计算DAP蛋白的浓度，并从一级序列计算理论吸收系数，其使用GPMAW8. 0 (Trends in Biochemical Science，第 26 卷，No. 11，2001 年 11 月，第 687 页-第 689 页， "GPMAff-a software tool for analyzing proteins andpeptides，，;还可参见http://www. gpmaw. com/)来进行。通过SDS-PAGE来测定纯化的蛋白质的Mw。在进一步分析前在_18°C 贮存样品。实施例6 参考Biacore议卜.测丨量的结合强度表ffi DAP分子。使用用于实时监测生物分子结合事件的商业化表面等离振子共振(SPR)技术来 测量制备好的DAP候选物的结合亲和力。此技术的一般原则在于sra传感器芯片测量折射 率变化，并且折射率变化与接近传感器表面的水层中的质量变化相关联。当溶液中的靶分 子结合配体(固定在传感器表面上)时，质量增加，而当它们自配体解离时，质量减少。此 原则促进连续地、实时地监测相互作用的分子的结合和解离。关系的图解表示提供关于结 合特异性、分子在样品中的活性浓度、反应动力学和亲和力的实时定量信息。为了评估DAP中存在的两种结合亲和力的结合亲和力，必须将IgG或捕捉配体固 定于传感器芯片上。对于IgG，使用兔抗甘露聚糖酶，而对于配体，用链霉抗生物素蛋白包被 芯片，然后经由与合适配体连接的生物素将配体固定。为了测量对RR6和阿卡波糖的结合，制备下列化合物连接有生物素的阿卡波糖 和连接有生物素的RR6。连接有生物素的阿卡波糖的制备将生物素(5mg，26ymol)在2mL Eppendorf管中的DMF (250 μ L)中溶解，并向其添 加盐酸EDC (5mg，26 μ mol)。将混合物于RT搅动30分钟。阿卡波糖(16. Img, 25 μ mol)在 2mL Eppendorf管中的DMF (250 μ L)中溶解，并向其逐滴添加活化的生物素溶液，期间温和 地搅动反应混合物。在添加所有活化的生物素溶液时，使用IOOyL DMF来清洗反应容器， 并且还将这100 μ L添加至阿卡波糖溶液。将反应混合物于RT维持搅动2h。这之后，通过 于_5°C冷冻干燥过夜来除去DMF。于_18°C贮存粗制产物，直至在Biacore实验中使用。连接有生物素的活性红6的制备将生物素(5mg，26ymol)在2mL Eppendorf管中的DMF (250 μ L)中溶解，并向其添 加盐酸 EDC (5mg，26 μ mol)。将混合物于 RT 搅动 30 分钟。1，4_ 丁二胺(25. 1 μ L，25 μ mol) 在2mL Eppendorf管中的DMF (250 μ L)中溶解，并向其逐滴添加活化的生物素溶液，期间温 和地搅动反应混合物。在添加所有活化的生物素溶液时，使用100 μ L DMF来清洗反应容器， 并且还将这100 μ L添加至丁二胺溶液。将反应混合物于RT维持搅动2h。将活性红6(24. 4mg，25ymol)在 2mL Eppendorf 管中的 DMF (250 μ L)中溶解，并 向其逐滴添加生物素酰胺溶液，期间温和地搅动反应混合物。在添加所有生物素酰胺溶液 时，使用100 μ L DMF来清洗反应容器，并且还将这100 μ L添加至RR6溶液。将反应混合物于RT维持搅动过夜。通过于_5 °C冷冻干燥过夜来除去DMF。于-18 °C 贮存粗制产物，直至在Biacore实验中使用。Biacore 评估分别对DAP候选物分析与捕捉配体传感器芯片和靶生物分子传感器芯片的结合。 使用 Biacore 3000 仪。为了研究DAP分子的IgG结合端与IgG之间的相互作用(一方面)和配体结合端 与配体(生物素、阿卡波糖、活性红)之间的相互作用(另一方面)，将IgG和配体固定于传
34感器芯片的传感器表面上，如下文所描述的。如下发生固定化，即通过与表面的直接共价偶联(使用胺偶联试剂盒，BiaC0re，GE HealthCare)或者经由捕捉分子，如制造商(BiaCore，GE HealthCare)所规定的。量化偶 联靶物的量，并以折射单位(RU)表示。通过在芯片的准备好的传感器表面上注射样品(20μ 1/分钟)来监测相互作用。 除非另有说明，在IOmM乙酸钠缓冲液ρΗ 5. 0中于室温评估结合。实验1 芯片CM5固定的靶物10mM乙酸盐缓冲液ρΗ 5. 0中的兔抗甘露聚糖酶(10 μ g/ml)。靶标RU: 1250 个 RU真实RU FCl: 1349FC2 1492FC3 1338FC4 1331样品FCl 蛋白 A，注射 1 μ g/mlFC2 蛋白A-抗生物素蛋白，注射0. 5 μ g/mlFC3 蛋白A-抗生物素蛋白，注射0. 5 μ g/mlFC4:亲和体(IgG)-抗生物素蛋白，注射0.6 μ g/ml结果 实验2 芯片CM5固定的靶物10mM乙酸盐缓冲液pH 5. 0中的兔抗甘露聚糖酶(10 μ g/ml)。靶标RU:1250RU真实RU:FC2 1697FC3 1665样品FC2 =CBD-Z-Z-CBD,注射 10 μ g/mlFC3 CBD-Z-Z-CBD,注射 10 μ g/ml结果 实验3 芯片CM5固定的靶物10mM乙酸盐缓冲液pH 5. 0中的兔抗甘露聚糖酶(10 μ g/ml)。靶标RU:1250RU真实RU FC3 1485FC4 1760样品FC3 AMG-Z,注射 10 μ g/mlFC4 =AMG-ZZ,注射 10 μ g/ml结果 实验4 芯片CM5固定的靶物10mM乙酸盐缓冲液pH 5. 0中的兔抗甘露聚糖酶(1 μ g/ml)。靶标RU :625RU真实RU FCl 683FC2 731FC3 881FC4 716样品FCl 蛋白 A，注射 1 μ g/mlFC2 ZZ-CBD-CBD,注射 0. 1 μ g/mlFC3 :VhhRR6 (R2) -Ζ,注射 1 μ g/mlFC4 CBD-Z-Z-CBD,注射 1 μ g/ml结果 实验5 芯片SA固定化无。用链霉抗生物素蛋白预包被芯片。经由生物素_链霉抗生物素蛋白结合来固定化配体FCl 生物素-阿卡波糖，10 μ g/mlFC2 生物素-阿卡波糖，10 μ g/mlFC3 生物素-活性红 6，10 μ g/ml
DAP经由该分子的配体结合端结合配体。FCl =AMG-Z-Z, 10 μ g/mlFC2 :AMG-Z, 10 μ g/mlFC3 :VhhRR6 (R2) -Ζ, 10 μ g/ml结果 实验6:芯片SA固定化无。用链霉抗生物素蛋白预包被芯片。经由生物素_链霉抗生物素蛋白结合固定化配体FC4:生物素-活性红 6，10 μ g/ml在存在与DAP分子的Z结构域结合的IgG的情况中DAP经由该分子的配体结合端 结合配体 a没有测量生物素与抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白之间的结合，因为已知其是 非常紧密的，因此无法测量到解离。b若在加载至Biacore前混合VhhRR6(R2)-Z与IgGJlJ Kd是IO-5M,然而，注射一停止就完全破坏结合。_仿丨丨7溯膽_碰舰##錢·体下文是一般可应用于免疫球蛋白纯化的方法的简短描述1.具有低分子量捕捉配体分子的一次性通用固相。2.双亲和性多肽DAP (例如抗生物素蛋白-蛋白A)与溶液中的IgG(靶生物分子) 起反应。将DAP分子连同靶蛋白(IgG) —起固定在复合物中的固相(例如生物素-琼脂 糖)上。3.清洗该柱以消除干扰性非产物成分。4.使用低pH的合适缓冲液从该柱洗脱免疫球蛋白。5.收集含有抗体的级分，并中和pH。6.可以放弃含有固定的双亲和性多肽的通用基质。材料和方法所有缓冲成分为分析用(pro-analysis)。兔血清蛋白和兔IgG级分(代码X0903) 来自DAKO A/S，丹麦。生物素琼脂糖来自Sigma-Aldrich ；B6885-5ML。使用包含级分收集器(Frac-IOO)、记录仪(Rec-I)、光学单元和控制UV-I (均来自 GE Healthcare)的层析系统来实施纯化实验。对于所有实验，我们使用了具有流动转接器 (flow adaptor)的BioRAd Econo柱ID 1.0cm。平衡和稀释缓冲液是0. IM磷酸盐，0. 15M
39NaCLpH= 7. 2 (PBS)0洗脱缓冲液是0. IM柠檬酸盐，pH = 3. 5，或者备选地，0. IM甘氨酸， pH = 2. 8。数据处理基于使用Pharmacia Gene Quant 11得到的Abs 280nm测量和兔 IgG(lg/L)的消光系数1.35。IgG纯化分析所有实验均于室温实施。实施例7a 用游离的DAP「蛋白A-中件杭牛物素蛋白1回收令,IgG容许吸附剂(生物素琼脂糖，5mL)在柱中沉降10分钟。以1. 46mL/分钟的流速 填充该柱。用7. 5个柱体积(CV)PBS平衡该柱。将DAP(蛋白A-中性抗生物素蛋白)溶液 (来自实施例Ib的4. 5mL)与100 μ L兔IgG储液(20g/L)混合，并在磁性搅拌器上温育5 分钟。将反应溶液加载在柱上，并用7. 5个CV的PBS清洗以除去过量的靶蛋白。通过用3 个CV的0. IM甘氨酸缓冲液(pH 2. 8)进行的洗脱来回收IgG。收集5mL级分，并通过Abs 280分析IgG含量。关于结果参见表2。实施例7b 用固定的DAP「蛋白A-中件杭牛物素蛋白1回收令,IgG用7.5个CV PBS使具有固定化DAP[蛋白A-中性抗生物素蛋白]的来自实施例 7a的凝胶材料再生，之后分析常规的亲和纯化能力。我们在柱上加载了 4. 6mL PBS溶液中的2mg IgG。样品加载后，用7. 5个CV的PBS 清洗该柱以除去过量的蛋白质。然后用3个CV的0. IM甘氨酸缓冲液(pH 2. 8)洗脱该柱 以回收IgG。收集5mL级分，并通过Abs 280和SDS-PAGE分析IgG含量。关于结果参见表 2。表2. 如表2中所看到的，与应用固定化DAP的常规亲和层析相比，当DAP和IgG在该柱 上加载前在溶液中起反应时，我们获得了约两倍的结合能力(26%对14% )。实施例7c 用游离的DAPΓ蛋白A-中件杭牛物素蛋白1从血清钝化令,IgG我们研究自兔血清纯化IgG以显示DAP纯化技术的特异性。容许约ImL吸附剂(生物素琼脂糖)在柱中沉降10分钟。以1. 46mL/分钟的流 速填充该柱。用7. 5个柱体积(CV)PBS平衡该柱。将4. 5mL DAP(蛋白A-中性抗生物素蛋 白)溶液(来自实施例lb)与115 μ L兔血清混合，并在磁性搅拌器上温育5分钟。将反应 溶液加载在柱上，之后用7. 5个CV的PBS清洗以除去过量的靶蛋白。通过用3个CV的甘氨 酸缓冲液进行的洗脱来回收IgG。收集2. 5mL级分，并通过Abs 280和SDS-PAGE分析IgG 含量。关于结果参见表3。实施例7d 用固定的DAPΓ蛋白A-中件杭牛物素蛋白1从血清钝化令,IgG用7.5个CV PBS使具有固定化DAP[蛋白A-中性抗生物素蛋白]的来自实施例Ic的凝胶再生，之后分析常规的亲和纯化能力。我们在柱上加载了兔血清(4.5mL PBS中的115 μ L兔血清)溶液。样品加载后， 用7. 5个CV的PBS清洗该柱以除去过量的蛋白质。然后用3个CV的0. IM甘氨酸缓冲液 (ρΗ 2.8)洗脱该柱以回收靶标IgG。用7.5个CV PBS使凝胶再生，之后是下一轮亲和纯化 循环。收集2. 5mL级分，并通过Abs 280和SDS-PAGE分析IgG含量。关于结果参见表3。表3 如表3中所看到的，与应用固定化DAP的常规亲和层析相比，当DAP与溶液中的 兔血清在接触生物素-琼脂糖柱前起反应时，我们获得了约两倍的结合能力(0.31mg对 0. 18mg IgG)。SDS-PAGE显示，仅从血清获得IgG分子，显示DAP纯化技术是特异性的。我们使用其它DAP缀合物(蛋白A-抗生物素蛋白)重复所述分析，并实施与上文 类似的测试，但是包括通过对固定化DAP的重复结合分析来分析DAP从该柱的泄漏。实施例7e 用游离的DAP「蛋白A-杭牛物素蛋白1回收令,IgG容许吸附剂(生物素琼脂糖，ImL)在柱中沉降10分钟。以1. 46mL/分钟的流速 填充该柱。用7.5个柱体积(CV)PBS平衡该柱。将2mL DAP (蛋白A-抗生物素蛋白)溶液 (来自实施例3a)与160 μ L兔IgG储液(20g/L)混合，并在磁性搅拌器上温育5分钟。将 反应溶液(约2个CV)加载在柱上，之后用7. 5个CV的PBS清洗以除去过量的靶蛋白。通 过用3个CV的0. IM柠檬酸盐，ρΗ = 3. 5进行的洗脱来回收IgG。收集2. 5mL级分，并通过 Abs 280分析IgG含量。关于结果参见表4。表4.游离的DAP对固定化DAP技术的再使用(蛋白A-抗生物素蛋白缀合物)兔IgG回收 7f 用固定化DAP「蛋白A-杭牛物素蛋白1回收令,IgG用7. 5个CV PBS使具有固定化DAP[蛋白A-抗生物素蛋白]的来自实施例7e的 凝胶再生，之后分析常规的亲和纯化能力。用PBS将兔IgG储液(20g/L)稀释至1. 5mg/mL的浓度。在每次运行中，在柱上加 载3. 2mg IgG(在2. 16mL中)。样品加载(约2个CV)后，用7. 5个CV的PBS清洗该柱以
41除去过量的蛋白质。然后用3个CV的洗脱缓冲液(0. IM柠檬酸盐，pH = 3. 5)洗脱该柱以 回收靶标IgG。用7. 5个CV PBS使凝胶再生，之后是下一轮亲和纯化循环。收集2.5mL级 分，并通过Abs 280分析IgG含量。当DAP与溶液中的3. 2mg IgG在与生物素-琼脂糖接触前起反应时，与用固定化 DAP在四个重复循环中平均回收的0. 35mg IgG相比，我们回收了 1. 2mg IgG。如此上述结果显示与常规的层析相比使用依照本发明的DAP的有利效果。实施例8 使用双亲和层析回收IgG在通用纯化测定法中评估了从实施例5a和5b纯化的DAP分子。使用Akta探测器系统于室温进行了实验。在装备有可调节流动转接器(Omnifit) 的空玻璃柱(6. 6x100mm)中以1. 2mL/分钟的流速填充0. 6mL固相材料。在0. IM磷酸钠， 0. 15M NaCLpH = 7. 2 (PBS)中填充该柱，并容许用10个柱体积PBS，接着用3个柱体积0. IM 柠檬酸盐，PH = 3. 5，并最后用10个柱体积PBS进行平衡，之后进行使用。使用用纤维素填充的柱来分析ZZ-CBD-CDB和CBD-ZZ-CBD。将1. 2gAvicel (Merck 产品号1.02331)在试管中的8ml PBS中悬浮，并容许悬浮液沉降30分钟。随后，倒掉细颗 粒，之后填充该柱。使用用阿卡波糖-琼脂糖填充的柱来评估AMG-Z和AMG-ZZ。将来自实施例9的约 0. 6mL阿卡波糖-琼脂糖转移至柱，并容许沉降10分钟，之后填充该柱。使用用RR6-琼脂糖填充的柱来分析VhhRR6 (R2) _Z。将来自实施例9的约0. 6mL 活性红_琼脂糖转移至柱，并容许沉降10分钟，之后填充该柱。使用用生物素_琼脂糖填充的柱来评估抗生物素蛋白-蛋白A、抗生物素蛋白-亲 和体和ZZ-链霉抗生物素蛋白。将约0. 6mL生物素-琼脂糖(SigmaB6885)转移至柱，并容 许沉降10分钟，之后填充该柱。以0.6mL/分钟的流速操作填充的柱。缓冲液A是0. IM磷酸钠pH 7.2,0. 15M NaCl，而缓冲液B是0. IM柠檬酸pH 3.5。最初用10个柱体积缓冲液A清洗该柱，之后注 射0. 6mL样品。用7. 5个柱体积缓冲液A清洗该柱，并用5个柱体积缓冲液B洗脱结合的 靶蛋白。最后用10个柱体积缓冲液A使该柱再生。在280nm进行检测。通过测定洗脱过 程中观察到的峰的高度来评估数据。将纯化的DAP(8nmole)与 IgG (代码 X0903，DAKO A/S，8nmole)混合，并将水添加 至660 μ L。将反应混合物在磁性搅拌器上温育10分钟，之后将其注射至该柱上。将靶蛋 白的溶液制备为水中的2mg/mL IgG溶液。在所有实验中实施下列注射顺序水；靶蛋白 (7. Inmole)；靶蛋白和DAP反应混合物；和最后靶蛋白(7. Inmole)的10倍后续注射。随后使用用于评估蛋白A-抗生物素蛋白DAP分子的柱来评估通过改变注射体 积来改变靶蛋白加载的效果。进行四次注射(0.6 ;0. 45 ；0.3 ；0. 15)mL相同IgG溶液 (12 μ M)。结果显示，洗脱过程中观察到的峰高度几乎不变，而流过液中观察到的峰高度随 着柱加载降低而显著降低(表5)。这些结果与亲和层析的特性一致，而且表明通过使用洗 脱过程中观察到的峰高度来评估数据的应用方法是有效的。表5自注射不同体积的IgG测定的峰高度 如下评估靶蛋白对该柱的非特异性结合，即通过注射水和随后的靶蛋白，之后将 DAP分子引入柱材料。在所有所实施的实验中自注射的水和IgG观察到的峰高度是相当的。 这表明洗脱过程中观察到的峰不受靶蛋白与柱的潜在非特异性结合的影响。如此，洗脱过 程中观察到的峰是对自非共价固定化DAP回收的靶蛋白量的测量。通过比较自注射的水、靶蛋白和靶蛋白/DAP反应混合物获得的层析谱来分析DAP 分子回收靶蛋白的能力。表6中显示了结果。仅有两种DAP分子不能回收靶蛋白。1) VhhRR6 (R2) -Z不回收IgG，这可以通过来自Biacore分析的结果进行解释，其显示DAP与配 体之间的结合在注射停止后就完全被破坏(表1脚注)。这指明DAP分子从固相快速释放， 并且如此不适合于亲和层析。2)ZZ-链霉抗生物素蛋白DAP不回收IgG，这很可能通过因与 发酵培养液中存在的内源生物素反应而封闭生物素结合位点来解释。如此此ZZ-链霉抗生 物素蛋白制备物很可能不结合固相。表6 DAP分子回收靶蛋白的能力 通过在初始注射DAP/靶蛋白反应混合物后10次连续注射靶蛋白来评估DAP自该柱的泄漏。测定洗脱过程中观察到的峰高度，并相对于IgG的第一次注射计算相对响应。将 相对响应作为注射数目的函数绘图，并通过线性回归来计算峰高度的相对降低。表7中显 示了来自不同DAP-配体组合的结果以及解离常数。表7解离常数和相对泄漏 a 一般认为CBD结合纤维素的解离常数(Kd)为约ICT6M(Linder等，Biotechnology and 8土(^叫11^^1^叫，第60卷，吣.5，1998年12月5日)。b抗生物素蛋白结合生物素的解 离常数(Kd)公知为 ICT15M (Green，N. (1963). Biochem J，89，585-591)。。相关系数反映所计 算的泄漏主要由单点决定。相对泄漏是_0.05%，若消除r2 = 0.0的点的话。表7中的结果显示使用DAP分子的多种组成进行同一靶分子(IgG)的纯化方案。 结论为亲和层析中最有效的DAP分子是那些结合基质上的配体较紧密的DAP分子，即那些 具有相对 KD,t/KD,s > 10° = 1 的。具体地，由抗生物素蛋白_生物素键提供的针对柱的强烈结合阻止结合的DAP分 子泄漏。实施例9 功能化树脂的制备材料树脂Mini-Leak-Low (加载 2_5mM，Kem-En-Tec)。配体1，4_ 丁二胺([110-60-1]，Sigma-Aldrich，D13208)，活性红 6(樱红色 #14，Grateful Dyes inc.)，阿卡波糖([56180-94-0]Sigma-Aldrich，A8980)。偶联缓冲液0.5M K2HPO4-PH 8. 5清洗缓冲液0.5M K2HPO4-PH 7. 0封闭缓冲液=Milli-Q水中的0. IM乙醇胺RR6-琼脂糖树脂的制备用蒸馏水清洗树脂(10ml，悬浮的)2次，并通过过滤除去水。将1，4_ 丁二胺 (2. OmL)在偶联缓冲液(20mL)中溶解，并在温和摇动的情况中缓慢添加树脂。将树脂于RT 维持摇动过夜，之后将其用偶联缓冲液清洗，并吸干。将活性红6 (15. 9g)在偶联缓冲液(50mL)中溶解，并在摇动的情况中向此溶液缓 慢添加氨基功能化的树脂。再次将树脂于RT维持摇动过夜。用水和清洗缓冲液清洗后，将树脂转移至封闭缓冲液(20mL)，并摇动2h。最后，在水中清洗树脂，直至滤液无色，并将红 色树脂在Mi 11 i-Q水中30 %的乙醇中悬浮。阿卡波糖-琼脂糖树脂的制备用蒸馏水清洗树脂(10ml，悬浮的)2次，并通过过滤除去水。将阿卡波糖(500mg) 在偶联缓冲液(20mL)中溶解，并在温和摇动的情况中缓慢添加树脂。将树脂于RT维持摇 动过夜，之后将其用水和清洗缓冲液清洗。将树脂转移至封闭缓冲液(20mL)，并摇动2h。最后，在水中清洗树脂，并将所得的 树脂在Mi 11 i-Q水中30 %的乙醇中悬浮。
权利要求
一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a)使(i)靶生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体或双亲和性多肽结合位点的固体支持物接触，其中在标准条件下所述双亲和性多肽的平衡解离常数之间的比率[KD，t/KD，s]至少为100，并(b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。
2.依照权利要求1的方法，其中所述固体支持物选自包括固相基质和颗粒的组。
3.依照权利要求2的方法，其中所述固体支持物是固相基质，并将所述靶生物分子和 所述双亲和性多肽加载到所述固相基质上。
4.依照权利要求3的方法，其中所述靶生物分子和所述双亲和性多肽的加载是通过同 时加载这两者，或者通过首先加载所述双亲和性多肽或者通过加载溶液中形成的所述靶生 物分子与所述双亲和性多肽之间的复合物来实施的。
5.依照权利要求1的方法，其中所述双亲和性多肽具有范围为10_2至10_13M，更特别为 10_4至10_13M的针对所述靶生物分子的平衡解离常数KD,t，和范围为10_9至10_16M的针对所 述捕捉配体的平衡解离常数KD, s。
6.依照权利要求5的方法，其中KD,t在10_6至10_13M的范围内，而KD,s在10_"至10_16M 的范围内。
7.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述双亲和性多肽的平衡解离常数之间的 比率[KD,t/KD,J是至少101，更特别是至少102，更特别是103，并且甚至更特别是至少104。
8.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述靶物的洗脱是通过改变溶液中的pH、 离子强度、或离液离子含量之任一，或其任意组合来实现的。
9.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述双亲和性多肽是融合多肽。
10.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述双亲和性多肽的靶物结合部分选自 下组蛋白A、抗体、抗体片段、蛋白A片段、蛋白A衍生的IgG结合域、脂笼蛋白、凝集素。
11.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述双亲和性多肽的配体结合部分选自 下组抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、类固醇受体、抗体、抗体片段、 脂笼蛋白、凝集素、淀粉葡糖苷酶、纤维素结合域。
12.依照权利要求10-11中任一项的方法，其中所述抗体选自下组美洲驼和骆驼抗体。
13.依照权利要求9的方法，其中所述融合多肽是通过蛋白A或蛋白A衍生的IgG结合 域的至少一个IgG结合域与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、或中性抗生物素蛋白的至 少一个生物素结合域的融合来生成的。
14.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述配体选自下组生物素、阿卡波糖、 类固醇、半抗原、表位肽、染料、和酶抑制剂。
15.依照权利要求13的方法，其中附着至所述固体支持物的所述捕捉配体是生物素， 而所述靶生物分子是IgG。
16.依照上述权利要求中任一项的方法，其中所述固体支持物是固相基质。
17.依照权利要求16的方法，其中所述固相基质骨架选自下组琼脂-琼脂、琼脂糖、 纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、聚酰胺、聚乙烯醇、二氧化硅、和受控多孔玻璃。
18.依照权利要求9的方法，其中所述融合多肽是作为重组多肽在重组宿主细胞中生 成的。
19.依照权利要求18的方法，其中所述融合多肽和所述靶生物分子是在同一类型的宿 主细胞中表达的。
20.依照权利要求18-19中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自下组细菌细胞、真 菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、和昆虫细胞。
21.依照权利要求1的方法，其中所述双亲和性多肽是化学融合的。
22.一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a)使(i)靶多肽、(ii)双亲和 性多肽、和(iii)包含捕捉配体的固体支持物接触，其中在标准条件下所述双亲和性多肽 具有范围为10_2至10_13M，更特别为10_4至10_13M的针对所述靶生物分子的平衡解离常数 KD, t，并且其中所述双亲和性多肽对所述固体支持物上的所述捕捉配体的结合是通过切割 对位取代的苄基鸟嘌呤产生硫醚键而提供的；并(b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。
23.依照权利要求22的方法，其中KD,t在10_6至10_13M的范围内。
全文摘要
本发明涉及一种用于纯化靶生物分子的方法，包括下列步骤(a)使(i)靶生物分子、(ii)双亲和性多肽、和(iii)包含捕捉配体的固体支持物接触，其中双亲和性多肽的平衡解离常数之间的比率，即[KD，t/KD，s]，在标准条件为至少100，并(b)通过洗脱来回收所述靶生物分子。
文档编号C07K1/22GK101910194SQ200880124535
公开日2010年12月8日 申请日期2008年11月12日 优先权日2007年11月12日
发明者简·基斯-安德森 申请人:诺维信公司