特异于β-淀粉状蛋白肽的新抗体以及其用作诊断剂或药物的用途的利记博彩app

专利名称：特异于β-淀粉状蛋白肽的新抗体以及其用作诊断剂或药物的用途的利记博彩app
特异于β“淀粉状蛋白肽的新抗体以及其用作诊断剂或药
物的用途本发明涉及对β-淀粉状蛋白肽特异的新抗体，以及其作为诊断剂或药物的用途。淀粉状变性意指哺乳动物中，特征在于存在淀粉状蛋白纤维的病理状况。淀粉状 蛋白是一群多样但特定的蛋白质沉积物(Cbposit)的通称。所有的淀粉状蛋白沉积物均具 有共同的形态学特征、被特殊的染料(例如刚果红)染色，并在染色后在偏振光下具有独特 的红-绿双折射外观。不同的淀粉状蛋白还由存在于沉积物中的蛋白质的类型表征。例如， 神经退行性疾病，如羊瘙痒症、牛海绵状脑炎、克雅病(CreutZfeldt-Jakob disease)等，特 征在于阮病毒蛋白的蛋白酶-抗性形式(称为AScr或PrP-27)在中枢神经系统中的出现 和累积。类似地，阿尔茨海默病，另一神经退行性病症，特征为神经炎斑和神经原纤维缠结。 在该情况下，通过纤维状β “淀粉状蛋白的沉积形成斑和血管淀粉状蛋白。阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆症的最常见类型，并据信为40-60%的所有痴呆病 例的原因。AD的发生率随着年龄增加而增加，其影响十分之一的65岁以上的老人，和几乎 二分之一的85岁以上的老人。大体而言，自然病史可表征为不可逆的进行性脑病症，其最 终导致破坏性记忆丧失、严重的行为和性格改变，以及严重受损的认知能力。这些损害与潜 在的脑细胞死亡以及其间联系的瓦解有关。鉴于必须对AD患者提供制度性和辅助护理的 卫生保健系统的庞大花费，AD对社会和对国家经济的冲击是巨大的。在AD脑中观察到两种主要类型的组织学损伤，其与神经元丧失有关(Felician和 Sandson,(1999),The neurobiology andpharmacotherapy of Alzheimer' s disease. J. NeuropsychiatryClin. Neurosci. 11 :19_31)(i)在细胞内水平上，AD患者中的神经元细胞骨架被进行性地破坏，并被由成对 螺旋丝(PHF)组成的神经原纤维缠结(NFT)取代；( )在细胞外水平上，通过纤维状β -淀粉状蛋白(Αβ )的沉积形成淀粉状蛋白斑。Αβ是老年斑的主要组份。Αβ为小肽，主要发现两种大小，分别包括40个 (Αβ^)和42个(Ai^_42)氨基酸，以及少量的其他大小。已知Αβ通过APP的蛋白水解 切割来代谢(Saido, (2000), Degradationof amyloid- β peptide :a key to Alzheimer pathogenesis, prevention and therapy. Neurosci. News 3 :52_62),所述 APP 为大的 跨膜蛋白质，其具有已知但不完全清楚的神经营养功能(Seo等人，(2001)，Effects of nicotine on APP secretion and Abeta-orCT(105)-induced toxicity. Biol. Psychiatry 49 =240-247) 0 APP可经由两种主要途径进行切割，主要的非-淀粉状蛋白生成途径和次要 的淀粉状蛋白生成途径，后者产生Αβ作为最终的产物。APP的主要分解代谢途径是经由α -分泌酶(secretase)在APP中接近β -淀粉 状蛋白肽区域中心的单一位置处的切割(Esch等人，(1990)，Cleavage of amyloid beta peptide during constitutiveprocessing of its precursor. Science 248 :1122-1124 ； Sisodia, (1992), Beta-amyloid precursor protein cleavage by amembrane-boundprotease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :6075_6079)。通过该途径产生的产物是 APP 的大的N-末端区域(APPs α)和膜结合的C-末端片段(C83)，其随后被Y -分泌酶水解， 产生几乎未知的小的Ρ3肽。这是非-淀粉状蛋白生成途径，因为切割位置大约位于Αβ序 列的中央，不可能形成A β。次要的APP加工途径是β -和Y -分泌酶对APP的N-和C-末 端切割(图1)。这两个蛋白水解步骤所得的分子是APP的中间片段，Αβ4(ι和Αβ42，在所 形成的全部 Αβ 中，Αβ4(1 是较丰富的(Conde，(2002)，β -amyloid peptide as a target fortreatment of Alzheimer' s disease. Expert Opin. Ther. Patentsl2 :503_512)。 β-分泌酶切割淀粉状蛋白肽的氨基末端(这首先发生)，接着Y-分泌酶进行切割， 其释放肽的羧基末端。该陈述基于在细胞中迅速明显地观察到通过分泌酶切割产生的 C-末端片段，而没有观察到相应于单次C-末端γ切割的APP片段(Haass等人，(1992)， Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells duringnormal metabolism. Nature 359 :322_325 ;Seubert 等人，(1992)，Isolation and quantification of soluble Alzheimer' sbeta-peptide from biological fluids. Nature 359:325-327)。参与实质斑沉积的淀粉状蛋白肽与转基因小鼠模型中观察到的斑沉积不同 (Sergeant，N.等人，(2003)Truncated beta-amyloidpeptide species in pre-clinical Alzheimer' s disease as newtargets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry85 1581-1591 ；Kalback, W.等入，(2002)APP transgenic miceTg2576 accumulate Abeta peptides that are distinct from thechemically modified and insoluble peptides deposited inAlzheimer' sdisease senile plaques. Biochemistry 41 922-928 ；Rufenacht, P.等人(2005) Quant if icat ion of the Αβ peptide inAlzheimer ' s plaques by laser dissection microscopy combinedwith mass spectrometry. J Mass Spectrom 40 :193_201)o特别地，Αβ42ΚΝ-截短形式比全-尺寸的分泌酶-产生的Αβ丰富得多。此 外，在模型系统以及在循环体液(如CSF和血浆)中，已经检测到增加数量的额外的 A β 月太(Lewczuk, P·等人(2004)，Amyloid betapeptides in cerebrospinal fluid as profiled with surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry :evidence of nove lbiomarkers in Alzheimer' sdisease. Biol. Psychiatry. Mar. 1. ；55，524-530 ;Lewczuk，P·等人(2004)，Electrophoretic separation of amyloid betapeptides in plasma. Electrophoresis. 25,3336-3343 ；Lewczuk, P.等 人(2003)，The amyloid-beta (Abeta)peptide pattern incerebrospinal fluid in Alzheimer ' s disease :evidence of a novelcarboxyterminalIy elongated Aβ peptide. Rapid Commun. MassSpectrom, ；17,1291-1296 ；Wiltfang, J.等人(2002)， Highlyconserved and disease-specific patterns of carboxyterminallytruncated A β peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 inAlzheimer ' s disease and in patients with chronicneuroinflammation. J. Neurochem. 81，481—496 ； Qi-Takahara, Y.等人(2005)，Longer forms of amyloid beta protein :implicationsfor the mechanism of intramembrane cleavage by gamma-secretase. J Neurosci 25， 436-445 ；Funamoto, S.等人(2004)，Truncatedcarboxyl-terminal fragments of beta-amyloid precursor proteinare processed to amyloid beta-proteins 40 and42. Biochemistry43,13532-13540 ；Sato, Τ.等人(2003)，Potential link betweenamyloid beta-protein 42 and C-terminal fragment gamma 49-99 ofbeta-amyloid precursor protein. J Biol. Chem. 278,24294-24301)。利用抗β-淀粉状蛋白肽的抗体的阿尔茨海默病的免疫治疗，是治疗阿尔茨海 默病的可能的新方法(Schenk 等人(2000)，beta-p印tideimmunization :a possible new treatment for Alzheimer disease. Arch Neurol 57 :934_936 ;Hock 等人，(2003), Antibodies againstbeta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer' s disease. Neuron 38 :547_554)。然而，因为淀粉状蛋白是正常组织和生物体液的正常成分，严重的副作用已 经使第一个临床试验终止(Or gogozo等人，(2003) ,Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with ADafter Abeta 42immunization. Neurology 61 :46_54)。ΒSergeant ^A (Sergeant ^A, (2003), Truncatedbeta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer' sdisease as new targets for the vaccination approach. Journalof Neurochemistry 85 :1581_1591)显示，在早期淀粉状蛋白沉积物的 所有Αβ种类中有60%为氨基-截短的Αβ种类。国际申请案WO 2004/029630公开了单 克隆抗体，其特异性识别A β η_χ肽，但不识别A β h肽(χ为40或42)。用于免疫的肽是β分泌酶_11切割位置的前5至7个人氨基酸(β分泌酶 在Glu 11处切割APP蛋白质)。尽管如此，Αβη_χ肽并不是在淀粉状蛋白沉积的极早 阶段观察至IJ 的 Αβ 月太(Sergeant 等人，Truncated beta-amyloid peptide species in pre-cIinicalAlzheimer' s disease as new targets for the vaccination a pprach. Journal of Neurochemistry 85 1581-1591 (2003)) 此外，Aβ n_x 也不是病理学种类，因 为它通过β分泌酶切割而产生，且截短形式比全-尺寸的Αβ42*Αβη_χ种类 丰富得多。国际申请案WO 2004/013172涉及抗截短的β-淀粉状蛋白肽种类Αβω_η的多克隆 抗体，m包括1至Ij 10，且η包括m+3到m+15。用于免疫的肽为A β 5_12、Α β 6_13、Α β 8_15、Α β 9_16。 然而，该申请案的抗体是多克隆的，只有中等的亲和力。Murayama K. S.等人(Murayama K. S.等人，(2007), A novelmonoclonal antibody specific for the amino—truncated β -amyloid A β 5_40/42produced from caspase-cleaved amyloid precursorprotein, 161 :244_249)公开了用肽A β 5_12 免疫所获 得的单克隆抗体，其特异性识别A β 5_40而非A β H00在该文章中描述了两个其他的抗体·对Αβ 17_24特异的小鼠单克隆抗体4G8 ；·对Αβ15_3(1特异的兔多克隆抗体Ab-1。尽管如此，这两个抗体都无法特异性识别A β 5_40和A β η。。 本发明的目标之一是提供抗体，其特异性结合A β 8_χ肽的N-末端区域，但不识别 A β ^x (χ为40或42)，并能够特异地识别β -淀粉状蛋白沉积物的早期肽。本发明更进一步的目标是提供合成的肽，其可用于产生抗A β的N-截短的肽的免 疫应答，且因此可用于预防或治疗阿尔茨海默病。本发明还涉及制备方法，以便获得特异性结合A β 8_χ肽的N-末端区域的抗体。
本发明还涉及在哺乳动物中测定淀粉状蛋白负荷的方法。本发明更进一步的目标是提供方法，其用于在哺乳动物中测定对与Αβ形成和/ 或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)的易感性、用于在哺乳动物中测定发展与淀粉 状蛋白形成和/或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)的风险、用于在哺乳动物中筛选 β -淀粉状蛋白沉积的清除，或用于在哺乳动物中预测β “淀粉状蛋白负荷的水平。本发明还涉及治疗性或疫苗组合物，其包括对Αβ 8_χ肽的N-末端区域特异的抗 体，或包括带有模拟N-截短的A β肽的游离N-末端的游离N-末端的合成的肽，可用于制 备意欲用于预防或治疗阿尔茨海默病的药物或疫苗。本发明还涉及抗体的用途，其用于制备意欲用于预防或治疗阿尔茨海默病的药物 或疫苗。因此，本发明涉及抗体，其特异性结合Αβ8_χ肽的N-末端区域(χ包括11到42)且 不识别A β Htl也不识别A ^_42。术语“抗体”用于表示对A β 8_χ特异的单克隆或多克隆抗体，且还包括模拟对A β 8_χ 特异的单克隆抗体的片段或分子，特别是表位结合片段。片段或分子可通过重组DNA技术 或通过酶或化学方法，从单克隆抗体衍生，并可展现出可与单克隆抗体相比较的类似的对 抗原片段的结合特征。“多克隆抗体”意指来源于不同B-细胞系的抗体。“单克隆抗体”意指仅来自一个类型的细胞-杂交瘤细胞的抗体。“杂交瘤”细胞意指持续产生抗体的细胞融合物，S卩，可无限地复制的与哺乳动物 细胞融合的肿瘤细胞。本发明的抗体包括上文讨论的全长抗体，以及其表位-结合片段。当在本文中使 用时，“抗体片段”包括抗体的任何部分，其保留与可被全长抗体识别的表位结合的能力，通 常称为“表位-结合片段”。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fd、单链 Fv (s cFv)、单链抗体、二硫键-连接的Fv (dsFv)，以及包括VL或VH区的片段。表位-结合 片段(包括单链抗体)，可包含单独的可变区，或与下列的全部或一部分组合的可变区铰 链区、CHI、CH2和CH3结构域。此类片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab' )2片段。此外，片段可以是任一下 列免疫球蛋白种类的成员或可与其组合IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亚类。Fab和F(ab' )2片段可通过蛋白水解切割产生，使用酶，如木瓜蛋白酶(Fab片段) 或胃蛋白酶(F(ab' )2片段)。“单链Fv” ( "scFv")片段是表位_结合片段，其含有与至少一个抗体轻链可变区 (Vl)的片段连接的至少一个抗体重链可变区(Vh)的片段。连接物可以是短而有弹性的肽， 其经选择以确保将它们连接后，发生适当的\和Vh区的三维折叠，从而保持从其衍生该单 链抗体片段的完整抗体的靶分子结合_特异性。可通过连接物，将\或Vh序列的羧基末端 共价连接至互补\或Vh序列的氨基酸末端。本发明的单链抗体片段含有氨基酸序列，其具有至少一个本说明书中描述的完整 抗体的可变区或互补决定区(CDR)，但缺少这些抗体的一些或所有恒定结构域。这些恒定 结构域对于抗原结合不是必要的，但构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可 克服与使用含有一部分或所有恒定结构域的抗体有关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于没有生物分子与重链恒定区之间的不想要的相互作用，或其他不想要的生物活性。此 外，单链抗体片段比完整抗体小很多，并因此可具有比完整抗体更大的毛细管渗透性，从而 允许单链抗体片段更有效地定位并与靶抗原_结合位置结合。此外，可以在原核细胞中以 相对较大的规模产生抗体片段，从而有助于其生产。而且，单链抗体片段相对较小的尺寸， 使其比完整抗体更不可能在接受者中诱发免疫应答。可通过分子克隆、抗体噬菌体展示文库或本领域技术人员熟知的类似技术产生单 链抗体片段。例如，可在真核细胞或原核细胞(包括细菌)中产生这些蛋白质。还可使用 在本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生本发明的表位-结合片段。在噬菌体展示方法 中，在噬菌体颗粒的表面上展示功能性抗体结构域，所述噬菌体颗粒携带编码它们的多核 苷酸序列。特别地，可利用此类噬菌体来展示从库或组合抗体文库(例如人类或鼠)表达 的表位_结合结构域。可利用抗原，例如使用结合或捕获至固体表面或珠粒的经标记的抗 原，选择或鉴定表达与目的抗原结合的表位_结合结构域的噬菌体。在这些方法中使用的 噬菌体通常为丝状噬菌体，其含有从噬菌体表达的fd和M13结合结构域以及Fab、Fv或二 硫键_稳定的Fv抗体结构域(重组融合至噬菌体基因III或基因VDI蛋白质)。可用于制备本发明的表位-结合片段的噬菌体展示方法的实例，包括在 Brinkman 等人，1995，J. Immunol. Methods, 182 :41_50 ；Ames 等人，1995，J. Immunol. Methods, 184:177_186 ；Kettleborough 等人，1994，Eur. J. Immunol. ,24:952_958 ； Persic 等 K, 1997, Gene, 187 9-18 ；Burton 等 K, 1994, Advances in Immunology, 57 191-280 ；W0/1992/001047 ；WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；WO 92/18619 ；WO 93/11236 ；WO 95/15982 ；WO 95/20401 ；以及美国专利 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ； 5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ； 5，780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743和5，969，108中公开的那些；其各自以其全文通过引用 并入本文。在噬菌体选择后，可分离编码该片段的噬菌体的区域，并使用重组DNA技术(例 如下文中详细描述的)，通过在经选择的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵 母和细菌)中表达，将其用于产生表位-结合片段。例如，还可使用重组产生Fab、Fab' 和F(ab' )2片段的技术，使用在本领域中已知的方法，如在WO 92/22324 ;Mullinax等人， 1992，BioTechniques,12(6) :864_869 ；Sawai 等人，1995，AJRI，34 :26_34 ；和 Better 等 人，1988，Science, 240 =1041-1043中公开的那些；所述参考文献以其全文通过引用并入本 文。可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例，包括在美国专利4，946，778和5，258，498 ； Huston 等人，1991， Methods in Enzymology，203 :46_88 ;Shu 等人，1993， PNAS，90 7995-7999 ；Skerra 等人，1988，Science, 240 1038-1040 中描述的那些。在本发明的范围内，还包括在本申请中明确公开的抗体的功能等价物。术语“功 能等价物”包括具有同源序列的抗体、嵌合抗体、人工抗体和经修饰的抗体，例如，其中通过 其特异性结合上文定义的A β 8_χ肽的N-末端区域的能力，来定义每个功能等价物。本领 域技术人员将理解，在称为“抗体片段”的分子的群和称为“功能等价物”的群中存在重叠。 产生功能等价物的方法是本领域技术人员已知的，并例如在WO 93/21319、EP 239, 400 ；WO 89/09622 ；EP 338，745和EP 332，424中公开，其以其全文通过引用并入本文。人工抗体包括scFv片段、微型双功能抗体(diabodies)、微型三功能抗体
12(triabodies)、微型四功能抗体(tetrabodies)和 mru (参见 Winter，G.和 Milstein，C.， 1991, Nature, 349 293~299 ；Hudson, P. J. , 1999, Current Opinion in Immunology, 11 548-557的综述)，其各自具有抗原-结合的能力。在单链Fv片段(s cFv)中，通过有弹性 的肽连接抗体的vH和&结构域。通常，该连接物肽为大约15个氨基酸残基长。如果连接 物很小，例如5个氨基酸，则形成微型双功能抗体，其为二价的scFv 二聚体。如果连接物减 少至小于三个氨基酸残基，则形成三聚和四聚的结构(其称为微型三功能抗体和微型四功 能抗体)。抗体的最小结合单位为CDR，通常为重链的CDR2，其具有足够的特异识别和结合， 并可以单独使用。将此类片段称为分子识别单位或mru。可以用短连接物肽将数个此类mru 连接在一起，从而形成人工结合蛋白质，其具有比单个mru更高的亲和力。本申请的功能等价物还包括经修饰的抗体，例如通过将任何类型的分子共价连接 至抗体而修饰的抗体。例如，经修饰的抗体包括已例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷 酸化、酰胺化、用已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质 连接等修饰的抗体。共价连接不阻止抗体产生抗独特型应答。这些修饰可通过已知的技术 进行，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素(timicamycin)的代谢合成 等。此外，经修饰的抗体还可含有一或多个非经典氨基酸。可通过交换不同构架内的不同链上的不同⑶R来产生功能等价物。因此，例如，通 过不同重链的置换，不同种类的抗体有可能针对一组给定的⑶R，由此可产生例如IgGl-4、 IgM、IgAl-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。同样地，可通过在完全合成的构架内包埋一组给 定的CDR来产生在本发明范围内的人造抗体。可使用在本领域中已知的各种方法，通过在侧翼于一组特定的⑶R的可变区和/ 或恒定区序列内进行突变、缺失和/或插入，容易地产生功能等价物。可通过免疫测定检测对该A β 8_χ肽的N-末端区域特异的抗体。当在本文中使用 时，“免疫测定”为利用与抗原(即Αβ8_χ肽的N-末端区域)特异性结合的抗体的测定。因 此，免疫测定的特征在于检测蛋白质与抗体的特异性结合。表述“特异性结合”、“特异性识别”、“特异地识别”、“特异地与......反应”或
“特异地与......形成免疫学反应”意指抗体与Αβ 8_χ肽的N-末端区域的结合反应，其测
定Αβ 8_χ肽的N-末端区域在受样品品中的存在(在其他蛋白质和/或其他生物制剂的异 质群体存在的情况下)。可通过Luminex测定确定特异性。使用该测定，本发明的抗体对 Αβ8_χ肽展现出高特异性，即利用抗体获得的对Αβ8_χ肽的平均荧光强度(MFI)比对非特异 性肽(如A β 6_13肽)的高很多，例如TeiAl. 1对A β 8_15肽，MFI = 1822，但对A β 6_13肽，仅 有24 (参见实施例3和表3)。免疫学方法包括，但不限于流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单一或双重的)、凝 集测定、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA) ,Western印迹法、脂 质体免疫测定(Monroe等人，1986)、补体结合测定、免疫放射分析测定、荧光免疫测定、蛋 白质A免疫测定或免疫PCR。在Wild D. (2001) (Wild D. (2001),TheImmunoassay Handbook, 第2版 Nature Pr. ,London,UK)和Ghindilis等人(2002) (Ghindilis A. L. ,Pavlov Α. R.， Atanassov P. B.(编辑)(2002)Immunoassay Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, US)中提供了不同免疫测定的概要。因此，在指定的免疫测定条件下，所指定的抗体优先与本发明的A β 8_χ肽的N-末端区域结合，同时与其他蛋白质或蛋白质同种型的结合未以显著的量发生。特别地，所指定的抗体不与A β H2肽结合，并因此当用于治疗目的时，不会出现在 使用抗A β H2肽的抗体的情况下观察到的严重副作用(参见实施例5)。此类应答可以是通过施用免疫原诱导的主动应答，或通过施用抗体或经引发的 T-细胞诱导的被动应答。通过将与第I类或第II类MHC分子结合的多肽表位呈递给经活 化的抗原特异性CD4T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T-细胞，而诱发细胞免疫应答。该应 答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质 细胞、嗜酸性粒细胞或先天免疫的组份的活化。“免疫原性剂”或“免疫原”能够在施用给接受者哺乳动物后(任选地与佐剂组 合)，诱导抗其的免疫应答。在优选实施方案中，所述抗体对A β 8_χ肽的游离N-末端展现出高特异性。表述“游离N-末端”意指未经封闭的N-末端，即具有NH2末端的氨基酸。本发明的抗体可以是具有高特异性的多克隆抗体，或具有高特异性的单克隆抗 体。在其他优选实施方案中，所述抗体对A β 8_χ肽展现出高亲和力。术语“亲和力”意指抗体与A β 8_χ肽的N-末端区域的结合的强度，即抗体与A β 8_χ 肽的N-末端区域结合得有多紧。本发明的抗体可以是具有高亲和力的多克隆抗体，或具有高亲和力的单克隆抗 体。可通过桥接测定试验，测定本发明的单克隆抗体对A β 8_χ肽的N-末端区域的亲和 力(参见实施例3)。低于1的OD值表示低亲和力，而超过1的OD值则显示单克隆抗体对 其靶的高亲和力。在另一有利的实施方案中，本发明的抗体可以是具有高特异性和高亲和力的多克 隆抗体，或具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体。在更优选的实施方案中，所述抗体特异性靶向脑中的Αβ8_χ肽的实质淀粉状蛋白 沉积物，且不与血管淀粉状蛋白沉积物相互作用。当施用免疫原以诱导反应性抗该免疫原的抗体或T-细胞时，该免疫应答的诱导 是“主动的”。当施用本身在哺乳动物中与N-末端截短的A β 8_χ肽结合的抗体时，该免疫应 答的诱导是“被动的”。被动免疫的副作用之一为频繁的微出血。微出血数目的此类增加，可通过所注射 的抗体与在血管壁内聚集的Αβ肽的结合来解释(参见实施例5)。因此，本发明的抗体特异地靶向实质淀粉状蛋白沉积物，而非血管淀粉状蛋白沉 积物，因而不会出现在利用抗A β i_42肽的抗体时观察到的严重副作用(参见实施例5)。在优选实施方案中，本发明涉及抗体(其中χ包括15到42)，特别是单克隆抗体。在优选实施方案中，本发明涉及单克隆抗体，其特异性结合A β 8_χ肽的N-末端区 域，其中可变区包括下列氨基酸序列对(分别相应于轻链和重链)之一灰色区相应于轻链(⑶R-Lx)或重链(⑶R-Hx)的互补决定区。·抗体TeiA 1. 6 (由杂交瘤IGH521分泌)轻链可变区0070]CDR-L 1CDR-L2
0071 ]SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAST
0072]CDR-L3
0073]RDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG
0074](SEQ ID NO 1)
0075]重链可变区
0076]CDR-H 1CDR-H2
0077]GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTT
0078]CDR-H3
0079]EYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQ
0080]GTSVTVSS(SEQ ID NO 2)
0081]·抗体TeiA 1. 7 (由杂交瘤IGH522分泌)
0082]轻链可变区
0083]CDR-Ll
0084]SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLIYWAST
0085]CDR-L2CDR-L3
0086]RESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG
0087](SEQ ID NO 3)
0088]重链可变区
0089]CDR-H 1CDR-H2
0090]GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTT
0091]CDR-H3
0092]EYSASVKGRfIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLT
0093]SVTVSS (SEQ ID NO 4)
0094]·抗体Te i A 1. 8 (由杂交瘤I GH5 2 3分泌)
0095]轻链可变区
0096]CDR-L 1CDR-L2
0097]SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
0098]CDR-L3
0099]ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG
0100](SEQ ID NO:5)
0101]重链可变区
0102]CDR-HlCDR-H2
0103]GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTKQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFT
0104]CDR-H3
0105]TEYSASVKGRFTISRDNSQSI LYLQMSTLRAiiDSATYYCAVYGNYAMDYWG
0106]QGTSVNVSS(SEQ ID NO 6)
0107]·抗体Te iA 2b. 6 (由杂交瘤I GH 524分泌)
0108]轻链可变区0109]CDR-LlCDR-L2
0110]SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASTR
0111]CDR-L3
0112]GSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
0113](SEQ ID NO:7)
0114]重链可变区
0115]CDR-HlCDR-H2
0116]GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYT
0117]CDR-H3
0118]TEYSASVKGRFIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQ
0119]GTSVTVSS(SEQ ID NO 8)
0120]·抗体TeiA 1. 1 (由杂交瘤I GH525分泌)
0121]轻链可变区
0122]CDR-LlCDR-L2
0123]SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR
0124]CDR-L3
0125]ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG
0126](SEQ ID NO 9)
0127]重链可变区
0128]CDR-HlCDR-H2
0129]GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYK
0130]CDR-H3
0131 ]TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQ
0132]GTSVTVSS (SEQ ID NO: 10)
0133]当在本文中使用时，“抗体”意指由一个或多个多肽组成的蛋白质，所述多肽实质
上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。在优选实施方案中，上文定义的抗体的轻链和重链的可变区的CDR，包括下列氨基 酸序列之一·抗体 TeiA 1. 6(IGH521 序列)轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQSLLAGRYQKNYLT(SEQ ID NO: 11)CDR-L2 WASTRDSG(SEQ ID NO 12)CDR-L3 QNDYTYPLT(SEQ ID NO: 13)重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFSDFYME (SEQ ID N0:14)
16
CDR-H2 ASRNKANDYTTEYSASVKG(SEQ ID NO: 15)CDR-H3YHDYAMDY(SEQ ID NO: 16)·抗体 TeiA 1. 7(1 GH522 序列)轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQNLLNSGNQVNYLT(SEQ ID NO: 17)CDR-L2 WASTRESG(SEQ ID NO: 18)CDR-L3 QNDYRYPLT(SEQ ID NO: 19)重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTESDFYME(SEQ ID NO: 14)CDR-H2 ASRDKAKDYTTEYSASVKG(SEQ ID NO 20)CDR-H3 YFSYAMDY(SEQ ID NO 21)·抗体 TeiA 1. 8(1 GH 523 序列)轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSLTLLNSGSQTNYLT(SEQ ID NO 22)CDR-L2 WASTRESG (SEQ ID NO: 18)CDR-L3 QNDYSYPLT(SEQ ID NO 23)重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFTDQYMS(SEQ ID NO 24)CDR-H2 TIRNKAKGFTTEYSASVKG(SEQ ID NO 25)CDR-H3 YGNYAMDY(SEQ ID NO 26)·抗体 TeiA 2b. 6 (IGH524 序列)轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQLLFNSGRQTNYLT(SEQ ID NO 27)CDR-L2
WASTRGS (SEQ ID NO 28)CDR-L3 QNDYTYPLT(SEQ ID NO: 13)重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFTDFYME(SEQ ID NO 29)CDR-H2 ASRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO 30)CDR-H3 YRYYAMDY(SEQ ID NO 31)·抗体 TeiA 1. 1 (I GH525 序列)轻链可变区的⑶R CDR-Ll TSSQSLFNSGTQTNYLT(SEQ ID NO 32)CDR-L2 WASTRESG(SEQ ID NO: 18)CDR-L3 QNDYTYPLT (SEQ ID NO: 13)重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFSDFFIE(SEQ ID NO 33)CDR-H2 ASRNKNYDYKTEYSASVKG(SEQ ID NO 34)CDR-H3 YRHYAMDY(SEQ ID NO 35)本发明的⑶R不仅包括完全相同的那些，还包括变体，只要仍维持对A β 8_χ肽的特 异性即可。即，还可使用其中一个或多个氨基酸残基被修饰的CDR氨基酸序列作为CDR序 列。在CDR变体的氨基酸序列中，经修饰的氨基酸残基在整个CDR中优选为30 %或更少，更 优选为20%或更少，最优选为10%或更少。因此，可使用包括至少一个指定的⑶R或同源序列的任何抗体、片段、分子或配 体。CDR对于表位识别和抗体结合是最重要的。然而，可改变包括CDR的残基而不干扰 抗体识别和结合其相关表位的能力。例如，可进行不影响表位识别，而且增加抗体对表位的 结合亲和力的改变。基于一抗序列的知识、其特性(如结合和表达水平)，已有数个研究调查在抗体 序列中的各种位置处导入一个或多个氨基酸改变的影响(Yang，W. P.等人，1995，J. Mol. Biol.，254 392-403 ；Rader, C.等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :8910_8915 ； Vaughan, Τ. J.等人，1998，Nature Biotechnology, 16 :535_539)。在这些研究(所谓的亲和力成熟技术)中，已经通过使用方法例如寡核苷酸_介导的定点诱变、盒诱变、易错PCR、DNA改组或大肠杆菌的增变(mutator)株系，改变CDR1、 ⑶R2、⑶R 3或构架区中的重链和轻链基因的序列，来产生一抗的等价物(Vaughan，T. J.等 人，1998，Nature Biotechnology, 16 :535_539 ；Adey,N. B.等人，1996，第 16 章，第 277-291 M"Phage Display of Peptides and Proteins" ψ,Kay, B. K. ^A, Academic Press)。这些改变一抗的序列的方法，导致二抗的改良的亲和力(Gram，H.等人，1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 3576-3580 ；Boder, Ε. Τ.等人，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97 :10701-10705 ；Davies, J.禾口 Riechmann，L. ，1996， Immunotechnolgy，2 :169—179 ； Thompson, J.等人，1996，J. Mol. Biol.，256 :77_88 ；Short,M. K.等人，2002，J. Biol. Chem.， 277 16365-16370 ；Furukawa, K.等人，2001，J. Biol. Chem.，276 :27622_27628)。通过类似的改变抗体的一个或多个氨基酸残基的定向策略，本发明中描述的抗体 序列可用于开发与上文定义的A β 8_χ肽的N-末端区域特异性结合的抗体，其具有改良的 功能，包括对A β 8_χ肽的N-末端区域的改良的亲和力。优选的氨基酸置换是这样的置换，其(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对 氧化的易感性，(3)改变结合亲和力以形成蛋白质复合物，以及(4)赋予或修饰此类类似物 的其他物化或功能特性。类似物可包括天然存在的肽序列以外的序列的各种突变蛋白。例 如，可在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)进行单个 或多个氨基酸置换(优选保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换应基本上不改变亲本序列的 结构特征(例如替换的氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏表征亲本序 列的其他类型的二级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins， Structures and Molecular Principles (Creighton，编高辑，W. H. Freeman and Company, New York(1984)) ；Introduction to ProteinStructure (C. Branden 禾口 J. Tooze,编辑，Gar land Publishing, NewYork, N. Y. (1991))；以及 Thornton 等人，1991，Nature，354 :105 中， 其各自通过引用并入本文。经改良的抗体还包括具有经改良的特征的抗体，其可通过动物免疫、杂交瘤形成 和选择(针对具有特定特征的抗体)的标准技术来制备。还可使用经特别工程改造用于产生改良的抗体的细胞系。特别地，这些细胞 系具有改变的糖基化途径的调节，产生被极差岩藻糖基化或甚至完全去岩藻糖基化的 抗体。此类细胞系和用于工程改造其的方法公开于例如Shinkawa等人(2003，J.Biol. Chem. 278(5) :3466_3473)、Ferrara 等人(2006，J. Biol. Chem. 281 (8) :5032_5036 ；2006， Biotechnol.Bioeng. 93(5) :851_61)、EP 1331266、EP 1498490、EP 1498491、EP 1676910、 EP 1792987 和 WO 99/54342 中。在另一优选实施方案中，本发明涉及特异性结合A β 8_χ肽的N-末端区域的抗体， 所述抗体用选自放射性核素、荧光剂(fluor)、酶标记、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和半抗 原的化合物进行标记。在测定中使用的特定标记或可检测基团，通常不是本发明的重要方面，只要其不 显著干扰在该测定中使用的抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理 或化学特性的任何物质。在免疫测定领域中已良好开发此类可检测标记，并且通常，几乎任 何可用于此类方法的标记均可用于本发明的方法。因此，标记是可通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电、光、放射或化学方法检测的任何组合物。在本发明中有用的标记包括，但不限于磁珠(例如Dynabeads )、荧光染料 (例如荧光素异硫氰酸酯、德克萨斯红、罗丹明)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、 酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，以及在ELISA中常用的其他酶)，以及比色标记，如 胶体金、有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等等)珠粒。可根据在本领域中熟知的方法，将标记与期望的测定组份直接或间接偶联。如上 文指出的，可使用各种标记，且标记的选择取决于所需的敏感性、与化合物缀合的难易程 度、稳定性需求、可利用的仪器和处置规定。通常通过间接方法连接非放射性标记。通常，将配体分子(例如生物素)与抗体共价结合。然后使配体与抗配体(例如 链霉抗生物素蛋白)分子结合，所述抗配体分子是内在可检测的，或与信号系统(如可检测 的酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。可使用许多配体和抗配体。当配体具有 天然抗配体，例如生物素、甲状腺素和皮质醇时，可将它与经标记的天然存在的抗配体一起 使用。备选地，可将半抗原或抗原化合物与抗体组合使用。还可将抗体与产生信号的化合物直接缀合，例如与酶或荧光团缀合。可作为标记 的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基(dansyl)、伞形 酮等等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢二氮杂萘二酮，例如鲁米诺(Iuminol)。 其他标记或信号产生系统的综述可见于美国专利4，391，904中。检测标记的方法在本领域中是熟知的。因此，例如当标记为放射性标记时，检测方 法包括闪烁计数器或照相胶片(如在放射自显影中)。当标记为荧光标记时，其可通过用适 当波长的光激发荧光团，并检测所得的荧光来检测。可以通过目视、通过照相胶片、通过使 用电子检测器如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增器等来检测荧光。同样地，可通过对酶提供适当的底物并检测所得的反应产物，来检测酶标记。最 后，可通过观察与标记有关的颜色，简单地检测单纯的比色标记。在优选实施方案中，单克隆抗体是人源化的抗体。“人源化的抗体”意指经基因工程改造的抗体，其中将最少的来自小鼠抗体的小鼠 部分移植到人抗体上；通常，人源化抗体为5-10%小鼠和90-95%人类。人源化抗体具有对抗在利用小鼠和嵌合抗体时观察到的HAMA(人抗体抗小鼠抗 体)和HACA(人抗体抗嵌合抗体)应答的优点，并展现最少的人免疫系统抗其的应答或不 展现该应答。根据另一方面，本发明涉及产生上文定义的单克隆抗体(即，其特异性结合Αβ8_χ 肽的N-末端区域，并且不识别A β H0或A β i_42，且特别地，其可变区包括上文定义的氨基酸 序列对之一，并且其展现出高特异性)的杂交瘤。在优选实施方案中，上文定义的杂交瘤已经于2007年8月23日保藏在BCCM/LMBP比利时微生物协调保藏中心Department of Molecular BiologyGhent University' Fiers-Schell-Van Montagu' buildingTechnologiepark 927B-9052Gent-Zwi jnaarde
20
BELGIUM,登录号如下TeiA 1. 6 或 2. 6F4C2 (IGH521) — LMBP 6594CBTeiA 1. 7 或 2. 8A3F8 (IGH522) — LMBP 6595CBTeiA 1. 8 或 1. 3B12H3 (IGH523) — LMBP 6596CBTeiA 2b. 6 或 2. 13E5E4(I GH524) — LMBP 6597CBTeiA 1. 1 或 3. 46B10E7(I GH525) — LMBP 6598CB根据另一方面，本发明涉及肽制剂，其用于产生免疫应答从而引起抗体产生(其 有效减少淀粉状蛋白沉积物)，和用于分离单克隆抗体。“肽制剂”意指短的合成的肽，其具有模拟N-截短的A β肽的游离N-末端的游离 N-末端。所使用的肽如下Α β 8-χ模拟肽:SGYGVHHGC-KLH。其中KLH是钥孔虫戚血蓝蛋白，其通过二硫桥与半胱氨酸偶联。相应于Αβ的序 列用下划线表示，其后是间隔子氨基酸(其为甘氨酸)。Αβ8-χ类似于IGP-2119(PG127)表2。在磷酸盐缓冲液中混合肽制剂，并加入弗氏佐剂，用于腹膜内注射(图2)。在24 周后，通过TAPIR分析免疫应答(图3)，并通过Western印迹法测定对淀粉状蛋白负荷的影 响(图4)。根据另一方面，本发明涉及制备上文定义的抗体的方法，该抗体特异性结合Αβ8_χ 肽的N-末端区域，但不识别A β H2 (χ包括11到42，特别是15-42)，并展现高特异性，所述 方法包括用A β 8_χ肽和T-辅助表位(特别是与T-辅助表位融合的A β 8_χ肽)，或A β 8_χ分 支肽(特别是^8_15肽)免疫适当动物的步骤。表述“与T-辅助表位融合的A β 8_χ肽”意指根据Livingston等人，(2002)，使A β 8_x 肽与T-辅助表位(其含有用于与KLH偶联的末端半胱氨酸)连接。表述“Α β 8_χ分支肽”意指与含有末端半胱氨酸(用于与KLH偶联)的肽间隔子连 接的Αβ8_χ肽。对本领域技术人员而言，制备上文定义的抗体并不清楚，因为按照传统的方法，即 用五个肽(Α β i_8、A β 5_13、A β 6_14、A β 8_15和A β 9_17)免疫，不能分离出分泌特异性抗体的杂 交瘤，因此必须用A β 8_χ肽和T-辅助表位，特别是与T-辅助表位融合的A β 8_χ肽来免疫， 或用A β 8_χ分支肽免疫。在优选实施方案中，本发明涉及制备上文定义的抗体的方法，其中该抗体特异 性结合A β 8_15肽的N-末端区域，不识别A β i_42，且其对A β 5肽展现出高亲和力，如在 Western印迹法中测定的。“Western印迹法”是在给定的组织勻浆或提取物样品中检测特定蛋白质的方法。根据另一方面，本发明涉及特异性结合A β 8_χ肽的N-末端区域的抗体，其例如通 过上文定义的方法获得。根据另一方面，本发明涉及体外测定哺乳动物中的淀粉状蛋白负荷的方法，其包 括下列步骤(i)使用如上文定义的抗体，定量所述哺乳动物的体液中N-末端截短的A β 8_χ的水平，(ii)将所述哺乳动物的抗体水平与利用对照哺乳动物获得的那些相比较，并(iii)从步骤(ii)推断所述哺乳动物是否患神经学疾病，如果与在对照哺乳动物 中测量到的水平相比，该N-末端截短的Αβ 8_x水平发生了改变，特别是比在对照哺乳动物 中测量到的水平更高。在本发明中检查的哺乳动物，可以是非人哺乳动物，例如(但不限于)牛、猪、绵 羊、山羊、马、猴子、兔、野兔、狗、猫、小鼠、大鼠、麋鹿、鹿或虎。在优选实施方案中，哺乳动物 为灵长类动物。在优选实施方案中，上文定义的方法的哺乳动物为人类，更优选地，哺乳动物为成 人。在另一优选的实施方案中，本发明涉及上文定义的方法，其中所述抗体对Αβ8_42 的特异性和敏感性高于60%，优选地包括大约60到大约100%，更优选地包括80%以上。术语“敏感性”意指该方法可检测的A β 8_42肽的检测程度。(参见Neurobiology of aging, Vol 19, N° · 2, pl09_116,1998 :Consensusreport of the working group on: "Molecular and biochemicalmarkers of AD”)。该研究小组设定了 AD诊断试剂盒的标 准，并提到，敏感性和特异性应> 80%。在另一优选的实施方案中，上文定义的方法的体液是脑脊髓液(CSF)或血液。术语“脑脊髓液”或“CSF”意欲包括本领域技术人员熟知的完整脑脊髓液或其衍 生物或级分。因此，脑脊髓液样品可包括脑脊髓液的各种分级形式，或可包括添加以便于贮 存或在特定测定中的处理的各种稀释剂。此类稀释剂为本领域技术人员所熟知，并包括各 种缓冲剂、防腐剂等。根据另一方面，本发明涉及方法，其用于测定哺乳动物中对与淀粉状蛋白形 成和/或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)的易感性、用于测定哺乳动物中发展出与
淀粉状蛋白形成和/或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)的风险、用于在哺乳动物中 筛选淀粉状蛋白沉积的清除，或用于在哺乳动物中预测淀粉状蛋白负荷的水平，所 述方法包括下列步骤(i)用上文定义的抗体测定所述哺乳动物中肽A β 8_x的量，(ii)将在步骤⑴中测定的量，与对照哺乳动物中对所述Αβ8_χ肽的N-末端区域 特异的抗体的量相比较，和(iii)根据步骤(ii)中的比较推断，所述哺乳动物是否对与淀粉状蛋白形成 和/或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)易感、所述哺乳动物是否处于发展出与淀 粉状蛋白形成和/或聚集有关的疾病(如阿尔茨海默病)的风险中、是否清除了哺乳动物 中的淀粉状蛋白沉积，或所述哺乳动物中淀粉状蛋白的水平是多少。在受试哺乳动物的脑中，N-末端截短的Αβ8_χ的水平的增加，例如可能代表该哺 乳动物对与淀粉状蛋白形成和/或聚集有关的疾病易感或处于发展其的风险中。其还 可表示该哺乳动物中的Αβ沉积尚未清除。在接种疫苗或治疗之后，某些体液中的增加的N-末端截短的A β 8_χ的水平，代表 Αβ负荷的水平(DeMattos等人，2002)。N-末端APP可溶性片段主要发现于某些体液中。 这些N-末端APP可溶性片段的存在，代表APP的异常切割，从而导致形成了 N-末端截短的Αβ变体，并因此增加了哺乳动物对与淀粉状蛋白形成和/或聚集有关的疾病的易感 性，或增加了发展出该疾病的风险。在优选实施方案中，使用上文定义的方法，测定在获自该哺乳动物的组织样品中， 对A β 8_χ肽的N-末端区域特异的抗体的量。“组织”意指脑组织。根据另一方面，本发明涉及包括至少一种缓冲剂和至少一种检测化合物、至少一 种如上文定义的N-截短的Αβ 8_χ特异性抗体的试剂盒。在优选实施方案中，上文定义的试剂盒还包括优选经标记的二抗，其与上文定义 的抗体结合。例如，抗体可直接与固体基质结合，并固定于其中。然后这些经固定的抗体捕获样 品中的本发明的N-末端截短的Αβ 8_χ肽，其随后用二抗进行检测。在另一方面中，本发明涉及治疗组合物，其包括作为活性成分的上文定义的抗体， 或合成的肽(其带有模拟N-截短的A β肽的游离N-末端的游离N-末端)，以及药学上可 接受的媒介物。施用或递送至个体的抗体的量，应该足以在该个体的脑中引起淀粉状蛋白水 平的显著降低。适当的量取决于各种参数(例如所使用的特定抗体、个体的重量和内源 β "淀粉状蛋白的水平)，且必须逐例测定。施用的剂量和频率还可视该治疗是预防性还是治疗性的而改变。在优选实施方案中，上文定义的治疗组合物适合于以lmg/kg/天到200mg的抗体 剂量施用给个体。接受治疗的患者包括处于患病风险中但没有显示出症状的个体，以及当前已显示 出症状的患者。在阿尔茨海默病的情况下，几乎任何人都处于患阿尔茨海默病的风险中，只 要他或她活得足够长。因此，可预防性地将本发明的抗体施用给大众，而不需要任何受试患 者的风险评估。本发明的抗体对于具有阿尔茨海默病的已知遗传风险的个体是特别有用 的。此类个体包括具有已经经历该疾病的亲戚的那些，以及其风险通过遗传或生化标记的 分析得到测定的那些。可经由静脉内施用，将根据本发明的抗体施用给个体。另一递送至脑的方式，是将根据本发明的抗体直接输注入个体的脑内。根据另一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包括作为活性成分的上文定义的抗体、 其片段或衍生物，或合成的肽(其带有模拟N-截短的Αβ肽的游离N-末端的游离N-末 端)，以及药学上可接受的媒介物。在优选实施方案中，上文定义的疫苗组合物适合于以lmg/kg/天到200mg/kg/天 的抗体剂量施用给个体。本发明的疫苗或治疗组合物诱导抗本发明的特异的N-末端截短的Αβ 8_x肽的免 疫应答。根据另一方面，本发明涉及至少一个上文定义的抗体用于制备药物或疫苗的用 途，所述药物或疫苗意欲用于预防或治疗阿尔茨海默病。当在本文中使用时，术语“预防疾病”意指抑制或逆转疾病的发作、抑制或逆转疾 病的起始征兆(即Αβ变体的形成和/或聚集)、抑制疾病的临床症状的出现。
当在本文中使用时，术语“治疗疾病，，包括基本上抑制疾病、基本上减缓或逆转疾 病的进程、基本上缓解疾病的临床症状，或基本上预防疾病的临床症状的出现。根据另一方面，本发明涉及至少一个上文定义的抗体用于制备药物或疫苗的用 途，所述药物或疫苗意欲用于清除淀粉状蛋白负荷。术语“清除β-淀粉状蛋白负荷”意指从脑组织中消除β-淀粉状蛋白负荷。使 用抗Αβ肽的疫苗清除AD患者的脑中的淀粉状蛋白沉积物，是一种新颖的方法，其打开 了治疗前景(Schenk 等人，2001，Immunotherapy with beta-amyloid for Alzheimer' s disease :a newfrontier. DNA Cell Biol. 20 :679_681)。根据另一方面，本发明涉及在哺乳动物中清除淀粉状蛋白负荷的方法，包括 对该哺乳动物施用上文定义的组合物。根据另一方面，本发明涉及上文定义的肽组合物的用途，其用于在患有或易于发 展阿尔茨海默病的哺乳动物中诱导免疫应答。


图1代表ΑΡΡ770的部分氨基酸序列，展示了 Αβ的氨基酸序列，并指出了 α-、 β-和Y-分泌酶切割位置。图2Α和2Β代表腹膜内注射肽制剂的计划表(2Α)，以及每次采血测量到的抗体滴 度(2Β)。χ-轴血清稀释度y_轴光密度图3A到3D代表使用经免疫的小鼠血清来检测在双重转基因的APPxPS 1小鼠的脑 组织中有没有淀粉状蛋白沉积物图3A和3B 无应答的小鼠血清(放大率分别为x25和xlOO)，图3C和3D :Trunc8免疫的小鼠血清(放大率分别为x25和xlOO)。图4A和4B代表通过Western印迹法在经免疫的和对照小鼠中测量到的A β负荷 (4Α)，以及代表免疫效率(表示为Αβ -42负荷对对照条件(PBS)的百分比)的直方图。图5为轻链和重链的引物位置的图解概述。图6代表人类阿尔茨海默病脑的甲酸提取物，以及“全_尺寸”合成的A β肽的 混合物(Α β 2_42、A β 3-42> A β 4_42、A β 5_42、A β 7_42、A β 8_42、A β 9_42)的 2D 凝胶分析(用等价于 21F12(A3 H2)的 7G12(如 Sergeant 等人(2003)所述)、TeiA 1. UTeiA 1. 8 和 TeiA 2b. 6 获得的免疫印迹)。图 7 代表 4D7A3 (42-C-末端特异性抗体)和 TeiA 2b. 6、TeiA 1. 8、TeiAl. 7 和 TeiAl. 6的免疫捕获抗体。图8A和8B代表单克隆抗体TeiAl. 6对实质淀粉状蛋白的特异性。8A 经典的A β 抗体6Ε10标记实质淀粉状蛋白沉积物(箭号)和血管淀粉状蛋白沉积物(箭头)。8Β:8-截短的Αβ (TeiAl. 6)仅标记实质(箭号)淀粉状蛋白沉积物，但不标记邻 近脑切片中的血管周围的沉积物(箭头)。图9A至9J代表对7个月龄小鼠n° 47颅内注射(右海马)4G8抗体(商购的单 克隆抗体)的结果。
9A、9D和9G 关于注射点的脑切片位置。9B、9E和9H 相应的脑切片的免疫组织化学图像，其显示用“揭示性”抗体6E10检 测到的淀粉状蛋白肽沉积物。9C、9F和91 在每个大脑半球的不同的脑亚区域中(Hipp 海马，Cxl 皮质区1(背 侧)，Cx2 皮质区2 (侧面)，Cx3 皮质区3 (侧腹面)，Th 丘脑)，分别根据图像9B、9E和 9H计算的淀粉状蛋白肽负荷。比率染色面积/该区域的总面积。1^:左，1 :右(注射)。9J 在每个大脑半球的下托中，通过仅脑切片H中的免疫化学计算的淀粉状蛋白 肽负荷。图IOA至IOJ代表对7个月龄小鼠n° 17颅内注射(右海马)TeiAl. 6抗体。10AU0D和IOG 关于注射点的脑切片位置。10B、IOE和IOH 相应的脑切片的免疫组织化学图像，其显示用“揭示性”抗体4G8 检测到的淀粉状蛋白肽沉积物。10CU0F和101 在每个大脑半球的不同的脑亚区域中(Hipp 海马，Cxl 皮质区 1 (背侧)，Cx2 皮质区2 (侧面)，Cx3 皮质区3 (侧腹面)，Th 丘脑)，分别根据图像10B、 IOE和IOH计算的淀粉状蛋白肽负荷。比率染色面积/该区域的总面积。L 左，R 右。IOJ 在每个大脑半球的下托中，通过仅脑切片B和E中的免疫化学计算的淀粉状 蛋白肽负荷。图11代表在颅内注射(右海马)TeiA 1. 6单克隆抗体之后，在不同脑亚区中 (Hipp :海马，Cxl :皮质区1 (背侧)，Cx2 皮质区2 (侧面)，Cx3 皮质区3 (侧腹面)，Th 丘脑)，注射(TeiA i.6抗体)和未注射(对照)之间的淀粉状蛋白负荷的比率。这是4只 动物的比率的平均值，其中每只动物均定量三个脑切片(数据表示平均值士SEM)。图12A到12J代表对7个月龄小鼠n° 58颅内注射(右海马)TeiAl. 8抗体。12AU2D和12G 关于注射点的脑切片位置。12B、12E和12H 相应的脑切片的免疫组织化学图像，其显示用“揭示性”抗体4G8 检测到的淀粉状蛋白肽沉积物。12C、12F和121 在每个大脑半球的不同的脑亚区域中(Hipp 海马，Cxl 皮质区 1 (背侧)，Cx2 皮质区2 (侧面)，Cx3 皮质区3 (侧腹面)，Th 丘脑)，分别根据图像12B、 12E和12H计算的淀粉状蛋白肽负荷。比率染色面积/该区域的总面积。L 左，R 右。12J 在每个大脑半球的下托中，通过仅脑切片H中的免疫化学计算的淀粉状蛋白 肽负荷。图13代表在颅内注射(右海马)TeiA 1. 6单克隆抗体之后，在不同脑亚区中 (Hipp 海马，Cxl 皮质区1 (背侧)，Cx2 皮质区2 (侧面)，Cx3 皮质区3 (侧腹面)，Th 丘脑)，注射(TeiA 1.8抗体)和未注射(对照)之间的淀粉状蛋白负荷的比率。这是4只 动物的比率的平均值，其中每只动物均定量三个脑切片(数据表示平均值士SEM)。实施例实施例1 用N-trunc 8 flt制剂免,疮双重转某因小鼠，以及对脑淀粉状蛋白命、荷的 影响每三周用 50 μ g N-Trunc 8 肽注射双重 APP Swedish London xPresenilin 1 转 基因小鼠(Blanchard 等人，2003 Exp Neurologyl84 247 ；WO 0120977)(图 2A)。整个免疫 持续时间为21周。分别用磷酸缓冲生理盐水或聚集的Αβ 注射一系列小鼠，作为阴性 和阳性对照。通过抗Trimc 8肽的直接ELISA测定抗体滴度(图2B)。使用来自经免疫的小鼠的第五次采血的血清，进行组织淀粉状蛋白斑免疫反应性 (TAPIR) (Christoph Hock,Roger Μ. Nitsch,Clinical Observations with AN-1792U sing TAPIR AnalysesNeurodegenerative Diseases 2005 ;2 :273_276)(图 3)。使用来自无应答 的小鼠的血清作为阴性对照。用获自经Trunc-8肽免疫的小鼠的血清检测淀粉状蛋白沉积物。使用Αβ肽的甲酸提取物，检查免疫对Αβ负荷的影响，并如之前所述通过 Western印迹法进行检测(Casas等人，2004)(图4A)。测量A β -42的总量并与对照条件 (PBS)相比较，并表示为相对于对照条件(100% )的百分比。直方图代表每个实验条件的 定量(图4Β)。实施例2 来自杂交瘤IGH524、IGH525、IGH521、IGH522、IGH523的单克降抗体可 变区的表征通过将适当的开放读框翻译成氨基酸序列，并与共有抗体重链和轻链构架区比 对，评估DNA序列分析的结果。数据分析用 Sequencing Analysis Software v5. 2 (Applied Biosystems)禾口 KB basecaller vl. 2 (Applied Biosystem)产生原始测序数据(DNA色谱)，并使用 Sequencher 4. 1.2进行解释和编辑。通常，组装双链的测序结果，并将共有序列与Innogenetics Lotus Notes CustomSequencing Service Request (CSSR)数据库链接，然后用分配的 CSSR计划编 号进行储存。结果RNA分离、RT-PCR、克隆和保藏。表1显示，对于每个杂交瘤/MAb，用于RNA提取的细胞的起源和来源，并显示每个 抗体重链或轻链的相对应的引物组合，其成功地产生特定的可克隆的PCR片段。序列分析对于每个可变区，DNA序列分析和后续的比对显示每个杂交瘤/MAb的可能的共有 序列。对于说明一个可变区的所有克隆，互补决定区(CDR)都是相同的。在附录1中提供所获得的最终共有序列的概要和比对。指出了理论上预测的CDR 环(基于共有序列规则)。·基于来自Kabat定义(Reczko等人，1995)的一组公众可获得的规则，或公众可 获得的用于建模的分析工具(Honegger等人2001)，分配在共有序列中标记的互补决定区 (⑶R)。仅为了探讨/非正式用途而标记⑶R。IGH524, TeiA 2b. 6对于分离自杂交瘤IGH524的MAb TeiA 2b. 6 (2. 13E5E4)的重链和轻链，获得的结果是清楚的，只有少许的模糊和/或差异(主要位于构架区)。已经测定完整的可变区，并 通过经纯化的抗体的N-末端氨基酸测序，证实了两种成熟抗体链的N-末端(包括最大部 分的CDR1)。IGH521(TeiA 1. 6)、IGH522 (TeiA 1. 7)、IGH523 (TeiA 1. 8)、IGH525 (TeiA 1.1)MAb TeiA 1. 6 (2. 6FAC2, IGH521) , TeiA 1. 7 (2. 8A3F8, IGH522) , TeiA 1. 8(1. 3B12H 3，IGH523)和 TeiA 1. 1(3. 46B10E7, IGH525)的所有重链和轻链的结果也是 清楚的。比对经克隆的PCR产物的八个序列，并且至少三个相同的序列产生共有序列。已 经通过与获自杂交瘤IGH524的序列比对，测定完整的可变区。表1 PCR 引物 Kabat 等人(Sequence s of proteins of immunological interest. National Institutes of Health Publication No. 91-3242,5th ed. ,1991, United States Department of Health and Human Services，Bethesda，MD)Coloma 等 人(Novel vectors for the expression of antibodymolecules regions generated by polymerase chain reaction. J. Immunol Methods，1992 ; 152 (1) 89-104)Orlandi 等人(Cloning immunoglobulin νariabledomains forexpression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad SciU S A. 1989May ；86 (10) :3833_7)
附录 1 I GH524 序列轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASRGSGVPCDR-L3DRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG(SEQ ID NO 7)重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYTTEYSACDR-H3SVKGRFIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO 8)IGH521 序列轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDSGVCDR-L3PDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG(SEQ ID NO 1)重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASCDR-H3VKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO 2)
IGH525 序列轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPCDR-L3DRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG(SEQ ID NO 9)重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYKTEYSASCDR-H3VKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 10)IGH522 序列轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVCDR-L3PDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG(SEQ ID NO 3)重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTTEYSACDR-H3SVKGRFIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLGTSVTVSS(SEQ ID NO 4)IGH523 序列轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPCDR-L3DRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG(SEQ ID NO 5)重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTDQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFTTEYSACDR-H3SVKGRFTISRDNSQSILYLQMSTLRA⑶SATYYCAVYGNYAMDYWGQGTSVNVSS(SEQ ID NO:6)实施例3 :N-截短的8-特异性Αβ抗体和克隆期间的(有限)特征用5个短的合成的Αβ肽的混合物注射15只Bal b_C小鼠(每只小鼠50 μ gKLH偶
联的肽)。一只小鼠死于不明原因。肽分别相应于A β i_8、A β 5_13、Α β 6_14、Α β 8_15和A β 9_17的前8个N-末端残基(参见表2)。肽还含有用于与KLH偶联的C-末端残基。在5次注射后， 在肽混合物的'包被测定'中进行血清的滴定。将肽包被为链霉抗生物素蛋白-生物素化 的肽复合物(肽(IGP-2258，参见表2))或BSA(牛血清白蛋白)_肽复合物(PG-Nr，参见表 2)，并使用与HRP偶联的抗小鼠抗体(Jackson山羊抗小鼠HRP，目录编号115-035-071)进 行检测。虽然滴度很低(未显示)，但处死第一只小鼠并进行融合。没有分离出分泌特异性 抗体的杂交瘤。因此，用'经修饰的肽'加强每组的小鼠。用原始肽混合物注射三只小鼠，用 IGP-2119KLH-偶联的肽(参见表2)进一步注射两只小鼠。相应于Αβ8_15的肽在五个混合物中是较具免疫原性的，因此合成三个另外的肽。 一个相应于 A β 卜8，其与 T-辅助表位(PGPGP (Livingston 等人，2002) ；IGP-2406 (表 2)) 和C-末端半胱氨酸残基(以便与KLH偶联)融合。另一个肽还含有另一个T-辅助表位 (D⑶⑶(McMiLLan等人，1983) ； IGP-2258 (表2))。最后，还合成了分支肽，其含有用于偶联 的C-末端半胱氨酸(IGP-2407 (表2))。使用新合成的肽，每次免疫两只小鼠。Αβ 8_15肽还与El颗粒(W02004/013172)偶 联，并用于加强最后两只小鼠。再次用'包被测定'监控滴度(结果未显示)。在用T-辅 助肽和分支肽加强的小鼠中，确实改善了对Αβ8_15的滴度，并决定使用所有三只存活小鼠 进行融合。一只用分支肽加强的小鼠死亡。表2 所使用的肽的序列及其Irmogenetics参考编号 制备小鼠的脾脏并将其与SP2/0细胞融合。在铺板后，筛选66个平板(士3000 个克隆)。在亚克隆期间，在桥接测定和Luminex测定中，使用生物素化的肽IGP-2258和 IGP-2259表征有限数目的克隆(24个)。在桥接测定中，使用与BSA偶联的肽IGP-128、 PG127(参见表3)来捕获抗体的一个结合位置，并在所谓的桥接测定中使用生物素化的肽 检测所捕获的抗体。该测定提供了抗体的亲和力的指标高亲和力抗体将产生比低亲和力抗体更高的信号。事实上，已鉴定了 ‘两个种类’的抗体。为测定抗体的特异性，使用这样的肽，其与Αβ 8_15相比，向N-末端移动了两个氨 基酸，即Αβ6_13肽。使用这些肽的生物素化形式，以便有效地将其捕获至抗生物素蛋白 Luminex珠。在清洗之后，通过抗小鼠藻红蛋白抗体显示该抗体。表3中呈现的结果是表 示为平均荧光强度(MFI)的原始数据。低于10的值表示低于背景，因此对于具有‘低亲和 力’的所有受试抗体(桥接测定OD < 1)，没有观察到与非特异性肽(IGP-2259)的反应。对于'高亲和力抗体'，在非特异性肽上可测量到小的信号，且在抗体之间有微 小差异。从'高亲和力'种类的抗体中选择三个抗体用于亚克隆，一个是IgG2b亚型，两 个是IgGl，同时从'低亲和力'抗体中选择两个IgGl抗体，从而产生五个抗体用于完全表 征。表3 :N-截短的8-特异性A β，TeiA(截短的8淀粉状蛋白)抗体在克隆期间的表 征。确定同种型，在桥接测定中的反应性(高OD代表高亲和力)和在Luminex格式中的特 异性(对捕获在抗生物素蛋白珠粒上的生物肽)。还指出用于进一步表征的最终亚克隆。 实施例4 =N-截短的8特异性(TeiA)抗体的表征为了进一步证实这些TeiA抗体对A β的特异性，采用两种方法(1)人类阿尔茨 海默病脑的甲酸提取物的2D凝胶分析，和(2)差异在于其N-末端的‘全-尺寸’合成的Αβ 肽的混合物(Anaspec)，用于SELDI方法(Merchant等人，2000)中。在图6&7中展示这些方法的结果。基本上如Sergeant等人(2003)中所述，进行 脑组织取样和2D分析。为揭示A β 42肽的位置，使用新的42-C-末端特异性抗体7G12H1 (等价于Sergeant等人(2003)中描述的21F12)。已经利用质谱分析表征不同的点，以与在图6上呈现的不同 的N-截短物相对应。实施例5 ;mAb TeiAl. 6 (Α β N-trunc8)特异于实质淀粉状蛋白沉积物，佰不识别 血管淀粉状蛋白沉积物被动免疫的副作用之一是频繁的微出血。微出血数量上的此类增加，可通过注射 的抗体固定在血管壁内聚集的Αβ肽上来解释(Paris等人，2000 ；Pfeifer等人，Cerebral Hemorrhage After PassiveAnti-A β Immunotherapy, Science 15 November 2002 ； Vol. 298. no. 5597，p. 1379)。因此，截短的A β种类也是原始靶标，因为其不主要发现于淀 粉状蛋白血管病变中。如图8Α和8Β中所证实的，在邻近的人类AD脑切片中，经典的Αβ 抗体标记实质和血管的淀粉状蛋白沉积物(Α，分别为箭号和箭头，6Ε10抗体)。使用经截短的8抗体(B，在此为TeiAl. 6)，仅标记实质淀粉状蛋白沉积物(B，箭 号)，而不标记血管淀粉状蛋白沉积物(B，箭头)。总之，这些数据表明氨基8-截短的Αβ抗体特异地靶向实质淀粉状蛋白沉积物， 且不与血管淀粉状蛋白沉积物(已表明其负责在其他抗Αβ免疫方法中观察到的血管周围 效应(出血、脑病))相互作用。实施例6将N-截短的8特异t牛(TeiA)杭体颅内施用至转某因小鼠中导致糖粉 状蛋白斑负荷的降低为了证实TeiA抗体的治疗功效，将其注射入转基因小鼠(其在脑中带有淀粉状蛋 白斑)的海马中，并在施用后7天，通过免疫组织化学定量大脑淀粉状蛋白肽斑负荷。简而 言之，在立体定位的条件下，将1或2 μ g抗体注射至ThyAPPaXPSIm4fa小鼠(Blanchard等 人，2003ExpNeurology 184 247 ；WO 0120977)的右海马中(单侧注射)。所注射的抗体为 两种商购的经典A β抗体(4G8和6Ε10)，以及TeiA抗体=TeiAl. 1、1. 6、1. 8和2b. 6。注射后7天，使动物安乐死，并处理脑以进行免疫组织化学分析。在脑后固定后， 进行40微米的冠状冷冻切片，并每隔400微米用生物素化的4G8抗Αβ (作为“揭示性”抗 体)对切片染色，以评估存在于脑中的淀粉状蛋白负荷。在已经将4G8抗体注射到脑中的 情况下，所使用的揭示性抗体为生物素化的6Ε10，以避免表位掩蔽。利用标准抗生物素蛋 白-过氧化物酶检测试剂盒(Vectastain ABC kit VectorLaboratories)检测生物 素化的抗体。在每个脑切片中，在每个大脑半球(注射和未注射)的五个不同的脑亚区[海马、 皮质区1 (背侧)、皮质区2 (侧面)、皮质区3 (侧腹面)和丘脑]中，计算淀粉状蛋白肽负 荷。在Olympu s扫描系统上获得图像之后，用Mercator ExploraNova系统半自动地进行定 量。对于每只动物，定量三个脑切片，所述切片相对于注射点的位置十分类似一个邻近注 射点，一个在注射点的吻端，且一个在尾端。如之前描述的(Wilcock等人，2003，J Neurosci 23 3745 ；Oddo等人，2004，Neuron43 :321)，4G8注射在注射的大脑半球中，当与未注射的大 脑半球相比较时，导致淀粉状蛋白肽沉积物的显著减少(图9)。该影响在脑切片之间是可 变的，如可根据抗体的局部注射预期的。TeiAl. 6抗体还在注射侧导致脑淀粉状蛋白的显著 减少，这在该系列实验的皮质区3中更为显著(图10)。4只小鼠(7个月龄)的分析表明 显著的减少(图11)。同样地，TeiAl. 8在注射侧导致脑淀粉状蛋白的显著减少，这在该系列实验的皮质区2中更为显著(图12)。4只小鼠(7个月龄)的分析表明显著的减少(图13)。这些数据表明，即使是在短期施用之后，TeiA抗体1. 6和1. 8也降低了脑淀粉状 蛋白负荷，且比得上经典抗Αβ抗体。值得注意的是，动物在施用时已呈现显著的淀粉状蛋 白沉积，因此暗示TeiA抗体是治疗性的，而不是仅有预防潜能。因此，TeiA抗体可在阿尔茨海默病患者中，提供良好的抗淀粉状蛋白负荷的治疗 效果。
3权利要求
一种抗体，其特异性结合Aβ8-x肽的N-末端区域，且不识别Aβ1-40或Aβ1-42，其中x包括11到42。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体对Aβ 8_χ肽的游离N-末端展现高特异性。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体对Αβ8_χ肽展现出高亲和力。
4.权利要求1至3的任一项的抗体，其中所述抗体特异地靶向脑中的Αβ8_χ肽的实质 淀粉状蛋白沉积物，但不与血管淀粉状蛋白沉积物相互作用。
5.权利要求1至4的任一项的抗体，其中χ包括15到42，特别是单克隆抗体。
6.权利要求1至5的任一项的抗体，其中可变区包括分别相应于轻链和重链的下列氨 基酸序列对之一 抗体TeiAl. 6 (由杂交瘤IGH521分泌) 轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLAGRYQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTCDR-L3RDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFAG (SEQ ID NO 1) 重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCAISGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTCDR-H3EYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCATYHDYAMDYWGQ GTSVTVSS(SEQ ID NO 2) 抗体TeiAl. 7 (由杂交瘤IGH522分泌) 轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMNCKSSQNLLNSGNQVNYLTWFQQKPGQPPKLLIYWASTCDR-L3RESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYRYPLTFGAG (SEQ ID NO 3) 重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGRRLEWIAASRDKAKDYTTCDR-H3EYSASVKGRFIVSRDTSQSIFYLQMNALRSEDTAIYYCATYFSYAMDYWGLG TSVTVSS(SEQ ID NO 4) 抗体TeiAl. 8 (由杂交瘤IGH523分泌) 轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLAVTAGERVTMSCKSSLTLLNSGSQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRCDR-L3ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAG (SEQ ID NO 5) 重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATAGFTFTDQYMSWVRQPPGKALEWLATIRNKAKGFTCDR-H3TEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMSTLRAiiDSATYYCAVYGNYAMDYWG QGTSVNVSS(SEQ IDNO 6) 抗体TeiA 2b. 6 (由杂交瘤IGH524分泌) 轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGRQTNYLTWFQQRPGQAPKLLIYWASTRCDR-L3GSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG (SEQ ID NO 7) 重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANGYTCDR-H3TEYSASVKGRIVSRDTSQGILYLQMSALRAEDTAIYYCAIYRYYAMDYWGQ GTSVTVSS(SEQ ID NO 8) 抗体TeiA 1. 1 (由杂交瘤IGH525分泌) 轻链可变区CDR-LlCDR-L2SSLTVTAGEKVTMSCTSSQSLFNSGTQTNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRCDR-L3LSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAG (SEQ ID NO 9) 重链可变区CDR-HlCDR-H2GGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFFIEWVRQPPGKRLEWITASRNKNYDYKCDR-H3TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAIYRHYAMDYWGQ GTSVTVSS(SEQ ID NO 10)。
7.权利要求1至6的任一项的抗体，其中可变区的轻链和重链的CDR包括下列氨基酸 序列之一 抗体 TeiA 1. 6 (IGH521 序列) 轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQSLLAGRYQKNYLT(SEQ ID NO 11) CDR-L2 WASTRDSG(SEQ ID NO 12) CDR-L3 QNDYTYPLT(SEQ ID NO 13) 重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFSDFYME(SEQ ID NO 14) CDR-H2 ASRNKANDYTTEYSASVKG(SEQ ID NO 15) CDR-H3YHDYAMDY(SEQ ID NO 16) 抗体 TeiA 1. 7 (IGH522 序列) 轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQNLLNSGNQVNYLT(SEQ ID NO 17) CDR-L2 WASTRESG(SEQ ID NO 18) CDR-L3 QNDYRYPLT(SEQ ID NO 19) 重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFSDFYME(SEQ ID NO 14) CDR-H2 ASRDKAKDYTTEYSASVKG(SEQ ID NO 20) CDR-H3 YFSYAMDY(SEQ ID NO 21) 抗体 TeiA 1. 8 (IGH523 序列) 轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSLTLLNSGSQTNYLT(SEQ ID NO 22) CDR-L2 WASTRESG(SEQ ID NO 18) CDR-L3 QNDYSYPLT(SEQ ID NO 23) 重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFTDQYMS(SEQ ID NO 24)CDR-H2 TIRNKAKGFTTEYSASVKG(SEQ ID NO 25) CDR-H3 YGNYAMDY(SEQ ID NO 26) 抗体 TeiA 2b. 6 (IGH524 序列) 轻链可变区的⑶R CDR-Ll KSSQSLFNSGRQTNYLT(SEQ ID NO 27) CDR-L2 WASTRGS(SEQ ID NO 28) CDR-L3 QNDYTYPLT(SEQ ID NO 13) 重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFTDFYME(SEQ ID NO 29) CDR-H2 ASRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO 30) CDR-H3 YRYYAMDY(SEQ ID NO 31) 抗体 TeiA 1. 1 (IGH525 序列) 轻链可变区的⑶R CDR-Ll TSSQSLFNSGTQTNYLT(SEQ ID NO 32) CDR-L2 WASTRESG(SEQ ID NO 18) CDR-L3 QNDYTYPLT(SEQ ID NO 13) 重链可变区的⑶R CDR-Hl GFTFSDFFIE(SEQ ID NO 33) CDR-H2 ASRNKNYDYKTEYSASVKG(SEQ ID NO 34) CDR-H3 YRHYAMDY(SEQ ID NO 35)。
8.权利要求1至7的任一项的抗体，其中所述抗体用选自下列的化合物进行标记放 射性核素、荧光剂、酶标记、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和半抗原。
9.权利要求1至8的任一项的抗体，其为人源化抗体。
10.一种杂交瘤，其产生权利要求1至7的任一项的抗体。
11.权利要求10的杂交瘤，其中所述杂交瘤已经于2007年8月23日保藏在BCCM/LMBP比利时微生物协调保藏中心，其登录号如下TeiA 1.6 或 2. 6F4C2(IGH521) — LMBP 6594CB TeiA 1.7 或 2.8A3F8(IGH522) — LMBP 6595CB TeiA 1. 8 或 1. 3B12H3(IGH523) — LMBP 6596CB TeiA 2b.6 或 2.13E5E4 (IGH524) — LMBP 6597CB TeiA 1.1 或 3. 46B10E7 (IGH525) — LMBP 6598CB。
12.—种肽制剂，其用于产生免疫应答，从而引起抗体产生，所述抗体产生有效地减少 淀粉状蛋白沉积物，和用于分离抗体，并且其由Αβ8-χ模拟肽:SGYGVHHGC-KLH组成。
13.制备权利要求1至9的抗体的方法，所述抗体特异性结合Aβ 8_χ肽的N-末端区域， 但不识别Αβ i_42，χ包括11至42，特别是15至42，所述抗体展现高特异性，所述方法包括 用A β 8_χ肽和T-辅助表位，特别是与T-辅助表位融合的A β 8_χ肽，或A β 8_χ分支肽，特别是 A β 8_15肽免疫适当的动物的步骤。
14.权利要求13的制备抗体的方法，其中所述抗体特异性结合至Aβ 8_15肽的N-末端 区域，但不识别A β i_42，并且所述抗体对A β 8_15肽展现出高特异性，如在Western印迹上测 定的。
15.一种抗体，其特异性结合至A β 8_x肽的N-末端区域，且其例如通过权利要求13或 14中定义的方法获得。
16.体外测定哺乳动物中的淀粉状蛋白负荷的方法，其包括下列步骤(i)使用权利要求1至9或15中的任一项的抗体，定量所述哺乳动物的体液中的N-末 端截短的A β 8_x的水平，( )将所述哺乳动物的抗体水平与用对照哺乳动物获得的水平相比较，和 (iii)根据步骤(ii)推断所述哺乳动物是否患有神经学疾病，条件是该生物标记水平 相对于对照哺乳动物中测量到的水平发生改变，特别是比对照哺乳动物中测量到的水平更 尚ο
17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人类。
18.权利要求16或17的方法，其中所述抗体对Aβ 8_42的特异性和敏感性高于63%，优 选地包括大约63到100 %，更优选地包括大约75 %到85 %，和更优选地包括85 %到100 %。
19.权利要求16至18的任一项的方法，其中所述体液为脑脊髓液(CSF)或血液。
20.一种方法，其用于测定哺乳动物中对与淀粉状蛋白形成和/或聚集有关的疾病 例如阿尔茨海默病的易感性、用于测定哺乳动物中发展出与β -淀粉状蛋白形成和/或聚 集有关的疾病例如阿尔茨海默病的风险、用于在哺乳动物中筛选β “淀粉状蛋白沉积的清 除、或用于在哺乳动物中预测淀粉状蛋白负荷的水平，所述方法包括下列步骤(i)用权利要求1至9或15中的任一项的抗体测定所述哺乳动物中的肽Αβ 8_x的量， ( )将步骤(i)中测定的量与对照哺乳动物中对所述A β 8_x肽的N-末端区域特异的 抗体的量相比较，和(iii)根据步骤(ii)中的比较来推断，所述哺乳动物是否对与淀粉状蛋白形成 和/或聚集有关的疾病例如阿尔茨海默病易感、所述哺乳动物是否处于发展出与β “淀粉 状蛋白形成和/或聚集有关的疾病例如阿尔茨海默病的风险中、是否清除了哺乳动物中的 β -淀粉状蛋白沉积，或所述哺乳动物中β -淀粉状蛋白的水平是多少。6
21.权利要求20的方法，其中在获自所述哺乳动物的组织样品上测定对Αβ8_χ肽的 N-末端区域特异的抗体的量。
22.—种试剂盒，其包括至少一种缓冲剂，和至少一种检测化合物、至少一种权利要求 1至9或15的任一项中定义的N-截短的A β 8-χ特异性抗体。
23.权利要求22的试剂盒，其还包括优选经标记的二抗，所述二抗与权利要求1至9或 15中的任一项的抗体结合。
24.一种治疗组合物，其包括作为活性成分的权利要求1至9或15中的任一项的抗体， 或包括具有模拟N-截短的A β肽的游离N-末端的游离N-末端的合成的肽，以及药学上可 接受的媒介物。
25.权利要求24的治疗组合物，其适合于以lmg/kg/天到200mg/kg/天的抗体剂量施 用给个体。
26.一种疫苗组合物，其包括作为活性成分的权利要求1至9或15中的任一项的抗体、 其片段或衍生物，或包括具有模拟N-截短的A β肽的游离N-末端的游离N-末端的合成的 肽，以及药学上可接受的媒介物。
27.权利要求26的疫苗组合物，其适合于以lmg/kg/天到200mg/kg/天的抗体剂量施 用给个体。
28.至少一种权利要求1至9或15中的任一项的抗体用于制备药物或疫苗的用途，所 述药物或疫苗意欲用于预防或治疗阿尔茨海默病。
29.至少一种权利要求1至9或15中的任一项的抗体用于制备药物或疫苗的用途，所 述药物或疫苗意欲用于清除β淀粉状蛋白负荷。
30.清除哺乳动物中的淀粉状蛋白负荷的方法，其包括给所述哺乳动物施用权利 要求24至27的组合物。
31.权利要求24或26的治疗或疫苗组合物的用途，其用于在患有或易于发展出阿尔茨 海默病的哺乳动物中诱导免疫应答。
全文摘要
本发明涉及单克隆抗体，其特异性结合Aβ8-x肽的N-末端区域(x包括11到42)，但不识别Aβ1-40或Aβ1-42，且其对Aβ8-x肽展现出高亲和力，如通过在单克隆抗体与肽Aβ8-x之间形成免疫复合物测定的。
文档编号C07K14/47GK101883792SQ200880119109
公开日2010年11月10日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月29日
发明者A·德拉考特, E·万莫彻伦, L·布伊, L·普莱蒂尔, M·高姆派尔, N·塞尔格恩特, P·格罗戈纳特, V·布朗扎德-布莱格恩 申请人:基因创新有限公司;国家健康与医学研究院;赛诺菲-安万特公司