专利名称：：可变切向流过滤的利记博彩app可变切向流过滤本发明属于蛋白质浓縮领域，更具体而言，其涉及切向流过滤(TFF)用于免疫球蛋白浓縮的应用。
背景技术：
：蛋白质、尤其是免疫球蛋白在当前的医药事务中起着非常重要的作用。用于生产重组多肽的表达系统是本领域公知的并且描述于，例如Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V.等，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm，F.和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159。在制药应用中使用的多肽主要在诸如CH0细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.C6⑧细胞等的哺乳动物细胞中生产。对于人类应用，每种药用物质都必须符合特定的标准。为确保生物药用物质对人类的安全性，例如，必须移除可能造成严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为符合质量管理规格标准，在生产步骤之后必须有一个或多个纯化步骤。除其它因素外，纯度、生产能力和收率在确定合适的纯化方法中起着重要的作用。由于它们的化学和物理性质，诸如分子量和结构域构造(包括二级修饰)，免疫球蛋白的下游加工非常复杂。例如，不仅对于配制的药物，而且对于下游加工(DSP)的中间产品，都需要浓縮溶液以实现用于经济处理和应用贮存的低体积。此外，短的浓縮时间对于确保顺利加工和短的操作时间都是有利的。就此方面，不完善的TFF方法(尤其是最终纯化步骤后的)可以引起持久的损害，甚至影响药物产品。Ahrer，K.，等(J.Membr.Sci.274(2006)108-115)研究了单克隆抗体(mAb)中间溶液的切向流浓縮过程中切变应力和聚集之间的关系。监测了浓縮时间及所选择的流和压力对方法性能和聚集状态的影口向(例如，参力口Dosmar，M.等，BioprocessInt.3(2005)40—50;Luo，R.等，BioprocessInt.4(2006)44-46)。Mahler，H.-C.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.59(2005)407—417)报道了在通过不同的搅拌应力方法形成的液体IgGl-抗体制剂中聚集的诱导和分析。在US6，252，055中，报道了浓縮的单克隆抗体制备物。用于生产浓縮抗体制备物的方法报道于US2006/0182740。US2006/0051347报道了包括超滤、渗滤和二次超滤序列的联合方法。在EP0907378中报道了应用具有250ml/分钟的固定再循环速率的横向流(cross-flow)超滤浓縮抗体制备物的方法。US2004/0167320报道了切向流过滤的方法以及用于其的设备。W097/45140报道了浓縮的抗体溶液。发明概述本发明提供了用于浓縮含有重组生产的免疫球蛋白的溶液的方法。更具体地，本发明的一个方面是通过切向流过滤浓縮免疫球蛋白溶液的方法，其中所施加的跨膜压力和横向流是可变的a)在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴(bar)至1.6巴的跨膜压力和75ml/分钟至90ml/分钟的横向流，b)在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，O.8巴至O.9巴的跨膜压力和140ml/分钟至160ml/分钟的横向流，以及c)在超过45mg/ml的浓度范围中，0.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。在一个实施方案中，步骤c)中的浓度范围是50mg/ml至高达275mg/ml。在优选的实施方案中，步骤c)中的浓度范围是50mg/ml至高达180mg/ml。在更优选的实施方案中，步骤c)中的浓度范围是50mg/ml至高达130mg/ml。在另一实施方案中，步骤a)中的跨膜压力和横向流是1.5巴和80ml/分钟，步骤b)中是0.85巴和150m1/分钟，和/或步骤c)中是O.85巴和130ml/分钟。在另一实施方案中，免疫球蛋白溶液是缓冲的、水性(aqueous)免疫球蛋白溶液。本发明的另一方面是用于生产异源免疫球蛋白的方法，其包括下述顺序的以下步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养步骤a)的细胞；c)从重组哺乳动物细胞或培养基中回收异源免疫球蛋白；d)应用具有可变跨膜压力和横向流的切向流过滤浓縮所获得包含所述异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。在一个实施方案中，该方法的步骤d)包括应用具有以下可变跨膜压力和横向流的切向流过滤浓縮所获得的水性、缓冲溶液i)在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75m1/分钟至90m1/分钟的横向流，ii)在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，O.8巴至O.9巴的跨膜压力和140m1/分钟至160m1/分钟的横向流，以及iii)在超过45mg/ml的浓度范围中，O.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。在另一实施方案中，该方法在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤e)纯化含有异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。在另一实施方案中，所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞或？￡11.(:6@细胞。发明详述本发明报道了用于将免疫球蛋白溶液浓縮至浓度超过100mg/ml的方法。出人意料地发现，应用根据本发明的方法，可以以低的聚集物形成和在短时间内实现这一目的。在本发明中，术语"切向流过滤"或"TFF"可互换使用，其表示这样的过滤方法，其中待浓縮的含有多肽的溶液沿着滤膜表面(即，与滤膜表面正切)流动。该滤膜包含具有确定截断值的孔径。在一个实施方案中，该截断值是20kDa至50kDa，优选30kDa。该过滤方法是一种超滤方法。术语"横向流"表示待浓縮溶液的与膜正切的液流(渗余物流)。术语"通量(flux)"或"渗透物流(permeateflow)"在本发明中可互换使用，其表示穿过膜(即，通过膜孔)的流体的流。即，其指通过膜的渗透物的体积流速。"流"通常以每单位时间每单位膜面积的体积的形式如升/m7h(LMH)给出。在一个实施方案中，横向流的特征在于该横向流以对于0.02m2的膜面积而言的ml/分钟表示。在另一实施方案中，在单个步骤中横向流是2401/m2/h、4501/m7h和3901/m2/h。渗透物包括待浓縮溶液的溶剂，以及具有所应用的膜的截断值以下分子量的分子(但非异源免疫球蛋白)。术语"跨膜压力"或"TMP"在本发明内可互换使用，其表示施加的用于驱动溶剂和比滤膜的截断值更小的成分通过滤膜的孔径的压力。跨膜压力是入口、出口和渗透物的平均压力，并且可如下计算术语"免疫球蛋白"是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。确认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因和繁多的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以不同的形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab^以及单链(scFv)或双体(例如，Huston,J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883;Bird，R.E.等，Science242(1988)423-426;一般地，Hood等，Immunology,BenjaminN.Y.，第二版(1984);禾口Hunk即iller，T.和Hood，L.，Nature323(1986)15-16)。术语"完全免疫球蛋白"表示包含两条称为轻免疫球蛋白链多肽(轻链)和两条称为重免疫球蛋白链多肽(重链)的免疫球蛋白。完全免疫球蛋白的每一条重和轻免疫球蛋白链多肽含有可变结构域(可变区)(一般为多肽链的氨基端部分)，其包含可与抗原相互作用的结合区域。完全免疫球蛋白的每一条重和轻免疫球蛋白链多肽还包含恒定区(一般为羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体与i)拥有FcY受体(FcyR)的细胞诸如吞噬细胞结合，或与ii)拥有新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞结合。其还介导与一些因子包括经典补体系统的因子诸如成分(Clq)的结合。免疫球蛋白的轻链和重链的可变区依次包含不同的片段，即四个框架区域(FR)和3个高变区(CDR)。术语"免疫球蛋白片段"表示包含重链的可变结构域、Q1结构域、铰链区、Q2结构域、Q3结构域、Q4结构域，轻链的可变结构域或结构域中至少一个结构域的多肽。还包含其衍生物和变体。例如，可存在其中一个或多个氨基酸或氨基酸区域缺失的可变结构域。术语"免疫球蛋白缀合物"表示包含通过肽键与其它多肽轭合的免疫球蛋白重或轻链的至少一个结构域的多肽。所述其它多肽是非免疫球蛋白肽，诸如激素、生长受体、抗融合肽或补体因子等。通用的色谱方法和它们的用途是本领域技术人员公知的。例如参见色谱法(Chromatography)，第5片反，A部分原理禾口技术(FundamentalsandTechniques)，Heftmann，E.(编辑)，ElsevierSciencePublishingCompany,纽约，(1992);生物科学中的先进色谱法禾口电迁移方法(AdvancedChromatogr即hicandElectromigrationMethodsinBiosciences),Deyl，Z.(编车茸)，ElsevierScienceBV，Amsterdam,TheNetherlands,(1998);当今的色谱法(ChromatographyToday),Poole，C.F.，禾口Poole，S.K.，ElsevierSciencePublishingCompany,纽约(1991);Scopes，蛋白质纯化原理和实践(ProteinPurification-PrinciplesandPractice)(1982);S咖brook，J.，等(编车茸)，分子克隆实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989;或分子生物学的当前技术(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Ausubel，F.M.等(编车茸)，JohnWiley&Sons,Inc.，纽约。对于重组产生的异源免疫球蛋白的纯化，通常应用不同柱色谱步骤的组合。通常在蛋白质A亲和色谱法后跟随有一个或两个其它的分离步骤。最终的纯化步骤称为"精制步骤(polishingst印)"，用于除去痕量杂质和污染物，例如聚集的免疫球蛋白、残余HCP(宿主细胞蛋白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。对于这一精制步骤，通常使用在流通模式中的阴离子交换材料。已建立了不同的方法并将其广泛应用于蛋白质回收和纯化，诸如用微生物蛋白质的亲和色谱法(例如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)，离子交换色谱法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，嗜硫吸附(例如用P-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香性吸附色谱(例如，用苯基_琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间氨基苯硼酸)，金属螯合亲和色谱(例如用Ni(II)_和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻色谱，和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。术语"异源免疫球蛋白"表示不是由哺乳动物细胞天然产生的免疫球蛋白。根据本发明方法生产的免疫球蛋白是通过重组方法产生的。此类方法在本领域是公知的，并且包括在真核细胞中表达蛋白质、随后回收和分离异源免疫球蛋白，并且通常纯化至药学上可接受的纯度。为了生产(即表达)免疫球蛋白，通过标准方法将编码轻链的核酸和编码重链的核酸各自插入到表达盒中。应用常规方法能很容易地分离和测序编码免疫球蛋白轻和重链的核酸。杂交瘤细胞可作为此类核酸的来源。可将表达盒插入到表达质粒中，然后将该质粒转染至宿主细胞，否则所述宿主细胞不产生免疫球蛋白。在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达，并且从裂解后的细胞或从培养上清液回收免疫球蛋白。本申请中所使用的术语"免疫球蛋白溶液"表示含有完全免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物的水性缓冲溶液。该溶液例如可以是培养上清液、或柱色谱洗脱物、或精制的免疫球蛋白溶液。"异源DNA"或"异源多肽"是指不天然存在于给定宿主细胞中的DNA分子或多肽、或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞异源的DNA分子可以含有衍生自宿主细胞物种的DNA(S卩，内源DNA)，只要该宿主DNA与非宿主DNA(g卩，外源DNA)组合即可。例如，含有与包含启动子的宿主DNA片段可操作连接的编码多肽的非宿主DNA片段的DNA分子被认为是异源DNA分子。反之，异源DNA分子可包含与外源启动子可操作地连接的内源结构基因。由非宿主DNA分子编码的肽或多肽是"异源"肽或多肽。术语"在适于表达异源免疫球蛋白的条件下"表示用于培养表达免疫球蛋白的哺乳动物细胞的条件，并且其是本领域技术人员公知的，或可以由本领域技术人员很容易地确定。本领域技术人员还已知，这些条件将取决于所培养的哺乳动物细胞的类型和所表达的免疫球蛋白的类型而可能不同。一般而言，哺乳动物细胞在2(TC至4(rC的温度下培养，并且持续足以允许免疫球蛋白的有效蛋白质生产的时间段，例如，4至28天。术语"重组哺乳动物细胞"指可以将或将例如编码异源多肽的核酸导入/转染至其中的细胞。术语"细胞"包括用于表达核酸的细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CH0细胞(例如CH0K1、CH0DG44)、或BHK细胞、或NS0细胞、或SP2/0细胞、或HEK293细7胞、或HEK293EBNA细胞、或PER,C6⑧细胞、或C0S细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、或BHK细胞、或HEK细胞、或Sp2/0细胞、或PER.C6⑧细胞。本文所使用的表述"细胞"包括主题(subject)细胞及其后代。因此，术语"重组细胞"包括最初转染的细胞，以及包含从其衍生的后代细胞的培养物，而不考虑传代的次数。还应当理解，由于故意或非故意的突变，所有的后代在DNA内容物中可能不是精确同一的。与最初转化的细胞具有相同功能或生物活性的变体后代也包括在内。在本申请中使用的术语"缓冲的"表示这样的溶液，其中通过缓冲物质使由于添加或释放酸性或碱性物质而导致的PH值改变得以保持恒定。可以使用产生此类效果的任何缓冲物质。在一个实施方案中，使用药学上可接受的缓冲物质，例如，磷酸或其盐、醋酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2_(^吗啉代)乙磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、或者三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。在优选的实施方案中，缓冲物质是磷酸或其盐、醋酸或其盐、或者柠檬酸或其盐、或者组氨酸或其盐。缓冲溶液可任选地包含另外的盐，例如，氯化钠、和/或硫酸钠、和/或氯化钾、和/或硫酸钾、和/或拧檬酸钠、和/或拧檬酸钾。在本发明的一个实施方案中，缓冲的水性溶液的pH值是pH3.0至pHIO.O，优选pH3.0至pH7.0，更优选pH4.0至pH6.0、以及最优选pH4.5至pH5.5。现已出人意料地发现，用根据本发明的切向流过滤(TFF)方法，可在短时间内获得具有低的聚集物形成的浓縮的免疫球蛋白溶液，其中在所述方法中，跨膜压力和横向流在过滤过程中是可变的，并且根据待浓縮溶液中免疫球蛋白的实际浓度而调整。也就是说，已出人意料地发现，如果应用根据本发明的TFF方法(即其中在过滤处理过程中根据抗体溶液的实际浓度而改变和调整跨膜压力的方法)，在切向流过滤过程中的聚集物形成是很低的。与本领域已知的恒定方法(即其中在过滤处理之前选择跨膜压力并在整个切向流过滤过程中保持恒定的方法)相比，根据本发明的方法是可变的方法。本发明包括通过切向流过滤浓縮免疫球蛋白溶液的方法，其中所施加的跨膜压力和横向流是可变的，并且在过滤处理过程中根据浓縮的免疫球蛋白溶液中的免疫球蛋白浓度而改变，其中a)在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，施加1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75m1/分钟至90m1/分钟的横向流，b)在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，施加0.8巴至0.9巴的跨膜压力和140m1/分钟至160m1/分钟的横向流，以及c)在超过45mg/ml的浓度范围中，施加O.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。TFF中的切变应力和聚集物形成之间存在联系。为评估该影响，用以下公式计算在所使用的膜表面上的流诱导的切变应力、、,=^^其中4是"〃=4^^所述公式基于Gerhart等(流体力学基础(FundamentalsofFluidMechanics)，Addison-WesleyPublishingCompany(1993))禾PCheryan等(超滤和微滤手册(UltrafiltrationandMicrofiltrationHandbook)，第二版CRCPressLLC(1998))。在这一公式中，dH是水压(hydraulic)直径，a是流通道宽度，b是流通道高度以及L是流通道长度。此夕卜，Ap二Pi-p。，其中Pi是所施加的入口压力，P。是出口压力。在一个实施例中，应用了由再生纤维素构成的HydrosartTM膜(SartoconSlice200Hydrosart,SartoriusAG，G6ttingen，德国)，其具有30kDa的标称分子量截断值以及0.02m2的膜面积。对于所使用的膜盒，计算得到1.08mm的水压直径。首先用标准的TFF方法操作该膜，所述标准方法即在浓縮过程中不改变跨膜压力和横向流。分析了具有预置、恒定的Ap和0.6巴的预置、恒定跨膜压力(TMP)的3种恒定方法。表1:所施加的压力差和相应切变应力的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过观察通量相对于上升的蛋白质浓度，在不同的Ap下处理的曲线中没有显著的差异。但是对于3巴模式，观察到了由于高入口压力导致的较低终浓度。与在较低的恒定横向流(CF;90ml/分钟)和较低的平均Ap(约0.9巴)下进行的浓縮模式相比，1.2_1.8巴的较高Ap有助于随时间改善的通量性能和较高的终浓度(TMP—直是0.6巴)。对浓縮处理前和处理后浊度、光线遮蔽(L0)和动态光散射(DLS)数据的比较显示随着升高的切变应力发现增强的聚集物形成(图2)。基于TMP/CF-探查实验(例如参见Luo，R.，等，BioprocessInt.4(2006)44-54)，已开发了与施加高入口压力模式(Ap=3巴)相比具有相当的总处理时间的TFF方法。已开发了根据本发明的方法以改善随时间的通量性能和减少免疫球蛋白聚集物形成，即，将低的聚集物形成和短的总浓縮时间结合。在开发根据本发明方法的过程中，根据待浓縮的免疫球蛋白溶液中的主要免疫球蛋白浓度进行了TMP和CF探查。发现了具有在给定浓度下根据最佳通量图式(profile)调整的TMP和CF的方法。没有在浓縮最后阶段的高入口压力的缺点(例如参见，Dosmar，M.，等，BioprocessInt.3(2005)40-50)，根据本发明的方法在所产生的浓縮物的浊度、LO和DLS数据中显示出低的聚集物负载(参见图3和4)。此外，应用根据本发明的方法，达到了更高的终浓度。在根据本发明的方法中，跨膜压力和横向流根据浓縮的免疫球蛋白溶液的实际浓度而变化。在一个实施方案中，根据本发明的方法是可变切向流过滤方法，其中待浓縮溶液中免疫球蛋白的实际浓度决定所施加的跨膜压力和横向流。因此，根据免疫球蛋白的实际浓度调整跨膜压力和横向流，以减少施加的应力，并因此减少聚集的免疫球蛋白分子的形成并提供短的总浓縮时间。在根据本发明的方法中，定义了3个浓度范围。待浓縮溶液的第一个实际浓度范围是0mg/ml至30mg/ml，第二个实际浓度范围是15mg/ml至55mg/ml，以及第三个实际浓度范围是45mg/ml至180mg/ml。正如所见，这些浓度范围是重叠的范围。已发现在15mg/ml至30mg/ml和45mg/ml至55mg/ml的重叠浓度范围中，在本发明的方法中可使用不同的跨膜压力和横向流值。在这些重叠的浓度范围中，可施用两种TMP和CF设置中的任一种，而不会对聚集形成或处理时间产生显著影响。因此，在根据本发明方法的一个实施方案中，从a)至b)和从b)至c)的条件可以在重叠浓度范围中的任意浓度值处进行改变。在一个实施方案中，步骤c)中的浓度范围是50mg/ml至高达275mg/ml。在另一实施方案中，跨膜压力和横向流在步骤a)中是1.5巴和80ml/分钟，在步骤b)中是0.S5巴和150ml/分钟，和/或在步骤c)中是0.85巴和130ml/分钟。在另一实施方案中，免疫球蛋白溶液是缓冲的水性免疫球蛋白溶液。在一个实施方案中，浓度范围在步骤a)中是5至25mg/ml，步骤b)中是25至50mg/ml，以及在步骤c)中是50至140mg/ml。本发明另一方面是用于生产异源免疫球蛋白的方法，其包括以以下顺序的下列步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养该哺乳动物细胞；c)从重组哺乳动物细胞或培养基中回收水性、缓冲溶液形式的异源免疫球蛋白；d)应用具有可变的、依赖于免疫球蛋白浓度的跨膜压力和横向流的切向流过滤，浓縮所获得的包含异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。在根据本发明的生产方法的一个实施方案中，其包括步骤d):应用具有下述可变的、依赖于免疫球蛋白浓度的跨膜压力和横向流的切向流过滤浓縮所获得的水性、缓冲溶液i)在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75m1/分钟至90m1/分钟的横向流，ii)在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，O.8巴至O.9巴的跨膜压力和140m1/分钟至160m1/分钟的横向流，以及iii)在超过45mg/ml的浓度范围中，O.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。在另一实施方案中，该方法在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤e)纯化含有所述异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。步骤e)中的纯化可通过不同的方法和技术完成，诸如色谱法步骤，或者不同或相似色谱步骤的组合，或沉淀，或盐析，或超滤，或渗滤，或冻干，或缓冲剂变换(bufferchange)，或其组合等等。在另一实施方案中，所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞或PER,C6⑧细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、或BHK细胞、或HEK细胞、或Sp2/0细胞、或PER.C6⑧cell。提供了以下实施例和附图以助于理解本发明，本发明的真实范围如所述权利要求中所示。应当理解，可在给出的步骤中进行修改，而不背离本发明的精神。在完成本发明时，抗-IL-IR抗体(例如参见WO2005/023872)和抗-P-选择蛋白抗体(例如参见WO2005/100402)在我们的实验室中可足量获得，因此本发明应用这两种免疫球蛋白进行例示。通常，本发明同样还可以用任何免疫球蛋白来实现。这一示范性描述仅仅是用于例示，而非限制本发明。附图简述图l对于不同的恒定Ap模式和在90ml/分钟的恒定CF下的浓縮方法，在冲洗膜之前通量对(versus)抗-IL-IR抗体溶液的蛋白浓度。1:恒定方法Ap=1.2巴，2:恒定方法Ap=1.8巴，3:恒定方法Ap=3.0巴，4:恒定方法CF90ml/分钟。图2用恒定方法浓縮抗-IL-IR抗体溶液之前和之后的颗粒数。1:浓縮之前，2:tw=216，3:tw=324，4:tw=541。图3用不同方法浓縮之前和之后的抗-IL-IR抗体溶液颗粒数的比较。1:浓縮前，2:根据本发明的可变方法，3:恒定方法CF90ml/分钟，4:tw=541。图4通量对抗-IL-IR抗体溶液的蛋白浓度。1:恒定方法CF=90ml/分钟，2:tw=541，3:根据本发明的可变方法。图5对于50ml/分钟(实心圆)、80ml/分钟(实心三角形)和130ml/分钟(实心正方形)的横向流，跨膜通量对蛋白质浓度5.3mg/ml的抗-IL-IR抗体溶液的跨膜压力。图6对于80ml/分钟(实心圆)、130ml/分钟(实心三角形)和150ml/分钟(实心正方形)的横向流，跨膜通量对蛋白质浓度45mg/ml的抗_IL_IR抗体溶液的跨膜压力。图7对于50ml/分钟(实心圆)、80ml/分钟(实心三角形)和130ml/分钟(实心正方形)的横向流，跨膜通量对蛋白质浓度90mg/ml的抗-IL-IR抗体溶液的跨膜压力。图8对于50ml/分钟(实心圆)、80ml/分钟(实心三角形)和130ml/分钟(实心正方形)的横向流，跨膜通量对蛋白质浓度180mg/ml的抗-IL-IR抗体溶液的跨膜压力。图9通过不同方法获得的在柠檬酸盐缓冲液中的抗-IL-IR抗体溶液浓縮物的颗粒分析。1:浓縮前，2:根据本发明的可变方法，3:恒定方法CF90ml/分钟，4:恒定方法Ap=1.8巴，5:恒定方法Ap=3.0巴。图IO通过不同方法获得的在柠檬酸盐缓冲液中的抗-IL-IR抗体溶液的浓縮物的动态光散射分析。实心菱形浓縮前，实心正方形根据本发明的可变方法，实心三角形恒定方法CF90ml/分钟，实心圆恒定方法Ap=1.8巴。图11通过不同方法获得的在柠檬酸盐缓冲液中的抗-IL-IR抗体溶液的浓縮物的浊度测量。1:浓縮前，2:根据本发明的可变方法，3:恒定方法CF90ml/分钟，4:恒定方法Ap=1.8巴，5:恒定方法Ap=3.0巴。图12应用不同的缓冲液，用根据本发明的方法和恒定方法获得的抗-IL-IR抗体溶液的浓縮物的浊度测量。1:浓縮前在柠檬酸盐缓冲液中，2:用柠檬酸盐缓冲液的根据本发明的可变方法，3:用柠檬酸盐缓冲液的恒定方法Ap=3.0巴，4:浓縮前在组氨酸缓冲液中，5:用组氨酸缓冲液的根据本发明的可变方法，6:用组氨酸缓冲液的恒定方法Ap=3.0巴。图13通过不同的方法和在不同的缓冲液中获得的浓縮物的动态光散射分析a)在柠檬酸盐缓冲液中的抗-IL-IR抗体(实心菱形浓縮前，实心正方形用根据本发明的可变方法浓縮后，实心三角形恒定方法Ap=1.8巴)，b)在组氨酸缓冲液中的抗-IL-IR抗体(实心菱形浓縮前，实心正方形用根据本发明的可变方法浓縮后，实心三角形恒定方法Ap=3.0巴)。图14在组氨酸缓冲液中的抗-P-选择蛋白抗体浓縮物的浊度测量(a)和动态光散射(b)结果。1:浓縮前(实心菱形)，2:根据本发明的可变方法(实心正方形)，3:恒定11方法Ap=3.0巴(实心三角形)。图15浓縮模式对浓縮的免疫球蛋白溶液滤过率的影响。实施例1分析方法a)浊度测量在抗体溶液吸收没有内在发色团的350nm和550nm处测定吸光度(UV-VISapectrophotometerEvolution500，ThermoFisherScientific，Waltham，USA)。用未稀释的样品测量。使用适当的缓冲溶液作为参照介质。每个测量实施3次。b)尺寸-排阻-HPLC在ASI-100HPLC系统(Dionex，Idstein，德国)上用TosohHaasTSK3000SWXL柱进行色谱法。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm处检测洗脱峰。在将浓縮样本溶解至lmg/ml后，用由200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾组成的、pH7.0的缓冲液洗柱，直到达到稳定的基线。应用0.5ml/分钟流速在等度条件下进行分析，在室温下历时30分钟。用Chromeleon(Dionex，Idstein，德国)手动积分色谱图。通过将高分子量形式的曲线下面积(AUC)与单体峰的AUC比较来确定％聚集。c)光线遮蔽为监测1-200ym范围内的颗粒负载，使用了SVSS-C颗粒分析仪(PAMASPartikelmess_undAnalysesysteme，Rutesheim，德国)。根据US药典第24巻〈788>的要求，用近单一尺寸聚苯乙烯球校对系统。用0.5ml预冲洗体积进行了0.5ml体积的3个测量。作为平均值计算结果并涉及1.0ml的样本体积。所计算的颗粒数在探测器的浓度限度内。d)动态光散射(DLS)DLS是用于测量颗粒大小(一般在亚微米级大小范围)的非侵入技术。在本发明中，应用具有温控石英比色皿(25°C)的ZetasizerNanoS设备(MalvernInstruments,Worcestershire,UK)来监测lnm和6iim之间的大小范围。在173°角检测反散射激光的强度。该强度以依赖于颗粒扩散速度的速率波动，所述颗粒扩散速度又由颗粒大小控制。因此，可从散射光强度波动的分析产生颗粒大小数据(Dahneke，B.E.(编车茸)，MeasurementofSuspendedParticlesbyQimsielectricLightScattering,WileyInc.(1983);Pecora，R.，DynamicLightScattering-ApplicationofPhotonCorrelationSpectroscopy，PlenumPress(1985))。应用DTS软件(Malvern)的倍数狭小模式(multiplenarrowmode)计算通过强度的大小分布。用未稀释的样品进行实验。e)傅立叶-变换红外光谱通过应用具有与恒温器连接的流通传输池(AquaSpec)的Tensor27分光计(Bruker0ptik，Ettlingen，德国)记录未稀释蛋白质溶液的FT-IR光谱。对于每一光谱，在单光束模式下以4cm—^勺分辨率收集120-扫描的干涉图。应用合适的渗透物作为参照介质。将所收集的蛋白质和缓冲液系统的干涉图进行傅立叶转换。此外，针对相应缓冲系统的光谱，校正蛋白质的光谱。实施例2TMP和CF条件的确定通过应用自动TFF系统AKTAcr0SSfl0W(GEHealthcare,AmershamBioscienceAB，Uppsala，瑞典)，其应用具有Hydrosart可再生纤维素膜(其具有30kDa的标称分子量截断值和o.02m2的膜面积)的可调大小的平板盒(Sartorius，Gimingen，德国)，将经调整和过滤的抗-IL-IR抗体的拧檬酸盐缓冲水性溶液(pH5.5)浓縮20倍至高达ioomg/mi。进行了由控制AKTAerossflowTM的unicorn软件产生的不同浓縮程序。总的膜载量约为400g/m2。在待浓縮的免疫球蛋白溶液的不同免疫球蛋白浓度下，就不同的横向流确定在四个预置膜压力下的通量和压力曲线。将TMP设置为o.3巴、0.5巴、0.9巴或2.0巴。对于每一TMP和蛋白质浓度的横向流为50ml/分钟、80ml/分钟、130ml/分钟(不在45mg/ml蛋白质浓度下)和150ml/分钟(仅在45mg/ml蛋白质浓度下)。不同的蛋白质浓度是5.3mg/ml、45mg/ml、90mg/ml和180mg/ml。结果显示于图5至8。已发现，在浓縮处理过程中，高供给(feed)通量和高供给压力导致好的跨膜通量。但是在浓縮过程中，尤其是在末尾，建立了极化层，其导致膜超压并且还减少(渗透物)通量。还发现，升高的供给压力导致较高的通量，并且因此导致快的浓縮过程，但是这一加速伴随增加的聚集物形成(图9至11)。考虑到以上内容，发现对于改良的免疫球蛋白浓縮方法的范围和条件是-在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75ml/分钟至90ml/分钟的横向流，-在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，o.8巴至0.9巴的跨膜压力和140ml/分钟至160ml/分钟的横向流，以及-在超过4511^/1111的浓度范围中，0.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。这些参数产生具有减少的聚集物形成和短浓縮时间的方法。实施例3根据本发明的可变方法和恒定方法的比较将根据本发明的方法与不同的用于产生浓縮免疫球蛋白溶液的恒定参数方法进行比较。目标浓度设定为90mg/ml。用根据实施例2的装置进行切向流过滤。进行比较的方法的不同参数(方法1至4是恒定方法，方法5是根据本发明的可变方法)如下方法1:跨膜压力=0.6巴横向流二90ml/分钟Ap二0.7巴方法2:跨膜压力=0.6巴Ap=1.2巴方法3:跨膜压力=0.6巴Ap=1.8巴方法4:跨膜压力=0.6巴Ap=3.0巴方法5:a)跨膜压力=1.5巴，Ap=0.5巴；b)跨膜压力=0.85巴，Ap=1.2巴；13c)跨膜压力=0.85巴。使免疫球蛋白溶液的浓度达到90mg/ml免疫球蛋白浓度的不同参数和时间如表2所示。表2:不同浓縮方法的参数比较方法APTMP供给压力出口(Ret)压力供给流出口流颗粒>1fun/ml时间10.7巴0.6巴1.2巴0.5巴100ml/分钟90ml/分钟7321820149分钟1,2巴0.6巴1.4巴0.2巴170ml/分钟160ml/分钟15403850126分钟31.8巴0.6巴2.1巴0.3巴230ml/分钟21SmI/分钟16989540125分钟43.0巴0.6巴2.8巴0.2巴300ml/分钟280ml/分钟19415180116分钟0.5巴1.5巴2.0巴1.5巴100ml/分钟80ml/分钟12182240118分钟1.2巴0.85巴1.7巴0.5巴165ml/分钟150ml/分钟0.850.5巴135ml/130ml/巴分钟分钟从不同方法的结果可以看到，与方法2-4相比，应用方法5(即应用可变方法)可显著减少聚集物形成，并且因此得到具有改良性质的免疫球蛋白浓縮物。与方法l相比，浓縮过程可以更快。实施例4在不同缓冲系统中的抗-IL-IR抗体的浓縮应用实施例2的装置和根据本发明的方法(实施例3的方法5)进行用柠檬酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂缓冲的抗-IL-IR抗体水性溶液的比较浓縮。结果显示于图12和13中。分别从图12和图13中可看出，所应用的缓冲剂对根据本发明的浓縮方法没有影响。实施例5抗-P-选择蛋白抗体的浓縮根据实施例2的方法进行抗-P-选择蛋白抗体的浓縮，结果显示于图14中。实施例6浓縮溶液的过滤在切向流过滤后，应用0.75巴的压力使根据实施例2的方法获得的浓縮溶液通过Dur即ore(PVDF，MilliporeGmbH，Schwalbach，德国)膜(4.52cm2过滤器面积)过滤。发现高度浓縮的免疫球蛋白溶液的过滤性取决于所应用的浓縮方法。还发现当与其它固定的方法比较时，用根据本发明的可变方法获得的浓縮的免疫球蛋白溶液显示出减小的过滤流下降(图15)。权利要求通过切向流过滤浓缩免疫球蛋白溶液的方法，其特征在于跨膜压力和横向流是可变的i)在待浓缩溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75ml/分钟至90ml/分钟的横向流，ii)在15mg/ml至高达55mg/ml的浓度范围中，0.8巴至0.9巴的跨膜压力和140ml/分钟至160ml/分钟的横向流，以及iii)在超过45mg/ml的浓度范围中，0.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。2.权利要求1的方法，其特征在于步骤c)中的浓度范围是45mg/ml至高达130mg/ml。3.前述任一项权利要求的方法，其特征在于跨膜压力和横向流是-步骤a)中1.5巴和80ml/分钟，-步骤b)中0.85巴和150ml/分钟，和/或-步骤c)中0.85巴和130ml/分钟。4.用于生产异源免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养所述的细胞；c)从所述重组哺乳动物细胞或培养基回收异源免疫球蛋白；d)应用具有可变跨膜压力和横向流的切向流过滤浓縮所获得的包含所述异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。5.权利要求4的方法，其特征在于步骤d)包括应用具有以下可变跨膜压力和横向流的切向流过滤浓縮所获得的水性、缓冲溶液i)在待浓縮溶液最高达每ml30mg免疫球蛋白的浓度范围中，1.4巴至1.6巴的跨膜压力和75ml/分钟至90ml/分钟的横向流，ii)在15mg/ml至高达55mg/ml浓度范围中，O.8巴至0.9巴的跨膜压力和140ml/分钟至160ml/分钟的横向流，以及iii)在超过45mg/ml的浓度范围中，0.8巴至0.9巴的跨膜压力和120ml/分钟至140ml/分钟的横向流。6.权利要求4或5中任何一项的方法，其特征在于在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤e)纯化含有所述异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。7.权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段、或免疫球蛋白缀合物。8.权利要求4-7中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、HEK细胞、Sp2/0细胞或卩1:1^(:6@细胞。9.前述任一项权利要求的方法，其特征在于所述切向流过滤应用具有20至50kDa分子量截断值的膜。10.前述任一项权利要求的方法，其特征在于所述免疫球蛋白溶液具有pH3.0至pHlO.O的pH值。11.权利要求10的方法，其特征在于所述pH值为pH3.0至pH7.0。12.前述任一项权利要求的方法，其特征在于所述方法是可变切向流过滤方法，其中待浓縮溶液中的免疫球蛋白的实际浓度决定所施加的跨膜压力和横向流。13.前述任一项权利要求的方法，其特征在于可以在重叠浓度范围中的任意浓度值改变跨膜压力和横向流。14.权利要求l或5中任何一项的方法，其特征在于所述浓度范围是步骤a)中为5至25mg/ml，步骤b)中为25至50mg/ml，以及在步骤c)中为50至140mg/ml。全文摘要本发明公开了通过切向流过滤浓缩免疫球蛋白溶液的方法，其中跨膜压力和横向流是可变的。文档编号C07K1/34GK101754977SQ200880025063公开日2010年6月23日申请日期2008年7月15日优先权日2007年7月17日发明者E·罗森伯格,G·温特,S·黑普比尔迪克勒,W·库恩申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司;慕尼黑路德维希马克西米利安斯大学