专利名称：用于动脉硬化性疾病的靶向Salusin的治疗剂和检测试剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于动脉硬化性疾病(arteriosclerotic disease)的靶向(target) salusin-a或salusin-p的预防和治疗剂。本发明进一步涉及通过耙向salusin-a来检测动脉硬化性疾病的方法或试剂。
背景技术：
根据2005年由厚生劳动省(Ministry of Health, Labor and Welfare)发布的"人口动态统计(Dynamic Statistics of the Population )"，在日本
由于癌症造成的死亡人数为326,000，使其成为死亡的主要原因，其次是心脏病(173,000)，其是第二大死亡原因，以及中风(133,000)，其是第三大死亡原因。心脏病和中风的总死亡人数几乎与癌症相当。具体地，缺血性心脏病(其是心脏病的代表性实例)和脑梗塞(其是中风的典型疾病模式)的发展以动脉硬化为基本病理状态。因此，预防动脉硬化的发病和发展对于保持和增强国民的健康是非常重要的。
在动脉硬化的原发病灶中特征性的病理发现是巨噬细胞源性泡沫细胞的聚集，其中胆固醇酯积聚在细胞内。巨噬细胞经多种清道夫受体将修饰的LDL诸如氧化低密度脂蛋白(氧化LDL)结合至细胞内。胆固醇酯是一种重要的氧化LDL胆固醇，其在溶酶体内被降解为游离的胆固醇和脂肪酸。当细胞内游离胆固醇水平达到过度的程度时，其由两种机制调节。第一种机制是通过ATP结合盒转运体(ATP-bindingcassette transporter) Al (ABCA-1)胆固醇外流至细胞外，第二种机制是通过酰基-CoA:胆固醇酰基转移酶-1 (ACAT-l)转变为胆固醇酯。当胆固醇酯积聚在细胞质中时，巨噬细胞转变为泡沫细胞，形成动脉硬化的原发病灶。
动脉硬化的原发病灶中的另 一特征型病理发现是其中积聚了胆固醇酯的巨噬细胞源性泡沫细胞的聚集。巨噬细胞源性泡沫细胞分泌多种细胞因子，诱导血管平滑肌细胞从动脉的中膜迁移至动脉内膜，或诱导该血管平滑肌细胞在动脉内膜内增殖。已经迁移至动脉内膜的血 管平滑肌细胞合成并分泌细胞外基质，使动脉内膜变厚。这种内膜增 厚导致血管腔变窄并减少血流。来自血管平滑肌细胞的泡沬细胞还见 于中期动脉硬化时和之后。
Salusin是最近通过生物信息学分析鉴别的循环调节物质。有两种 称为salusin-a和salusin-(3的相关肽类(见非专利文件1)。东京医科齿 科大学(Tokyo Medical and Dental University)的Nanasato等人搜索了 人cDNA数据库，以筛选编码具有明显的信号序列的分泌性蛋白的基 因。将这些基因转染进培养的血管内皮细胞中，然后将培养上清液加 入至培养的血管平滑肌细胞中，从而鉴别出诱导细胞内C,浓度增加 的基因salusin(见非专利文件2)。 Salusin-oc包括28个氨基酸，salusin-P 包括20个氨基酸。它们通过其前体preprosalusin的加工而产生。 Preprosalusin由242个氨基酸组成，并且在对TOR2A基因进行选择性 剪接使得发生移码时得以生物合成，上述TOR2A基因是TOR1A (DYT1)的相关基因，已有报道TORIA (DYT1)是早发性扭转性肌 张力障碍的致病基因。由于在N-端上有26个氨基酸的信号序列，推断 两种salusin从216个氨基酸的Prosalusin的C-端侧生物合成。salusin-ot 和salusin-!3二者的表达分布在人血管壁细胞、内分泌-中枢神经系统等 中得以证实。目前，可以通过放射免疫测定来测量人血清和尿中的 salusin-a浓度。对于健康受试者，结果分别为23.3 ± 8.1 pM和156.8 ± 95.8pM (见非专利文件3)。其主要效应已经在大鼠中得到证实，包括 强降血压效应、强降心率效应(P>a)、促进脑垂体分泌加压素的效应 (仅有P)以及促进血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖的效应(P〉a)。
非专利文件1: ShichiriM等人，NatMed. 2003; 9: 1166-1172。
非专禾ll文件2 : Masayoshi Nanasato, Journal of Experimental Medicine Vol. 210， No. 4 2004. 7. 24， pp. 267-270
非专利文件3: SatoK等人，Peptides. 2006;27:2561-2566。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于动脉硬化性疾病的预防和治疗剂。 本发明的另一 目的是提供用于检测动脉硬化性疾病的方法和试剂。
5本发明的发明人己经推知，新的控制血压、心率等的血管活性物
质salusin以类似于已知血管活性物质尾加压素(urotensin) II和5-羟 色胺的方式作用于巨噬细胞，从而对巨噬细胞的泡沫化产生影响；艮P， 它们在动脉硬化病变(arteriosclerotic lesion)的形成中发挥重要作用。 因此，发明人集中于控制巨噬细胞的泡沫化和这种控制所必需的酶 ACAT-1的表达调控。发明人还考察了 salusin-ot和salusin-(3的作用。由 此，发明人己经发现，sakisin在动脉硬化病变的形成中发挥重要的病 理生理作用。具体来说，发明人已经发现，salusin-ot抑制巨噬细胞的泡 沫化，从而抑制动脉硬化病变的形成，salusin-P则促进巨噬细胞的泡沫 化，从而促进动脉硬化病变的形成。发明人由此进一步发现，能够抑 制salusin-(3或salusin-ct的作用的化合物可以用于预防或治疗动脉硬化 性疾病。此外，发明人已经发现，动脉硬化病变与生物样品中salusin-oc 的浓度呈负相关，salusin-ot可以用作检测动脉硬化性疾病的标志物。由 此，发明人完成了本发明。 本发明如下。 一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-a或 salusin-a的激动剂(agonist)作为活性成分。 —种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-P的拮抗剂 (antagonist)作为活性成分。根据[2]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所述 salusin-p的拮抗剂是抗salusin-(3抗体。根据[l]-[3]中任意一项所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂， 其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病， 即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血(encephalorrhagy)、主动脉瘤、 主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症(arteriosclerosis obliterans)。 —种用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其包括salusin-a或 salusin-a的激动剂和salusin-P的拮抗剂。根据[5]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中所述 salusin-(3的拮抗剂是抗salusin-p抗体。根据[5]或[6]所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其中 所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。 —种用于检测动脉硬化性疾病的方法，其包括化验(assay)生物样品中的salusin-a。根据[8]所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。根据[8]或[9]所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。 一种用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其包括化验生物样品中的salusin-a。根据[ll]所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。根据[11]或[12]所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。 一种用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其包括salusin-a。根据[14]所述的用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。 —种用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其包括抗salusin-a抗体并使用salusin-a作为检测动脉硬化性疾病的诊断标志物。根据[16]所述的用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
本说明书包括本申请的优先权文件日本专利申请第2007-127131号的说明书和/或附图所公开的部分或全部内容。
图1显示了 salusin-ot和salusin-P及其氨基酸序列之前的关系。
图2A显示了 salusin-a和salusin-(3对人单核细胞源性巨噬细胞中酰基-CoA:胆固醇酰基转移酶-l(ACAT-l)蛋白质表达的剂量依赖性影响。具体地，图2A显示了 salusin的剂量依赖性影响(0 nM至0.6 nM)。
图2B显示了 salusin-a和salusin-卩对人单核细胞源性巨噬细胞中ACAT-1蛋白质表达的剂量依赖性影响。具体地，图2B显示了 salusin的剂量依赖性影响(0nM至10nM)。
图3显示了在人单核细胞源性巨噬细胞的分化期期间salusin-a和salusin-p对ACAT-1蛋白质表达的时间依赖性影响。
图4显示了 ACAT活性测定的原理。
图5显示了 salusin-ot和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT活性的影响。
图6显示了 salusin-oc和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT-1 mRNA表达的影响。
图7图示了胆固醇酯化测定的原理。在图7中，CE表示胆固醇酯。
图8显示了 salusin-a和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化(胆固醇酯[CE]的积聚)的影响。
图9显示了A型清道夫受体(SR-A)活性的测量原理。
图10显示了 salusin-a和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞的A型清道夫受体(SR-A)活性的影响。图IOA显示结合测定(associationassay)的结果，图10B显示降解测定的结果。
图11显示了 salusin-ot和salusin-(3对人单核细胞源性巨噬细胞中ATP结合盒转运体Al (ABCA-1)蛋白质表达的影响。图11A显示salusin-ot的结果，图11B显示salusin-P的结果。
图12显示了 salusin-a和salusin-P对分化的培养的人单核细胞源性巨噬细胞的ACAT-1蛋白质表达的影响。图12A显示salusin-a的结果，图12B显示salusin-P的结果。
图13所示的照片显示了人冠状动脉的动脉硬化病变中的salusin-P表达。照片B是A的高倍放大图，照片D是C的高倍图像。图13A-D中的标尺分别表示1.0 mm、 100|im、 200 |um和200 |iim。在死于急性冠状动脉综合征(ACS)的患者(72岁男性)的左前降支(left anteriordescending artery)中，除了粥样斑(atheroma)(斑块)部分的平滑肌细胞(图13B中的1)和成纤维细胞(图13B中的2)以外，还证实了在右冠状动脉的脂纹内的巨噬细胞源性泡沫细胞(图13D中的3)和中膜内的成纤维细胞(图13D中的4)中有很强的salusin-l3表达。
图14显示了中年男性受试者的血清salusin-oc浓度和颈动脉内膜-中膜厚度的最大值(最大IMT，颈动脉硬化的指标)之间的关系。
图15显示了患有缺血性心脏病(稳定性劳力型心绞痛、急性冠状动脉综合征[ACS]和陈旧性心肌梗塞)的患者、高血压患者和健康受试者的血清salusin-oc浓度的比较。选择的病例为没有ACS病史的稳定性劳力型心绞痛病例、在ACS发作后6小时内进行检査的ACS病例和在被选择前6个月或更多月份发生ACS发作的陈旧性心肌梗塞病例。
图16显示了急性冠状动脉综合征(ACS)患者的单支血管病变(1-VD)组、两支血管病变(2-VD)组和三支血管病变(3-VD)组中的血清salusin-oc浓度。
图17-1所示的照片显示了 salusin-P对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的影响。A-E显示了用油红O染色的主动脉弓中的动脉粥样硬化性病变。F-J显示了近端主动脉横截面的油红O染色。
图17-2显示了 salusin-P对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的效应。在此显示的均值士SEM是使用每组6只小鼠通过测定用油红O染色的主动脉弓的动脉硬化病变的面积得到的。
图17-3显示了经测定每组11只apoE缺陷小鼠获得的血液数据的均值iSEM。
图18-1显示了 salusin-ot对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的影响。A-C显示用油红O染色的胸主动脉的动脉硬化病变。D-F显示近端主动脉横截面的油红O染色。
图18-2显示了 salusin-a对apoE缺陷小鼠的主动脉中的动脉硬化病变的效应。在此显示的均数士SEM是使用每组5只小鼠通过测定用油红O染色的胸主动脉中的动脉硬化病变的面积得的。
图18-3显示了经测定每组8只apoE缺陷小鼠获得的血液数据的均数iSEM。图19A显示了 apoE缺陷小鼠中的巨噬细胞泡沫化。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士 SEM。
图19B显示了 salusin-ot和salusin-(3对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞中的胆固醇外流的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士SEM。
图20A显示了 salusin-a和salusin-卩对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达CD36的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士 SEM。
图20B显示了 salusin-a和salusin-P对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达SR-A的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士 SEM。
图20C显示了 salusin-a和salusin-(3对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ACAT1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士SEM。
图20D显示了 salusin-oc和salusin-P对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ABCA1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士SEM。
图20E显示了 salusin-ot和salusin-p对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达ABCG1的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数土SEM。
图20F显示了 salusin-a和salusin-P对apoE缺陷小鼠的巨噬细胞表达SR-BI的影响。每个数据都是经测定每组6只小鼠得到的均数士SEM。
具体实施例方式
本发明将详细解释如下。
Salusin-a是包括28个氨基酸残基的肽(SEQIDNO: 1)或包括29个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO: 2)，其在包括28个氨基酸残基的肽的C-端上具有酰胺化甘氨酸。另夕卜，salusin-(3是包括20个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO: 3)。 Salusin-oc和salusin-P由包括242个氨基酸的preprosalusin (SEQIDNO:4)加工而产生。使preprosalusin N-端的包括26个氨基酸的信号序列缺失，产生包括216个氨基酸的prosalusin，然后从prosalusin的C-端侧生成salusin-a和salusin-p。图1显示了
10salusin-a和salusin-P之间的关系(图1A)及其氨基酸序列之间的关系 (图1B)。
Salusin-oc抑制巨噬细胞的泡沫化，而salusin-P促进巨噬细胞的泡沬 化。巨噬细胞的泡沬化是由于巨噬细胞参入(incorporate)氧化LDL 而发生的现象，导致血管内皮细胞中的脂质沉积。巨噬细胞的泡沫化 由胆固醇酯的细胞内生成和积聚而造成。氧化LDL经巨噬细胞的多个 清道夫受体被参入，然后，由源于氧化LDL的胆固醇产生的胆固醇酯 发生积聚，从而发生巨噬细胞泡沬化。在巨噬细胞的泡沫化形成泡沫 细胞后，形成了动脉硬化性疾病的原发病灶，例如粥样斑形成。
Salusin-ot抑制巨噬细胞的泡沬化，从而抑制动脉硬化性疾病的病 变形成。因此，salusin-a可以用于预防或治疗动脉硬化性疾病。此外， salusin-a的激动剂也可以类似于salusin-ot的方式用于预防或治疗动脉 硬化性疾病。在此，salusin-a的激动剂的例子包括所有促进salusin-a 的作用的化合物。这类激动剂的例子包括与salusin-a的受体结合、从 而发挥类似于salusin-a的作用的化合物以及具有激动剂活性的抗 salusin-a受体抗体。
另一方面，salusin-p促进巨噬细胞的泡沫化，从而以促进的方式作 用于动脉硬化病变的形成。因此，与salusin-P结合从而抑制salusin-P 的作用的salusin-(3拮抗剂，抑制salusin-P导致巨噬细胞泡沫化的作用， 从而产生了抑制动脉硬化性疾病的病变形成的能力。因此，salusin-P 的拮抗剂可以用于预防或治疗动脉硬化性疾病。本发明的这类salusin-p 的拮抗剂的例子包括所有与salusin-P或salusin-p的受体结合从而抑制 salusin-P的体内作用的化合物，例如中和抗体和受体拮抗剂。
统称为动脉硬化性疾病的疾病特征在于由于动脉硬化的危险因 素造成内膜中膜厚度(IMT)增加，导致动脉的弹性丧失和硬化；胆固 醇酯沉积在动脉内(形成粥样斑)，使血管通道变窄(狭窄)或使阻塞 (阻断)；动脉壁部分扩张(动脉瘤)；动脉整体扩张(动脉扩张)；或 内皮破裂，造成中膜分离(分离)或破裂(出血)，导致遍及组织和器 官的循环不足。在本发明中，动脉硬化性疾病的预防或治疗不仅包括 预防或治疗这些动脉硬化性疾病，而且还包括预防或治疗急性冠状动 脉综合征(ACS; acute coronary syndrome)、缺血性心脏病心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化、闭塞性 动脉硬化症以及由这些动脉硬化性疾病引起的疾病。在此，术语"急 性冠状动脉综合征"是指由动脉硬化粥样斑(斑块)破裂后形成血栓、 接着冠状动脉血流极度减少或阻塞所引起的病理状况。该病理状况的 临床实例包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞和心脏猝死。此外，动 脉硬化在相对粗的动脉例如主动脉、脑动脉和冠状动脉中发生。动脉 硬化的例子包括动脉粥样硬化，其中动脉中膜中胆固醇酯(熔点40 °C )的动脉粥样化积累导致动脉粥样硬化斑块的形成及其厚度的逐渐 增加，从而使动脉腔变窄；由于高血压造成的改变而趋于在脑或肾中 的小动脉中发生的动脉毛细血管硬化，其与整个血管壁的破裂所引起 的堵塞(梗塞)和出血有关；以及动脉中膜中的钙沉积引起的门克伯 格氏动脉硬化(Monckeberg，s arteriosclerosis),其使动脉硬化并导致中 膜变脆。此外，本发明还可以主要应用于预防或治疗动脉壁增厚或斑 块形成。
salusin-財吉抗剂的实例包括所有抑制salusin-(3的作用的化合物，例 如具有拮抗活性的抗salusin-p抗体。
Salusin-ot可以根据氨基酸序列信息通过化学合成来制备，或者可 以通过基因工程技术制备。此外，由SEQIDNO: 1的氨基酸序列缺失、 取代或添加一个或数个氨基酸、并具有salusin-ot的活性的氨基酸序列 组成的肽，也可以用作本发明的用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂。 在此，术语"1个或数个"是指"1-3"个，优选1个或2个，进一步 优选1个。
抗salusin-(3抗体可以通过已知方法作为多克隆抗体或单克隆抗体 而获得，并优选作为单克隆抗体而获得。单克隆抗体的例子包括由杂 交瘤产生的单克隆抗体以及由用含有抗体基因的表达载体通过基因工 程技术转化的宿主产生的单克隆抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤可以 通过如下所述的已知技术而制备。具体地，产生单克隆抗体的杂交瘤 可以通过如下方法制备使用salusin-P或其肽片段作为致敏性抗原通 过已知的免疫方法进行免疫，通过通常的细胞融合法将由此获得的免 疫细胞与已知的母细胞融合，然后通过已知的筛选方法筛选产生单克 隆抗体的细胞。在用salusin-p免疫后，可以将载体蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白与其结合，然后使用。可以用作单克 隆抗体的重组单克隆抗体通过如下方法产生从杂交瘤克隆抗体基因， 将该基因结合到适当的载体中，将该载体导入至宿主中，然后由此经
基因重组技术使抗体产生(例如，参见Vandamme， A. M.等人，Eur. J. Biochem. 1990; 192: 767-775)。这时，编码抗体重链(H链)的DNA 和编码轻链(L链)的DNA可以分别地合并到不同的表达载体中，然 后可以同时用这些表达载体对宿主细胞进行转化。另外可选地，将编 码H链和L链的DNA结合到单个表达载体中，然后可以用该表达载 体对宿主细胞进行转化(参见WO 94/11523)。此外，还可以使用转基 因动物来产生重组抗体。例如，将抗体基因插入至编码独特地在奶中 产生的蛋白(例如，山羊p酪蛋白)的基因中间，从而制备融合基因。 将含有其中插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎 中，然后将胚胎导入到雌山羊中。所需抗体可以从由已接受该胚胎的 山羊所生的转基因山羊、或该转基因山羊的后代所产的奶中获得(Ebert， K. M.等人，Bio/Technology 1994; 12: 699-702)。
本发明的抗salusin-P抗体的例子包括被人为改变以降低对人的异 种抗原性(heterologous antigenicity)的基因重组抗体，例如嵌合抗体 和人源化抗体。这些抗体的例子包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体， 其均可以使用已知方法产生。嵌合抗体可以通过如下方法获得制备
编码抗体V区的DNA，将该DNA与编码人抗体C区的DNA连接， 将生成物结合到表达载体中，将该载体导入宿主中，然后使其产生。 人源化抗体也称作人重构抗体。人源化抗体通过将非人哺乳动物例如 鼠的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区中而制备。 这种人源化抗体可以通过已知的方法制备(参见欧洲专利申请公开第 EP 125023号和WO 96/02576)。人抗体的部分用于嵌合抗体或人源化 抗体的C区。例如，Cyl、 Cy2、 CY3和Q4可以用于H链，Ck禾卩CX 可以用于L链。此外，为了改善抗体或其生产稳定性，人抗体的C区 可以加以修饰。
人抗体可以通过如下方法获得例如，导入人抗体基因座位(gene locus)，然后将抗原给予能够产生人源性抗体的转基因动物。转基因动 物的例子包括小鼠。例如，产生能够产生人抗体的小鼠的方法参见国
13际专利公开WO02/43478的公开文本。
本发明的抗salusin-P抗体的例子不仅包括完全抗体，而且还包括 其功能片段。术语"抗体的功能片段"是指保留了抗体对抗原的一种 或多种作用的抗体部分(部分片段)。其具体例子包括F(ab')2、 Fab'、 Fab、Fv、 二硫键Fv、单链Fv(scFv)及其聚合物[D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998 T. J. International Ltd]。
由此获得的抗体是否具有对salusin-p的拮抗活性可以通过如下方 法确定例如，将抗体与salusin-卩结合，然后验证salusin-P的活性是否 受到了抑制。
对salusin-a或salusin-P具有拮抗活性的化合物可以用作用于动脉 硬化性疾病的预防或治疗剂。
剂量取决于症状、年龄、性别等而变化。通常来说，在口服给药 的情况下，对于成人，剂量范围为每天约0.01 mg至1000 mg，可以一 次给药或数次分别给药。在胃肠外给药的情况下，每次给药约0.01mg 至1000 mg的剂量可以经皮下注射、肌内注射或静脉内注射来给药。 而且，给药时间可以是动脉硬化性疾病的临床症状出现之前或之后。
本发明的预防或治疗剂可以多种形式给药。这些形式的给药途径 的例子包括片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的口服给药，以及 注射制剂、滴剂、栓剂等的胃肠外给药。
含有本发明的对salusin-a或salusin-l3具有拮抗活性的化合物的用 于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂可以根据标准方法配制 (Remington's Pharmaceutical Science,最近版本,Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.),并且这些化合物可以一起含有药物可接受的 载体和药物可接受的添加剂。这些载体和药物添加剂的例子包括水、 药物可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、羧基乙 烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚 糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉 伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、 石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳 糖和可接受作为药物添加剂的表面活性剂。实际的添加剂是取决于本 发明的预防或治疗剂的剂型而从上述例子中单独选择的，或者从上述例子中选择其合适的组合。但是，其实例并不限于此。
此外，本发明的用于动脉硬化性疾病的预防或治疗剂可以含有具
有salusin-P拮抗活性的化合物与salusin-a的组合。
本发明进一步包括下列涉及生物样品中的salusin-cx的化验的方法: 用于检测从其中采集了生物样品的待测受试者是否患有动脉硬化性疾 病的方法、用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法以及用于评价患 动脉硬化性疾病的风险的方法。具体地，本发明可以优选地用于检测 急性冠状动脉综合征。
生物样品的例子包括全血、血清、血浆和尿。这些生物样品中的 Salusin-ot可以进行定量或定性化验。
另外可选地，生物样品可以直接用于其中salusin-oc的化验。然而， 由于生物样品中的salusin-(x含量低，优选地，从生物样品中浓縮或分 离salusin-oc用于化验。这种分离或浓縮可以经固相萃取从血清、血浆、 尿等中进行。在此，术语"固相萃取"是指如下技术使用分离/纯化 用的固定相(固相或吸附剂)例如化学结合硅胶、多孔聚合物、氧化 铝、活性炭等，以选择性的方式从具有复杂组成的样品中专门地萃取 特定的目标成分，从而可以去除样品中的污染物。对于固相萃取，可 以广泛地使用反相分配色谱用的固定相、离子交换色谱用的固定相等。 对于反相色谱用的固定相，可以使用具有例如十八碳烷基甲硅烷基 (C18)、辛基(C8)、 丁基(C4)、三甲基(C3)、苯基(Ph)、 丁基、 三十碳烷基(C30)等的基团的填充剂。其中，优选具有十八碳烷基甲 硅烷基(C18)或辛基(C8)的填充剂。使用市售的萃取柱(cartridge) 用于固相萃取。可以使用注射器型固相萃取柱或盘型固相萃取柱。市 售萃取柱的例子包括Sep-Pak (注册商标，Waters)、 Autoprep (注册商 标，Showa Denko K.K.) 、 Discovery DSC-18 ( SUPELCO )禾B Discovery DSC-8 (SUPELCO)。用于洗脱salusin-a的溶剂的例子包括乙腈、甲醇 和四氢呋喃。在固相萃取之前，将生物样品用三氟乙酸(TFA)进行酸 处理，然后离心。可以使用由此获得的上清液。
另外，可以使用反相色谱柱通过HPLC对预处理过的生物样品进 行分离和纯化。
Salusin可以通过免疫测定例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、 ELISA或荧光测定来进行测定。在测定时，可以使用用放射 性同位素例如1251;酶诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或P-半乳糖苷 酶；或荧光物质例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗salusin-a抗体。 这些免疫学测定可以通过己知的方法进行。例如，将能够与salusin-a 结合的第一配体例如抗salusin-a抗体固定化在塑料制微量滴定板孔等 的孔中的固相载体上。然后，使生物样品与结合在固相上的能够与 salusin-a结合的第一配体例如抗salusin-a抗体发生反应。因此，作为配 体-受体结合反应例如抗体-抗体反应的结果，使样品中的salusin-a经结 合在固相上的第一配体而结合在固相上。随后，进行洗涤，然后使能 够与salusin-a结合的第二配体与结合在固相上的样品中的salusin-a发 生反应。具体地，形成能够与salusin-a结合的第一配体的复合体，例 如己经结合在固相上的抗salusin-a抗体/salusin-a/第二配体。可以使用 抗salusin-a抗体等作为能够与salusin-a结合的第二配体。随后，进行 洗涤，然后测定已经结合在固相上的能够与salusin-ot结合的第二配体 例如第二抗saliisin-a抗体。这种测定可以通过在免疫学分析领域中普 遍使用的多种方法进行。例如，将能够与salusin-ot结合的第二配体用 酶、荧光素、生物素、放射性标记等标记以便产生诸如酶标记产物。 可以通过测定这种标记来测定已经结合在固相上的能够与salusin-a结 合的第二配体。
在测定salusin-a时，不仅可以测定完整的salusin-ot，还可以测定 salusin-oc片段。
从生物样品中分离和纯化salusin-oc用的技术的实例描述如下。
(1) 将三氟乙酸(0.1% (v/v))加入至血清或血浆(2mL)中， 然后以3000rpm离心10分钟。
(2) 将得到的上清液导入至Sep-Pak (注册商标)C18萃取柱中。 萃取柱预先用99.8%甲醇(5mL)、纯水(5mL)和0.1。/。TFA (5mL) 处理。
(3) 用0.1%TFA (lmL)和50%甲醇进行萃取。得到的洗脱液用 离心浓縮机以2000 rpm浓縮至大约100 (iL。
(4) 将测定缓冲液(250 ^L)加入至样品中，以测定其中含有的 salusin-a 。
16可以根据Sato K等人，Peptides, 2006; 27: 2561-2566进行用于测定salusin-oc的分离和纯化方法和RIA测定法。
对于健康受试者，人血清和尿中的salusin-ot浓度分别为23.3 ± 8.1pM和156.8 ±95.8 pM (各值均为均数土SD)。因此，当待测受试者的血清或尿中的salusin浓度显著低于健康受试者时，可以判断出待测受试者患有动脉硬化性疾病或处于患动脉硬化性疾病的明显危险中。Sahisin浓度显著低的情况的例子是如下情况当与上述健康受试者的均数和SD相比较时，salusin浓度小于均数-lxSD，优选均数-2xSD，进一步优选小于均数-3 x SD。另夕卜，动脉硬化性疾病越严重，salusin-a的浓度越低。例如，对于急性冠状动脉综合征(ACS)的情况，随着病变的进展程度以单支冠状动脉病变组、两支冠状动脉病变组和3支冠状动脉病变组的顺序增加，待测受试者的生物样品中的salusin-oc浓度减少。另外，生物样品中的salusin-oc浓度和用作动脉硬化指标的内膜-中膜复合体厚度体(IMT:内膜中膜厚度)之间呈负相关。IMT越厚，salusin-a的浓度越低。因此，salusin-a可以代替IMT来用作动脉硬化性疾病进展的指标。此外，salusin-oc能有效地用于急性动脉硬化性疾病的检测。
此外，通过常规检测从待测受试者采集的生物样品的salusin-a，并监测salusin-a的浓度，可以对动脉硬化性疾病的进展进行管理。
Salusin-a可以用作检测/诊断动脉硬化性疾病的标志物。本发明包括salusin-a作为检测动脉硬化性疾病的检测标志物的用途，并进一步包括用于检测/诊断动脉硬化性疾病的包括salusin-a的疾病检测/诊断标志物。
下文参考下列实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于此。
在下面的实施例中，从人外周血制备单核细胞并培养7天，使其分化为巨噬细胞。这时，同时向其中加入salusin-ot(0-10nM)和salusin-p(0-10 nM)，并考察salusin的作用。
从人外周血获得的单核细胞的培养通过已知方法进行。分离的单核细胞添加RPMI-1640(15 mL)进行培养，然后用血细胞计数室(bloodcell counting chmber)对漂浮的单核细胞进行细胞计数。细胞接种在6-cm皿中，以得到4 x 106细胞/2 mL。单核细胞在37。C下在5% C02 的存在下保温1小时，使细胞粘附在皿上。培养基替换为含有10%人 血清的RPMI-1640，然后培养7天。培养基每3天更换一次。
实施例l:salusin-a和salusin-p对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT-1 蛋白质表达的影响
ACAT-1是一种将细胞内游离胆固醇转化成胆固醇酯的内质网酶。 ACAT-1基因对于巨噬细胞的泡沫化非常重要。为了考察salusin-a和 salusin-l3对ACAT-1表达的影响，通过蛋白质印迹法(Western blotting) 考察ACAT-1蛋白质的表达。
将己培养7天的单核细胞源性巨噬细胞用PBS洗涤3次，然后向 每个皿中加入10。/。SDS (十二烷基硫酸钠)(100 pL)进行溶解。用细 胞刮棒铲起每种细胞提取溶液，然后使用1-mL TERUMO注射器和破 碎(剪切)用23-G注射针进行粉碎。生成物以15,000 rpm离心3分钟 (Himac CF15D2高速微型低温离心机；Hitach, Ltd.)。上清液中的蛋 白质浓度通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid， BCA)法(Pierce)测 定，并用作蛋白质印迹法用的细胞提取溶液。
将本发明实施例中获得的每种培养上清液中的ACAT-1或ABCA-1 根据下面所述的方法通过蛋白质印迹法进行测定。 ACAT-1蛋白质检测
对于ACAT-1蛋白质检测，使用通过对兔进行免疫制备的抗人 ACAT-1多克隆抗体(DMIO， Dr. Chang, Dartmouth Medical School惠 赠)[Chang CCY等人，J Biol Chem. 1995; 270: 29532-29540]作为第一 抗体(终浓度0.5|ag/mL)，用于在室温下在转移膜上反应1小时。转 移膜用PBS-0.1% Tween 20洗涤，然后与第二抗体(抗兔IgG抗体 结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG驴抗体(GE Healthcare Bio-Science))在室温下反应1小时。对于第二抗体，用PBS-0.1% Tween 20 (5 mL)将原液(0.5 pL)稀释10,000倍，使用生成物。用PBS-0.1% Tween 20进行洗涤，然后使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)进行ACAT-1蛋白质检测。 ABCA-1蛋白质检测对于ABCA-1蛋白检测，与抗人ABCA-1抗体的反应在转移膜上 在室温下进行1小时。对于第一抗体(抗人ABCA-1兔多克隆抗体 (Funakoshi Corporation))，用PBS隱0.1 。/。 Tween 20 (5 mL )将原液(5 pL)稀释1，000倍，使用稀释液。转移膜用PBS-0.1。/。Tween20洗涤。 然后，与第二抗体(抗兔IgG抗体结合有辣根过氧化物酶(HRP) 的抗兔IgG驴抗体(GE Healthcare Bioscience))的反应在室温下进行 1小时。对于第二抗体，用PBS-0.1%Tween20 (5mL)将原液(0.5 pL) 稀释10,000倍，使用稀释液。用PBS-0.in/。 Tween 20进行洗涤，然后 使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)进行ABCA-1蛋白质 检测。
将人外周血单核细胞(4 x 1(^细胞/6-cm皿)在含有10%人血清的 RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天，以分化成为巨噬细胞。为了 考察salusin对ACAT-1蛋白质表达的剂量依赖性影响，在培养开始时 将salusin-a或salusin-p以0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0 nM的浓度添力口 到培养基中。在培养第7天时，将从单核细胞分化的巨噬细胞用PBS 洗涤，然后溶解在10% SDS (100 pL)中，然后使用ACAT-1特异性 抗体进行蛋白质印迹法。结果，发现salusin-oc以依赖浓度的方式抑制 大约40。/。ACAT-l蛋白质的表达(图2A)。同时，salusin-(3在0-0.6 nM 的浓度下以依赖浓度的方式促进ACAT-1蛋白质的表达。Salusin-P的作 用在0.6 nM时达到峰值水平，这时ACAT-1蛋白质表达水平增加至对 照的2.1倍。Salusin-P促进ACAT-1蛋白质表达的作用在0.6 nM以上的 浓度下逐渐衰减(图2B)。
接下来，考察在单核细胞分化为巨噬细胞的分化期间salusin-a或 salusin-P对ACAT-1蛋白质表达的时间依赖性影响。将人外周血单核细 胞(4x 1()S细胞/6cm皿)培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培 养期间加入0.6 nM salusin-a或salusin-p。在接种后1、 3、 5或7天时 用PBS洗涤每个皿。将其中反应已在第l、 3、 5天终止的皿暂时冷冻 在-8(TC下，并在第7天时解冻。将由此获得的细胞以及接种后7天时 的细胞溶解在10n/。SDS (100 pL)中。作为通过蛋白质印迹法的考察 结果，发现在接种后第1、 3或5天用salusin-a处理的细胞中的ACAT-1 蛋白质表达没有显著地不同于对照细胞。但是，在第7天时表达受到
19了显著的抑制。发现用salusin-(3处理的细胞中的ACAT-1蛋白质表达水 平显著地增加到高于对照细胞在第5天或更晚时的表达水平(图3)。
实施例2: salusin-a和salusin-(3对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT 活性的影响
对于ACAT活性测定，使用脂质体重组法。该方法涉及使用如下 体系使用包括胆固醇/磷脂酰胆碱的混合胶束将存在于内质网中的 ACAT-1蛋白质重组到脂质体中，从而达到可用作ACAT-1底物的胆固 醇的饱和浓度水平[Cheng D等人，J Biol Chem. 1995; 270: 685-695.]。 在常规使用的微粒体法中，使用内源性地存在于内质网中的胆固醇作 为底物。但是，通常地，内质网膜缺乏胆固醇。因此，认为没有达到 能够用作ACAT底物的胆固醇的饱和水平，导致低估ACAT的活性。 在此，通过向反应体系中添加另一种底物^C]油酰基-CoA并测定通过 ACAT反应生成的胆固醇["C]油酸酯来测定ACAT的活性(图4)。
该实施例中使用的细胞提取溶液说明如下。
将外周血人单核细胞(4 x 106细胞/2 mL)接种在4-6个6-cm皿中， 并培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入salusin-a或 salusin-p。然后，考察salusin-a或salusin-P对ACAT活性的效应。培养 7天后，将细胞用已经冷却至4"C的PBS洗涤两次，向其中加入低渗缓 冲液(1 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH 7.4) (2mL/皿)，将生成物放置 5分钟。这些操作的目的在于通过渗透压来粉碎细胞膜，洗涤排出的细 胞质蛋白质，并浓縮含有ACAT-1的膜蛋白。将皿颠倒，以充分地去除 其中的缓冲液。在使用前立即向其中一皿中加入含有蛋白酶抑制剂鸡 尾酒(cocktail) (SIGMA) (1/1000体积)的缓冲液A (50 mMTris-HCl， lmMEDTA，pH7.4) (100 pL)。用细胞刮棒从其中回收细胞。将缓冲 液(100 |LiL)转移到在相同条件下培养的下一皿中，然后进行相同的 操作。最后，将4-6个皿合并在一起，以浓縮膜蛋白。将回收的细胞提 取溶液(1 mL)导入到Teflon匀浆器中，然后进行3组匀化作用(每 组20冲程)。在冰上进行均化，组间的暂停时间为大约1分钟。匀化 过的细胞提取溶液的蛋白质浓度通过BCA法(Pierce)进行定量测定。 将细胞提取溶液与4 M KC1 (1/3体积)和20% CHAPS (1/9体积)混合(使得KC1的终浓度为1M且CHAPS终浓度为2%)。蛋白质浓度用 含有1 M KCl和2% CHAPS的缓冲液A调节。生成物在室温下放置10 分钟。
混合胶束如下制备。
将氯仿(172.4 [iL)中的100 mg/mL蛋黄L-a-磷脂酰胆碱(SIGMA) 和苯(62|uL)中的20 mg/mL胆固醇(SIGMA)导入至闪烁管中并进 行涡旋，然后用氮气干燥。向其中加入10%牛磺胆酸(SIGMA) (100 ILiL)、 10 x缓冲液A (100|liL)和无菌纯净水(800|liL)，生成物进行 涡旋。在避光的同时，将瓶中的空气用氮气置换，然后超声IO分钟， 并在冰上冷却5分钟。上述操作重复约10次，从而获得基本上透明的 生成物。超声之后，向其中加入无菌纯净水(lmL)，然后充分混合。
通过制备含有1 mM ["C]油酰基CoA (GE Healthcare Bio-Science, CFA634, 1.85 MBq) (16pL)、 34 mM冷的油酰基-CoA (SIGMA) (10 ILiL)、 0.25 M Tris國HCl (pH 7.8)中30 mg/mL的BSA (834 pL)和无 菌纯净水(996 pL)的2，00(HiL溶液，得到0.25 mM ["C]油酰基-CoA 混合物。
薄层色谱法(TLC)如下进行。
通过将胆固醇油酸酯(SIGMA) (20 mg)加入到异丙醇(4mL) 中，将混合物在6(TC的热浴中加热进行溶解，并进一步向其中加入0.91 g/mL甘油三油酸酯(SIGMA) (20 pL)，从而制备TLC标准物。通过 毛细管点样将TLC标准物(60 fiL)点在TLC铝板(20 x 20 cm)上的 硅胶60F254 (Merck)上。制备己烷/二乙醚/乙酸(90:10:1， v/v)作为 展开溶剂。
将混合胶束(140 jiL )加入到蛋白质量恒定的细胞提取溶液(80-100 pg)中，将生成物缓慢混合并在冰上静置10分钟。然后，向其中加入 ["C]油酰基-CoA混合物(20pL)，然后在不导致发泡的情况下进行混 合。生成物在37'C下保温30分钟以进行反应。之后，向其中加入氯仿 /甲醇(2:l,v/v) (3mL)和无菌纯净水(lmL)，生成物进行涡旋，使 反应终止。以2，500rpm离心10分钟(TOMYLC-120低速离心机，转 子7015-06)。然后，从中去除上层(水层)，下层(油层)用氮气干燥。 将提取出的脂质用异丙醇(60 jiL)溶解。生成物在标准物点之间点样。将脂质展开，直至展开溶剂到达玻璃室中TLC板的上边缘。将TLC板
转移到另一玻璃室内，该室内已经分散有少量的碘用来使TLC标准物
的脂质显色。将对应于胆固醇油酸酯的部分用剪刀切下，置于瓶中，
然后添加闪烁鸡尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)进行测定。对于比活性 测定，测定["C]油酰基-CoA混合物(10 ^L)的放射活性。将通过ACAT 反应生成的胆固醇["C]油酸酯的放射活性(cpm)除以反应系统中使用 的细胞蛋白质的量(mg)、 ["C]油酰基-CoA的比活性(cpm/pmo1)和 反应时间(10分钟)，计算ACAT活性水平(pmol/mg细胞蛋白质/min)。
发现Salusin-a或salusin-卩引起了 ACAT-1蛋白质表达的改变。因 此，考察了 salusin-a或salusin-P对ACAT酶活性的效应。将人外周血 单核细胞(4xl06细胞/皿)在含有10%人血清的RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时，在培养期间向培养基中 力口入0.6 nM salusin-a或salusin-(3。
通过向细胞提取溶液中加入混合胶束(胆固醇/磷脂酰胆碱)将 ACAT-1蛋白质重组到脂质体中。将["C]油酰基-CoA加入到所得的样 品中，然后在37"C下反应10分钟。测定通过ACAT反应生成的胆固醇 ["C]油酸酯的放射活性，然后计算ACAT活性。结果，发现在用salusin-a 处理的细胞中的ACAT活性已经被抑制到对照的50n/。。同时，发现在 用salusin-P处理的细胞中的ACAT活性已经增加到对照的1.8倍水平 (图5)。
实施例3: salusin-cx和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞中的ACAT-1 mRNA表达的影响
使用TRIzol试剂(LIFETECHNOLOGIES)进行RNA提取。 将细胞在培养基中培养7天，然后去除培养基。细胞用PBS洗涤 3次。从中充分去除PBS，并向其中加入TRIzol (1 mL)用于细胞溶 解。将细胞提取溶液吸入吸出5次，然后转移到新的Eppendorf管中。 然后，将该管在室温下放置5分钟。向其中加入氯仿(200jiL)，然后 剧烈振摇15秒。该管进一步放置2-3分钟，并以12,000 rpm离心15 分钟(Himac CF15D2高速微型低温离心机；Hitach, Ltd.)。将上层转 移至新的Eppendorf管中，并向其中加入异丙醇(500 pL)，然后上下
22颠倒地混合。将该管放置10分钟，并以12,000 rpm离心10分钟。从 生成物中去除上清液。将75%乙醇(180 (iL)加入至剩余的沉淀中， 然后以15,000 rpm离心5分钟。从生成物中去除上清液，然后风干。 生成物溶解在无菌纯净水(90 pL)中，并在65"C下保温10分钟。向 其中加入脱氧核糖核酸酶(DNase) I溶液(IOjliL)，并将生成物在37 。C下保温15分钟。向其中加入3M乙酸钠(10nL)和苯酚/氯仿(1:1， v/v) (IOOjiL)，然后振摇。以15,000 rpm离心3分钟。将上清液收集 在新的Eppendorf管中。向其中加入氯仿/异戊醇(24:1, v/v) (100 pL), 并将该管进一歩以15,000 rpm离心3分钟。收集上清液，并向其中加 入乙醇(200|iiL)。将生成物在-8(TC下放置30分钟或更长时间，然后 以15,000 rpm离心IO分钟。去除上清液。将生成物用70%乙醇洗涤并 干燥。将得到的产物溶解在无菌蒸馏水(15pL)中。通过测定260nm 处的吸光度，得到由此获得的RNA溶液的浓度。将无菌纯净水加入至 溶液中，以达到预定的浓度。
接下来，通过实时RT-PCR法来分析ACAT-1 mRNA的RNA表达。 使用以下各个人mRNA序列，通过Primer Express 1.0版(PE Biosystems)确定引物序列。 卩-肌动蛋白
正向引物5，-CCTGGCACCCAGCACAAT (SEQ ID NO: 5 ) 反向引物5'國GGGCCGGACTCGTCATAC (SEQ ID NO: 6) ACAT画l
正向引物5，-TTCGGAATATCATCAAACAGGAGCC(SEQIDNO: 7) 反向引物5，画CACACCTGGCAAGATGGAGTT (SEQ ID NO: 8 ) 将用salusin-a或salusin-(3处理的外周血人单核细胞(4 x 106细胞/6 cm皿)在含10%人血清的RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天， 以分化成巨噬细胞。从用salusin-a或salusin-p处理的细胞和未经处理 的细胞中提取总RNA。对每种总RNA (1 jig)进行逆转录反应以进行 cDNA合成。
进行实时PCR，以便对使用qPCR MasterMix SYBR Greenl (Eurogentec)通过GeneAmp 5700序歹ll检领lj系统(Applied Biosystems Japan)获得的cDNA进行定量。接下来，通过下述方法进行逆转录反应。
将随机引物(TaKaRa, 80nM) (0.5 pL)和无菌纯净水(10.5 |iL) 加入到各总RNA溶液(1 pg/(iL) (1 (iL)中，然后在7(TC下加热10 分钟。向其中加入核糖核酸酶(RNase)抑制剂(0.75 pL)、5 x First Strand Buffer (Invitrogen) (4 |tiL)、 O.IM二硫苏糖醇(2 (iL)、 2.5 mM dNTP
(TaKaRa) (4 ^L)禾口 Superscript II (200 U/|uL; Invitrogen) (lpL)， 然后在37"C下反应1小时。在95'C下变性5分钟后，将生成物在冰上 冷却，并向其中加入无菌纯净水(40pL)。
通过下述方法进行实时RT-PCR。
将qPCR MasterMix SYBR Greenl (12.5 pL)、引物溶液(正向+反 向每种5pM) (2.5 pL)和无菌纯净水(8pL)加入到通过逆转录反 应获得的cDNA溶液(2)aL)中，然后进行反应。
PCR循环包括一个循环的95°C/10分钟，以及40个循环的94°C/20 秒、55 °C/20秒和72 °C/30秒。
发现Salusin-a和salusin-卩引起ACAT-1蛋白质表达和ACAT活性 的改变。因此，进一歩考察salusin-a和salusin-P对ACAT-1 mRNA表 达的影响。将人外周血单核细胞(4xl(^细胞/皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时， 在培养期间加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a或 salusin-p对ACAT-1 mRNA表达的影响。在培养第7天时，从细胞中提 取总RNA。通过实时RT-PCR考察salusin-a和salusin-p对ACAT-1 mRNA的影响。因此，发现salusin-a将ACAT-1 mRNA的表达水平抑 制至对照的80%的水平，发现salusin-(3将ACAT-1 mRNA的表达水平 增加至对照的1.6倍(图6)。
实施例4: salusin-a和salusin-p对人单核细胞源性巨噬细胞泡沫化(胆 固醇酯的积聚)的影响
采用胆固醇酯化测定作为巨噬细胞泡沫化的测定方法[Goldstein JL等人，Methods Enzymol. 1983; 98: 241-260]。巨噬细胞使乙酰化LDL (AcLDL)经清道夫受体而结合到细胞中，从而引起溶酶体降解。将 在溶酶体中产生的游离胆固醇转移至ACAT，并因ACAT反应而转化
24成胆固醇酯。如果向培养基中加入fH]油酸酯，贝1」[3司油酸酯被结合到 细胞中，并被酰基CoA合成酶转变为[SH]油酰基-CoA。 ACAT使用 AcLDL来源的游离胆固醇和如上所述获得的[SH]油酰基-CoA作为底 物，产生胆固醇[3司油酸酯。细胞中积聚的胆固醇[3司油酸酯的放射活 性可以用作胆固醇酯积聚的敏感指标(图7)。 人血浆LDL通过下述方法纯化。
通过顺序浮选超速离心从人血桨纯化LDL (d = 1.019-1.063) [SchumakerVN等人，Methds Enzymol. 1986; 128: 155-170]。将人血浆 (350mL)分配到6个离心管中，使用RP-42转子在4。C下以100,000 xg (36,000 rpm)超速离心20小时。从生成物中去除含有乳糜颗粒和 极低密度脂蛋白(VLDL)的混浊上层，使用抽吸器回收下层(黄色层)。 获得的已经去除乳糜颗粒和VLDL的血浆成分的体积用量瓶测量。其 比重用浮动比重计(floatinghydrometer)测定。向其中加入固体KBr， 直至达到"d= 1.063"的条件。假设"V"代表获得的已经去除乳糜颗 粒和VLDL的血浆成分的体积，"D"代表其比重，则可以通过下式来 大致计算达到1.063 g/mL的比重所必须加入的KBr的量。 KBr (g) =V (1扁國D) / 0.68323
将已被调节达到"d= 1.063"的含LDL的血浆成分的一半体积分 配到6个离心管中。将密度溶液(d= 1.063)导入其中至每个离心管的 边缘的水平。使用RP-42转子在4。C下以100,000 xg (36,000rpm)超 速离心20小时。然后，用巴斯德吸管回收上层(黄色层)(粗LDL)。 上述成分的剩余一半体积用相同的方式分配，然后进行超速离心。然 后，回收上层(黄色层)(粗制LDL)。将上述两项操作获得的各个部 分粗LDL混合在一起。将生成物分配到6个离心管中。将密度溶液(d =1.063)导入其中至每个离心管边缘的水平。使用RP-42转子在4。C 下以100，000xg (36,000 rpm)超速离心20小时。然后，回收上层(黄 色层)(纯化LDL)。将LDL加入至透析膜，然后使用EDTA-盐水(4 L) 在室内在低温下透析。重复3次12小时的透析。将生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)浓縮，使得蛋白 质浓度为约2mg/mL，然后使用滤器无菌过滤。通过BCA法(Pierce) 测定蛋白质浓度。LDL用于制备下述的AcLDL。AcLDL以下述方式制备。
将等体积的LDL (蛋白质30mg)(如果为2.0 mg蛋白质/mL则 15mL)和饱和乙酸钠混合在一起。将混合物在冰上冷却，并用搅拌棒 搅拌，期间逐滴加入乙酸酐(150 pL) (5iuL/LDLmg蛋白质)(每滴5 pL) [Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994;269:5264-5269.]。这时，向 其中逐滴加入5 N NaOH，用pH计监测pH，使得pH可以维持在6.5 以上。将生成物在冰上放置1小时，然后使用EDTA-盐水(4L)在室 内在低温下透析。重复3次12小时的透析。将生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)浓縮。通过BCA 法(Pierce)测定蛋白质浓度。由此获得实验用的AcLDL。
用于下述操作的试剂如下。油酸(185MBq，在1 mL甲苯中，GE Healthcare Bio-Science) (油酸摩尔浓度0.625 mM)
3 mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA):白蛋白浓度为100 mg/mL (1.5 mM)， lmol试剂结合2-mol油酸。 制备3 mM [3司油酸混合物
将[9,10(n)-3H]油酸(50 |LiL) (9.25 MBq)导入至玻璃烧杯中，并 用氮气干燥。将3mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA) (5mL)倒入玻 璃烧杯，然后用搅拌棒搅拌5小时，然后用2卞m滤器无菌过滤。
将人外周血单核细胞(4 x 106细胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时， 在培养其月间力B入0.6 nM salusin-oc或salusin画p。考察salusin國ot禾Q salusin-p 对细胞内胆固醇酯积聚(胆固醇酯化)的影响。在第7天，更换培养 基。向细胞中加入5 (ig/mLAcLDL、 3 mM [3司油酸混合物(67 |uL)(终 浓度0.1 mM)禾B 0.6 nM salusin-a或salusin-p。进一步向其中加入适 当量的培养基，以得到2mL的总量，然后再培养18小时。细胞用PBS 洗涤3次。向每个皿中加入己垸/异丙醇(3:2，v/v) (lmL)。每个皿在 室温下放置l小时。将己垸/异丙醇回收到脂质提取管中。此外，向每 个皿中加入1 mL己烷/异丙醇，以洗涤细胞和皿壁，然后回收到同一 脂质提取管中。脂质提取后，向每个皿中加入lNNaOH (lmL),以 进行蛋白质提取。将脂质提取管涡旋，并在室温下放置30分钟，然后用氮气干燥。将提取的细胞脂质进行涡旋，并加入60)lL异丙醇溶解。
将其总量广泛地在标准物点之间点样。通过TLC进行展开，使得展开 溶剂(己垸/二乙醚/乙酸(90: 10: 1，v/v))到达TLC板的上边缘。将 TLC板置于玻璃室中，用碘使脂质显色。将对应于胆固醇油酸酯的部 分用剪刀切下，并将该部分置于闪烁瓶中，然后加入闪烁鸡尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)进行测定。回收之前加入至每个皿中的1NNaOH，并 通过BCA法(Pierce)对细胞蛋白质进行定量测定。测定3 mM [3H] 油酸混合物的比活性(dpm/nmo1)。将细胞中产生的胆固醇[3司油酸酯 的放射活性(dpm)除以卩H]油酸的比活性(dpm/nmo1)和细胞蛋白质 的量(mg)，从而计算胆固醇的酯化(nmol/mg细胞蛋白质)。
ACAT-1是促进巨噬细胞泡沫化的重要因子。上述实验揭示了 salusin-oc和salusin-(3以相反的方式影响着ACAT-1的表达和ACAT的活 性。因此，考察salusin-a和salusin-p对巨噬细胞泡沫化的影响。
将人外周血单核细胞(4 x 106细胞/6 cm皿)培养7天，以分化成 巨噬细胞。这时，考察在培养期间同时加入的0.6 nM salusin-a和 salusin-P对巨噬细胞泡沫化的影响。在培养第7天，向细胞中加入5 吗/mL AcLDL、 0.1 mM [3司油酸混合物和0.6 nM salusin-ot或salusin-(3。 细胞进一步培养24小时，然后测定细胞中积聚的胆固醇[3司油酸酯。 当对照细胞载有AcLDL时，观察到积聚的胆固醇[3司油酸酯为5.6 nmol/mg细胞蛋白质。该结果是载有AcLDL的细胞(未负载对照细胞) 所获得结果的6.3倍。在用salusin-a处理的细胞中由AcLDL引起的胆 固醇[3司油酸酯的积聚程度降低至与对照细胞(负载对照)的50%对应 的水平。在用salusin-P处理的细胞中积聚程度增加至对照细胞的1.6倍 的水平(图8)。
实施例5:考察乙酰化LDL (AcLDL)的细胞参入量-测定A型清道夫 受体(SR-A)的活性
清道夫受体是在巨噬细胞上表达的脂蛋白受体。其识别修饰的 LDL例如氧化LDL或AcLDL，引起胞吞作用。己经参入至细胞内的 该受体的配体在溶酶体中降解。这种清道夫受体在巨噬细胞形成泡沫 细胞中发挥着非常重要的作用。清道夫受体的已知例子包括A型清道夫受体(SR-A)、 CD36、凝集素样氧化LDL受体-1 (LOX-l)和CD68 [Greaves DR等人，J Lipid Res. 2005; 46: 11-20.]。氧化LDL可以与四 种类型的上述清道夫受体结合。然而，与AcLDL结合的清道夫受体只 有SR-A。在该实验中，使用修饰LDL的代表性实例AcLDL作为配体， 测定作为能够识别AcLDL的专用清道夫受体的SR-A的活性(图9)。
将外周血人单核细胞(4 x 106细胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培养基(2 mL)中培养7天，以分化成巨噬细胞。这时， 在培养期间加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a和 salusin-P对[^I]AcLDL的胞吞活性(SR-A活性)的影响。在第7天， 更换培养基。将适当量培养基加入[^I]AcLDL (5-10 (ig/mL)和0.6 nM salusin-a或salusin-J3中，以得到2 mL的总量。细胞进一步培养18小时。
将细胞用含有3% BSA的PBS洗涤一次，然后用PBS洗涤两次。 向其中加入0.1NNaOH (lmL)，生成物在室温下放置30分钟。将细 胞回收到聚苯乙烯管(12 x 75 mm, Fisher Scientific Company)中，进 一步用0.1NNaOH (lmL)洗涤，并再次回收。细胞提取溶液的总量 使用Y计数仪测定。其一部分的蛋白质浓度通过BCA法(Pierce)测定。 通过将细胞提取溶液的放射活性(cpm)除以[^I]AcLDL的比活性 (cpm/吗)和每皿的细胞蛋白质量(mg)，计算[^I]AcLDL的细胞结 合(吗/mg细胞蛋白质)[Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994; 269: 5264-5269]。
降解测定通过下述方法进行。
经清道夫受体被巨噬细胞参入的["I]AcLDL在溶酶体中被降解。 [巧]AcLDL的蛋白质部分——[125I] apo B-100被蛋白质降解酶破碎以 形成肽，从而被分泌至细胞外，然后其可以在三氯乙酸可溶部分中发 现。同时，在培养基中没有被巨噬细胞参入的[^I]AcLDL不溶于三氯 乙酸，因此可以通过离心以沉淀物的形式得以分离。
从每种培养上清液中收集一部分(750 |iL)到聚苯乙烯管(12x75 mm, Fisher Scientific Company)中。向其中加入40%三氯乙酸(250 )uL) 禾口0.7MAgNO3 (200 nL)，并将混合物涡旋，然后以2,500 rpm离心 10分钟(TOMY, LC-120低速离心机，转子7015-06)。通过凝胶过滤 去除大部分在以碘标记AcLDL的步骤中未与蛋白质反应的游离125I。但是，发现其一部分仍然有剩余。在该步骤中，剩余部分的1251可以通 过加入AgN03而以Ag[^I]的形式沉淀出来。因此，培养上清液中不溶
于三氯乙酸的部分含有未被细胞参入的[^I]AcLDL和来源于游离1251 的Ag[1251]。另夕卜，已被细胞加工的来自[^I]AcLDL的肽专一地在可溶 于三氯乙酸的部分中检测出。离心之后，将上清液(600 )LiL)收集到 不同的管中，并用Y计数仪测定。基于测定结果，对每个皿计算培养上 清液中可溶于三氯乙酸的部分的总放射活性(cpm)。通过将总放射活 性除以[，]AcLDL的比活性(cpm/jig AcLDL蛋白质)和每皿的细胞 蛋白质量(mg)，得到[^I]AcLDL的降解率()ng/mg细胞蛋白质)。
作为上述实验的结果，其揭示了 salusin-a和salusin-(3控制着巨噬 细胞的泡沫化。因此，考察受salusin控制的SR-A活性是否会影响上 述现象。细胞内参入的AcLDL的蛋白质部分(apoB-100)被溶酶体中 的蛋白质降解酶降解成肽，从而被分泌至细胞外。在结合测定中，测 定存在于细胞表面或细胞内部的1251的放射活性。在降解测定中，测定 已在溶酶体中被破碎成肽、并被分泌至细胞外的[^I]AcLDL(apoB-100 肽片段)的放射活性。基于两种测定，确定SR-A的活性。
将人外周血单核细胞(4x 1()S细胞/6cm皿)培养7天，以分化成 巨噬细胞。这时，在培养期间加入0.6nMsalusin-a或salusin-(3。然后， 考察salusin-oc和salusin-P对[^I]AcLD的参入和降解的影响。在此，在 培养第7天时，向细胞中加入5-10吗/mL [125I]AcLDL禾口 0.6 nM salusin-a或salusin-(3，并将细胞进一步培养18小时。然后，进行结合 测定和降解测定。结果，在任一测定中，与对照细胞相比，都观察不 到由salusin-ot和salusin-(3引起的显著变化。(图10A禾B IOB，图10A 显示结合测定结果，图10B显示降解测定结果。)因此，已经揭示出， salusin-a和salusin-P影响AcLDL参入细胞后的胆固醇代谢，但不影响 SR-A的活性。
实施例6: salusin-a和salusin-P对人单核细胞源性巨噬细胞中的ATP结 合盒转运体A1 (ABCA-1)蛋白质表达的影响
控制巨噬细胞泡沫化现象的一种机制是经ABCA-1向细胞外分泌 游离胆固醇的机制(胆固醇外流)。考察salusin对ABCA-l蛋白质表达的影响。将外周血人单核细胞(4x 1(^细胞/6cm皿)培养7天，以 分化成巨噬细胞。这时，在培养期间加入salusin-ot或salusin-P (0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0nM)。然后，考察salusin-a和salusin-卩对ABCA國1 蛋白质表达的影响。在前述使用ABCA-1特异性抗体进行蛋白质印迹 法的情况下，发现salusin-oc和salusin-P均没有引起ABCA-1蛋白质表 达的显著变化。(图11A和11B:图11A显示salusin-ot的结果，图11B 显示salusin-p的结果。)
实施例7: salusin-a和salusin-P对分化后的培养的人单核细胞源性巨噬 细胞中的ACAT-1蛋白质表达的影响
在实施例1-6中每一个实验中，在培养的人单核细胞分化为巨噬细 胞的分化期加入salusin-a和salusin-p，使用培养第7天获得的细胞来 考察salusin-a和salusin-(3的影响。在该实施例中，考察salusin-a和 salusin-(3是否对分化后获得的巨噬细胞中的AC AT-1蛋白质表达具有类 似的影响。将外周血人单核细胞(4x 1()S细胞/6cm皿)培养7天，以 分化成巨噬细胞。在第7天时，向其中加入salusin-ot和salusin-P (0、 0.4、 0.6或1.0nM)，巨噬细胞进一步培养3天。作为通过蛋白质印迹 法对ACAT-1进行考察的结果，1.0 nM salusin-ot将ACAT-1蛋白质的表 达水平降低至与对照的60。/。对应的水平。同时，0.6nMbsalusin-(3将上 述表达水平增加至对照的2.2倍水平(图12A和12B，图12A显示 salusin-a的结果，图12B显示salusin-P的结果。)。基于这些结果己经揭 示出，即使在单核细胞分化成巨噬细胞之后，salusin-ot或salusin-P对 ACAT-1表达的控制仍然得以保持。
以下是在上述实施例中通过考察新的血管活性物质(即salusin-a 和salusin-p)对培养的人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫化(细胞内胆 固醇酯积聚)以及与该泡沫化有关的基因表达的影响获得的主要结果。
(1) salusin-ot抑制由AcLDL引起的巨噬细胞泡沫化，salusin-(3则 促进由AcLDL引起的巨噬细胞泡沬化。
(2) salusin-ot抑制细胞内胆固醇酯化酶ACAT-l的表达，salusin-卩 则促进该酶的表达。
(3) SR-A能够识别并细胞内参入AcLDL的活性不受salusin-a或salusin-p的影响。
(4)在细胞内胆固醇转运中发挥重要作用的ABCA-1的表达不受 salusin-oc或salusin-p的影口向。
基于上述结果己经揭示，培养的人单核细胞源性巨噬细胞的泡沫 化以相反的方式受salusin-a和salusin-P的控制，而且控制该泡沫化的 机制涉及到salusin-oc和salusin-P以相反的方式控制ACAT-1的表达。
另外，已有报道称salusin-(3对促进血管平滑肌细胞或成纤维细胞 增殖的正面效果不受用salusin-oc预处理的抑制，因此，可以获得 salusin-a和salusin-p的累加效应[Shichiri M等人，Nat Med. 2003; 9: 1166-1172]。该报道提出，salusin-a和salusin-p可能经由不同的受体作 用于这些细胞。另外，Wang等人已报道称，在其中已经表达有小鼠 mas样G蛋白偶联受体Al (mMrgAl)的HEK293T细胞中，salusin-P 被认为是配体[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。同 时，salusin-a不作为mMrgAl的受体，表明salusin-a和salusin-(3由不同 的受体识别[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。在该 研究中，获得的结果表明salusin-a和salusin-P以相反的方式作用于巨 噬细胞的泡沫化和ACAT-1表达。因此，可以假设salusin-ot和salusin-P 经由巨噬细胞中表达的不同受体发挥作用。
实施例8: salusin-a和salusin-(3在人冠状动脉的动脉硬化病变中的表达 从死于急性冠状动脉综合征(ACS)的患者(72岁男性)制备冠 状动脉病理切片，并用己纯化的免疫化学组织染色用抗salusin-a和-p 抗体极性染色。不仅在冠状动脉的斑块部分中的平滑肌细胞和成纤维 细胞中，而且在脂纹中的巨噬细胞源性泡沫细胞中，都观察到强的 salusin-P表达(图13A-13D)。 Salusin-a禾B salusin-卩被认为由共用前体 (Preprosalusin)的共同部分产生。但是，在其中有强salusin-P表达的 冠状动脉的动脉硬化病变中基本上观察不到salusin-ot的表达。在其他3 名患者(一名40岁男性、 一名76岁女性和一名86岁女性)中也证实 了类似的发现。作为上述考察的结果，已经阐明，强的salusin-p表达 和降低的salusin-ot表达均深入地参与了人冠状动脉硬化的进展。
31实施例9:使用salusin-a作为标志物检测动脉硬化
考察64名中老年男性(40-86岁)的血清salusin-a浓度和动脉硬 化之间的关系。对于动脉硬化评价，使用可以简单、非侵入的方式进 行的颈动脉超声波心动描记法(模式B)。测定每一侧颈动脉内膜-中膜 厚度(IMT)的最大水平(最大IMT)。在健康人中最大IMT为1 mm 或更小。已经证明，最大IMT大于1 mm是急性冠状动脉综合征(ACS)、 中风等的危险因素。通过Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566中 所述的放射免疫测定法来测定血清salusin-ot的浓度。血清salusin-a浓 度与颈动脉最大IMT之间呈显著的负相关(r = 0.29, P< 0.02;图14)。 这表明，血清salusin-a的浓度越低，动脉硬化的进程越靠后期。
实施例10:使用salusin-a作为标志物检测急性冠状动脉综合征、缺血 性心脏病和动脉硬化
从以下病例中收集血清标本由37名稳定性劳力型心绞痛患者 (26名男性病例和11名女性病例)、60名急性冠状动脉综合征患者(发 作后6小时内)(41名男性病例和19名女性病例)以及76名陈旧性心 肌梗塞患者(自急性冠状动脉综合征发作后已经过了 6个月或更长时 间)(61名男性病例和15名女性病例)组成的缺血性心脏病病例(共 计173名病例)；以及由40名原发性高血压患者(28名男性病例和12 名女性病例)和55名健康志愿者G5名男性病例和20名女性病例) 组成的对照病例。根据Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566的描 述通过放射免疫测定法来测定Salusin-a浓度。所有急性冠状动脉综合 征病例均接受急诊冠状动脉成像。基于发现具有动脉硬化病变的冠状 动脉分支(右冠状动脉+左前降支+左回旋支=总计3个分支)的数目 来评价冠状动脉病变的严重性。另外，所有高血压病例和23名健康志 愿者均接受颈动脉超声波心动描记法。具有清晰边界的IMT为1.1 mm 或更大的病变被指定为斑块病变。斑块分数(plaque score)确定为所 有斑块病变(右侧和左侧)的厚度的总和。斑块分数1.1-5指定成对应 于轻度动脉硬化。斑块分数5-10指定成对应于中度动脉硬化，斑块分 数10以上指定成对应于重度动脉硬化。
对于缺血性心脏病患者，血清salusin-a浓度为4.9 ± 0.6 pM。该数值显著低于健康志愿者(21.7士1.5pM)(均值土SEM，下同)和高血压 患者(15.4 ± 1.1 pM) (p< 0.0001)。在缺血性心脏病患者中，劳力型 心绞痛患者的血清salusin-oc浓度是稳定的(6.4±0.9pM)，急性冠状动 脉综合征患者为3.6土0.6pM，陈旧性心肌梗塞患者为5.2± 1.2pM (图 15)。作为60名急性冠状动脉综合征患者的急诊冠状动脉成像的结果， 其中23例发现有单支血管病变，17例发现有两支血管病变，20例发 现有3支血管病变。单支血管病变患者的salusin-ot浓度为5.2 ± 1.0 pM， 两支血管病变患者的salusin-ot浓度为3.1 ± 1.4 pM， 3支血管病变患者 的salusin-a浓度为2.3 ± 0.9 pM。 3支血管病变患者的结果要显著低于 单支血管病变的患者(p<0.05，图16)。
对于40名高血压患者和23名健康志愿者，颈动脉最大IMT和 salusin-a浓度之间呈负相关。另外，斑块分数随着严重性增加而逐渐减 小。因此，认为salusin-a浓度下降参与了动脉硬化的进展。
就上述而言，假设salusin-oc浓度下降反映了动脉硬化、特别是缺 血性心脏病的存在。对于急性冠状动脉综合征，所得到salusin-a的浓 度比任何其他缺血性心脏病病例中得到的浓度更低。另外，发现 salusin-oc的浓度随着冠状动脉病变的严重性增加而进一步下降。这表明 具有抗动脉硬化作用的sahisin-ot可以非常有效地用作指示急性冠状动 脉综合征的发作或严重性的标志物。
实施例11: salusin-a和salusin-p的连续给药对动脉硬化的影响
使用apoE缺陷小鼠作为动脉硬化动物模型，考察salusin-a和 salusin-p的连续给药对动脉硬化的影响。在此，还考察了 salusin-ot或 salusin-P的抗血清作用。除了考察动脉硬化病变以外，研究还集中于对 于动脉硬化原发病灶的形成非常重要的巨噬细胞泡沫化，并且还测定 了氧化LDL引起的胆固醇酯积聚。对于能够识别氧化LDL的清道夫 受体(CD36和SR-A)、细胞内胆固醇酯化酶(酰基-CoA)(胆固醇酰 基转移酶l (ACATl))以及参与过量细胞内游离胆固醇的细胞外转运 (胆固醇外流)的机制的ATP结合盒转运体Al (ABCA1)、 ABCG1 和SR-BI，进行了表达分析。
上述动物实验根据ShowaUniversity (日本)制定的实验实践指南
33进行。该研究用的所有apoE缺陷小鼠均购自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, U.S.A.)。
将13周龄雄性apoE缺陷小鼠(72只小鼠)分成以下6组(i)生 理盐水(对照);(ii) salusin-a (0.6画l/kg/h); (iii) salusin-卩(0.6 nmol/kg/h); (iv) salusin-ot (0.6 nmol/kg/h) +抗salusin-a血清(1.4 吗/kg/h ); ( v ) salusin-P (0.6 nmol/kg/h ) +抗salusin-p血清(1.4 jig/kg/h); 和(vi)抗salusin-(3血清(1.4吗/kg/h)。使用微量渗透泵对小鼠连续皮 下给药4-8周。微量渗透泵和其中所含的溶液每周更换。
对摄取正常饮食的小鼠进行实验。测定以下参数。
1. 主动脉的动脉硬化病变的分析
将每条采集的主动脉沿纵向切开，然后进行油红O染色，用于考 察每个具有脂质色素沉着的动脉粥样硬化病变的表面积。使用Adobe Photoshop (Adobe System Inc., San Jose, CA, U.S.A.)鉴别动脉硬化病 变，然后使用NIH Scion Image (Scion Corp., Frederick, MD, U.S.A.)进 行各处病变的表面积的定量分析。另外，制备主动脉附近(紧接着主 动脉瓣下方)的切片，然后进行油红O染色，用于对动脉硬化病变进 行详细分析。
2. 巨噬细胞的分析
(1) 考察细胞内胆固醇酯积聚 在腹膜内给予巯基乙酸盐后的第4天，收集渗出的巨噬细胞，并
用含10%胎牛血清的RPMI1640溶液培养。向培养溶液中加入氧化LDL (10吗/mL)禾口[3司油酸(0.1 mM)。 13小时后，测定细胞内积聚的胆 固醇[3司油酸的放射活性，以对巨噬细胞的泡沬化进行评价。
(2) 考察胆固醇外流 将以上述方式收集的巨噬细胞在如上制备的含有用[3司胆固醇(74
kBq/mL)标记的氧化LDL (10pg/ml)的培养溶液中保温24小时，并 用PBS洗涤两次。之后，将巨噬细胞在其中已添加有HDL (15 pg/mL) 的含0.1% BSA的RPMI1640溶液中保温16小时。培养溶液以15,000 rpm离心10分钟，以从中去除残渣。细胞用PBS洗涤两次，然后溶解 在lNNaOH (0.3 mL)中。测定培养溶液和细胞提取溶液中的[3司胆 固醇放射活性胆固醇外流率(％)=培养溶液中的[3司胆固醇放射活性/培养溶液中的[3司胆固醇放射活性+细胞提取溶液中的[3司胆固醇 放射活性X 100 (3)考察与泡沫化有关的基因的表达
如(1)中的实验那样收集巨噬细胞，通过蛋白质印迹法分析参与
巨噬细胞泡沬化的基因(即清道夫受体CD36和能够识别氧化LDL的 SR-A、细胞内胆固醇酯化酶ACAT1以及参与胆固醇外流的ABCA1、 ABCG1禾n SR-BI)的蛋白质表达。对于巨噬细胞功能的内标，还考察 了P-肌动蛋白的表达。为了对条带浓度进行定量，使用Analyzer(ATTO Corporation, Tokyo )。
作为上述考察的结果，获得了以下结果。
1. 主动脉的动脉硬化病变
给药后4周，与用生理盐水处理的对照小鼠(图17-1A)相比，在 用salusin-P处理的apoE缺陷小鼠中在从主动脉根至头臂动脉分岔的广 泛区域中观察到用油红O染成红色的主动脉弓的动脉硬化病变(图 17-lC，箭头)。关于对各组(由6只小鼠组成)测定的动脉硬化病变 表面积的平均值，发现salusin-p处理组的平均值已经增加至对照组的 约2.5倍(P < 0.005,图17-2)。在近端主动脉切片中，与对照组(图 17-1F)相比，在salusin-(3处理组中观察到用油红0染成红色的粥样斑 的形成和血管壁的增厚(图17-lH，箭头)。在除salusin-P之外还用抗 salusin-P血清处理的小鼠中，与单用salusin-P处理的小鼠相比，主动脉 的动脉硬化病变(图17-1D)、粥样斑和血管壁的增厚(图17-11)得到 改善。在单用抗salusin-(3血清处理的小鼠中，观察到与对照小鼠类似 的动脉硬化病变(图17-lE和J)。
给药后8周，在用生理盐水处理的对照小鼠中，主动脉弓中的动 脉硬化病变的大小显著增加(图18-lA，箭头)。但是，作为给予salusin-ot 的结果，动脉硬化表面积减小至给予salusin-oc前的一半以下(图18-1B 和18-2)。另夕卜，作为给予salusin-a的结果，观察不到明显的斑块形成 (图18-1B和E)。在抗salusin-a血清的存在下，salusin-a对动脉硬化 病变的抑制效应消失(图18-lC和F和18-2)。
2. 巨噬细胞的分析
给药后4周，在给予salusin-a的情况下，由氧化LDL (细胞内胆固醇酯积聚)引起的腹膜内收集的渗出巨噬细胞的泡沫化减少到对照
的大约l/4的水平(P<0.05，图19A)。在给予salusin-P的情况下，巨 噬细胞的泡沫化增加至对照的约2倍的水平(P〈0.01，图19A)。但是， 在抗salusin-卩血清的存在下，其被抑制到对照的水平(P < 0.01，图 19A)。在salusin-oc的存在下HDL引起的胆固醇外流增加到对照的约2 倍的水平(P<0.01，图19B)。
图20显示了在同一时期参与巨噬细胞泡沬化的基因的蛋白质表达 水平。Salusin-ot不影响能够识别氧化LDL的清道夫受体(CD36， SR-A) 的表达(图20A和B)。但是，salusin-ot将ACAT1的表达减少到初始 水平的大约一半的水平(P < 0.05，图20C)，并将参与胆固醇外流的 ABCA1、 ABCG1和SR-BI的表达增加到初始水平的1.5-2倍的水平(P < 0.05，图20D、 E和F)。同时，salusin-p将CD36、 SR國A和ACAT1 的表达增加到对照水平的大约1.5-2.8倍的水平(P<0.05，图20A、 B 禾口C)。上述salusin-P的作用完全被抗salusin P血清所取消(图20A、 B 和C)。
工业应用性
如实施例中所述，salusin-oc抑制巨噬细胞的泡沫化，从而抑制动脉 硬化病变的形成。因此，salusin-ot可以用作动脉硬化性疾病的预防性治 疗剂。同时，salusin-P促进巨噬细胞的泡沬化，从而促进动脉硬化病变 的形成。因此，动脉硬化性疾病可以通过抑制salusin-P的作用来预防 和治疗。抗salusin-(3抗体抑制salusin-P的作用，因此其可以用作动脉硬 化性疾病的预防性治疗剂。此外，生物样品例如血清、尿等中的 salusin-a浓度与动脉硬化病变的形成有关。因此，生物样品中的 salusin-oc可以用作用于动脉硬化性疾病的检测或风险评价的标志物。
抑制salusin-a或salusin-p的作用的拮抗性化合物可以用于预防/治 疗动脉硬化性疾病。另外，salusin-a可以用作检测动脉硬化性疾病用的 标志物。如上所述，本发明可以应用于医药领域。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此全部全文并入作为 引证。
权利要求
1.一种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-α作为活性成分。
2. —种用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其包括salusin-p的拮抗剂 作为活性成分。
3. 根据权利要求2所述的用于动脉硬化性疾病的治疗剂，其中所 述salusin-p的拮抗剂是抗salusin-p抗体。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的用于动脉硬化性疾病的治 疗剂，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心 脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹 层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
5. —种用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其包括salusin-a，并 包括salusin-p的拮抗剂。
6. 根据权利要求5所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物，其 中所述salusin-(3的拮抗剂是抗salusin-p抗体。
7. 根据权利要求5或6所述的用于动脉硬化性疾病的治疗组合物， 其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病， 即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾 硬化和闭塞性动脉硬化症。
8. —种用于检测动脉硬化性疾病的方法，其包括化验生物样品中 的salusin-ou
9. 根据权利要求8所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中 所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬化 和闭塞性动脉硬化症。
10. 根据权利要求8或9所述的用于检测动脉硬化性疾病的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。
11. 一种用于确定动脉硬化性疾病的严重性的方法，其包括化验生物样品中的salusin-a。
12. 根据权利要求11所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重性的 方法，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心 脏病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹 层、肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
13. 根据权利要求11或12所述的用于确定动脉硬化性疾病的严重 性的方法，其中所述生物样品选自血清、血浆和尿。
14. 一种用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志物，其包括 salusin-ou
15. 根据权利要求14所述的用于检测动脉硬化性疾病的诊断标志 物，其中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏 病，即心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、 肾硬化和闭塞性动脉硬化症。
16. —种用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其包括抗salusin-a抗 体，并使用salusin-a作为检测动脉硬化性疾病的诊断标志物。
17. 根据权利要求16所述的用于检测动脉硬化性疾病的试剂，其 中所述动脉硬化性疾病选自急性冠状动脉综合征、缺血性心脏病，即 心肌梗塞或心绞痛、脑梗塞、脑出血、主动脉瘤、主动脉夹层、肾硬 化和闭塞性动脉硬化症。
全文摘要
本发明提供一种用于动脉硬化性疾病的预防和治疗剂以及用于检测动脉硬化性疾病的方法或试剂。此外，本发明提供包括salusin-α作为活性成分的用于动脉硬化性疾病的治疗剂、包括salusin-β的拮抗剂作为活性成分的用于动脉硬化性疾病的治疗剂、以及用于检测动脉硬化性疾病的方法，上述方法包括化验生物样品中的salusin-α。
文档编号C07K14/47GK101687008SQ20088002302
公开日2010年3月31日 申请日期2008年5月9日 优先权日2007年5月11日
发明者七里真义, 渡部琢也 申请人:株式会社蛋白质表达;学校法人昭和大学;国立大学法人东京医科齿科大学