对水痘带状疱疹病毒具有特异性的抗体的利记博彩app

专利名称：对水痘带状疱疹病毒具有特异性的抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及从噬菌体展示文库分离的具有特异于病毒的生物 学活性的新抗体序列。
背景技术：
噬菌体展示技术利用丝状p藍菌体(如M13)基因组的小尺寸和 适应性，该丝状p藍菌体感染细菌细l包(例如大肠4干菌(￡^c/ en'c/^(3 co/O细胞)以克隆、选择以及遗传改造在它们的表面上表达的多 肽(抗体片段、生物活性肽、酶等)并且可以在它们与靶标(target) 相互作用之后发挥生物学功能。
对于不同的应用，已经开发了用于繁殖噬菌体以及筛选测定的 多种克隆和表达策略、载体、文库、方法，如在i仑文(Bradbury A and Marks J, 2004; Mancini et al., 2004; Conrad U and Scheller J, 2005; Hust M and Dubel S， 2005 )、以及书l务("Phage display: A Practical Approach", vol. 266， ed. Clackson and Lowman H， Oxford Univ. Press, 2004; "Phage Display: A Laboratory Manual", ed. Burton D et al" CSHL Press, 2001 )中综述的。
噬菌体展示文库由重组噬菌体群体构成，其每一个代表蛋白序 列所有组成成分的单个元件。表达特定蛋白的噬菌体可以通过基于 亲和性(亲和力)和/或功能的迭代选择过程("淘选(panning)") 从文库中分离。例如，该蛋白可以是抗体片段，为可变重链/轻《连杂
4二聚体(或异源二聚体，heterodimers)的形式(通常称为Fab )或 单链可变区片段(scFv)的形式，可以基于它们对纯化抗原的亲和 性或基于生物学测定中的活性进行分离和表征。
尤其是，已经开发了筛选过程以鉴定对病原体和生物学把标具 有高亲和性和特异性的抗体片段，有时具有与这样的结合性能有关
的相关生物学活性。事实上，整个治疗方式(称为被动免疫疗法或
的抗原-结合特性上建立(Dunman P and Nesin M, 2003; Keller M and Stiehm E, 2000 )。 一皮动免疫疗法包括^合予个体药物组合物，其中该 药物组合物包括对病原性抗原(例如，毒素、人类蛋白、病毒或寄 生虫)具有指定结合特异性的治疗性抗体。
被动免疫疗法已经引入到临床实践，迅速扩展了用于治疗各种 疾病(包括感染性疾病、免疫介导疾病和癌症)的4几会。这种方式 在免疫系统不能以阻断和/或消除靶向分子所需的量和/或特异性产 生它们的患者中可以是特别有岁文的(Chatenoud L， 2005; Laffly E and Sodoyer R， 2005 )。
在可以利用治疗性抗体輩巴向的病原性抗原中，感染人类细月包的 病毒是特別重要的。这样的抗体的给予可以抑制病毒在患者体内增 殖，并且潜在地阻断该种群中病毒感染的暴发。可替换地，该抗体
可以向具有弱免疫系统的患者*会予或多或少延长的时间l殳(例
如，免疫抑制、老年或移一直个体)，其对感染性疾病包4舌那些对免 疫竟争性个体的1^康通常不会有严重和/或永久后果的疾病变4寻更
力口敏感。
水痘带状疱渗病毒(vzv，水痘)是导致免疫缺失个体中这样 的潜在威胁生命的感染的病毒之一。VZV是一种a疱渗病毒，编码 至少70种不同的开方文阅读冲匡(ORF)，它们中的大多lt与疱渗单纯病毒密切相关(Mori I and Nishiyama Y， 2005 )。 VZV在人群中通过 直接接触皮肤病变或呼吸分泌物中的感染性病毒而传播，表明对于 皮肤和T细胞的特异趋向性。初次VZV感染涉及淋巴细胞，随后 是细胞相关病毒血症、器官中的病毒复制、以及由于继发性病毒血 症导致的弥散性皮渗。VZV感染可以通过释放病毒体(或病毒粒子， virions)或通过细胞间传播而扩散，并且在感觉神经节中建立潜i"犬 期(Arvin A， 1996; Quinlivan M and Breuer J, 2006 )。
单个VZV攻击或种痘(或疫苗4妄种，vaccination )通常f武予纟冬 身保护。然而，VZV具有允许该病毒逃避先天和后天(获耳又)免疫 应答的内在性能。VZV再感染或再激活仍然是可能的，也因为VZV 特异性抗体可能丟失，尽管在种痘之后具有可4全测的细月包介导免疫 性(Ludwig B et al" 2006 )。
对感染和种痘的免疫应答的^/^制和效力已经在人类和动物才莫 型(Maple P et al.， 2006; Matsuo K et al" 2003; Kutinova L et al" 2001; Massaer M et al" 1999; Haumont M et al" 1997; Hasnie F et al" 2007 ) 或体夕卜培养系统(Fin腿R et al" 2006; Andrei G et al" 2005a )中进
行了研究。vzv发病机理和免疫生物学可以利用体外人类皮肤或神
经节模型在转基因小鼠模型中进行研究(Baiker A et al., 2004; Ku C et al.， 2005; Taylor S and Moffat J, 2005; Zerboni L et al" 2005 )。以这 种方式，已经鉴定了细胞型特异性VZV细胞凋亡活性(Hood C et al., 2003 )以及VZV感染的细月包/病毒递质(或介质，mediators) (Berarducci B et al., 2006; Chen J et al., 2004; Li Q et al.， 2007; Hambleton S et al.， 2007 )。
一种活的弱化水痘疫苗(Oka/Merck抹)是可利用的，并且推 荐用于常^见儿童免疫和成人中，假定其具有安全性和有效性 (Oxman M et al.， 2006; Arvin A, 1996 )。尽管VZV种痘在发达国家 工业化世界已广泛建立并且在短/中期减少所有形式的水痘(特别是严重疾病)中是高度有效的，种群中的潜伏或进化野生型病毒池表
现出持续的威月办(Hambleton S and Gershon A, 2005 )。
VZV抹与VZV转录本(转录物)中的特定遗传突变(Grose C， 2006)相关并且与三种主要的不同基因型(Norberg P et al.， 2006 ) 相关。遗传变体(或变异体，variants)与在免疫化人类宿主中4全测 的皮渗形成VZV基因型才目关(QuinlivanMet al., 2007 )。 it匕夕卜，VZV 免疫水平在不同人群，例如在欧洲地区人群中变化相当大(Nardone A et al., 2007 )。
带习犬疱渗(herpes zoster或shingles )在临床实践中仍然经常只见 察到，特别是在老年人中由于细胞介导免疫性的年龄相关性减弱， 或者是由于在不同年龄范围内的VZV再激活的危险因子，并且具 有由于癌症、免疫抑制性治疗或甾类激素治疗的伴发免疫缺陷。带 状疱渗的并发症可以是神经病学的(疱渗后神经痛、脑血管炎、脑 炎、无菌性脑"莫炎、颅神经麻痹、或脑膜脑炎)、眼^f牛的(眼部带 状疱瘠(Herpes Zoster Ophthalmicus)、葡萄月莫炎、4见网月莫i不死、浮见一申 经炎、或角膜炎)或内脏的(肝炎、肺炎、心肌炎)。对于带状疱 渗的危险因子变得更好理解，但它们的增加数量和在感觉神经节和
眼表面中的VZV存留意p未着需要在成人中更广泛的种痘以及更有
效的抗VZV治疗(Dworkin R et al" 2007; Weinberg J, 2007; Liesegang T， 2004 )。
VZV感染在免疫抑制患者中是极其危险的，在这样的患者中不 建议使用疫苗。事实上，VZV在移植医院病室中是一个极大的问题， 在该移才直医院病室中处于免疫抑制状态的单个个体中的单个VZV 再激活或再感染可以感染多个患者， -使得VZV可能^f曼入多种组织， 包括脊髓或脑动脉(Chaves Tdo S. et al" 2005; Gilden D， 2004 )。在
妊娠中，VZV感染也可以通过子宫内佶4番或#斤生儿感染而扩展到胎 儿，引起子宫内死亡或先天性水痘综合症，伴随严重皮月夫病变以及月支体和器官发育的在夹陷(Schleiss M, 2003; Sauerbrei A and Wutzler P, 2007 )。
除了种痘(其具有一些重要的禁忌症)(Arvin A, 1996)，抗病 毒治疗是可利用的(如阿昔洛韦(acyclovir)、伐昔洛韦(valaciclovir )、 泛昔洛韦(famciclovir)和溴夫定(brivudin ))。然而，除了抗药性 VZV4朱的问题以外，这些4匕合物也可能具有禁忌症，例3o由于与人 体酶相互作用(Andrei G et al.， 2005b; Abdel-Haq N et al. 2006 )。其 他治疗如皮质甾类或抗惊厥药用于提供另外的疼痛减轻，但它们的 副作用分布(adverse effect profile)限制了应用，特别是对于疱渗 后神经痛(Tyring S, 2007 )。因此，当用于预防的现有手4殳不可用 或不再有岁丈时，需要可替4奐的方式(Hambleton S and Gershon A, 2005 )。鉴于疫苗无效和减弱的疫苗诱导免疫性，现在推荐第二疫 苗剂量(Chaves S et al., 2007 )。
为了早期鉴定VZV感染，已经开发了多种it断试-验用于在类 似患者群体、以及在老年人或暴露于VZV感染危险的免疫缺失个 体中，才企测VZV特异性抗体、抗原或转录本(Hambleton S and Gershon A, 2005; Smith J et al., 2001 )。
VZV特异性免疫活性在关联VZV相关眼部感染(Kezuka， T. 2004 )、血管病变(Burgoon M et al., 2003 )、或流4亍病学研究(Talukder Yetal., 2005)的血清、脑脊液或口月空液中鉴定。已经才是出和i式马全了 VZV暴露后预防，尤其是利用可以给予以防止感染的具有显著抗 VZV效丫介的人类4元体纯4匕制剂(或制备4勿，preparations ) ( Keller M and Stiehm E, 2000 )。已经描述了具有高抗VZV抗体效j介的人类免 疫球蛋白的特异性可静脉内注射的制剂(US4717564; CDC， 2006 )。 它们的应用(单独或与其他化合物组合作为VZV特异性抗病毒剂 (antivirals ))已经在移植患者、孕妇或新生婴儿中进行了试-验 (Huang Y et al" 2001; Carby M et al" 2007; Koren G et al" 2002 )。
8vzv特异性抗原、vzv^f唐蛋白的变体、以及它们的免疫原表
位已经利用不同的抗体制剂如人血清(US6960442; Fowler W et al., 1995; Kjartansdottir A et al.， 1996; WO 96/01900 )、非人多克隆血清 (US5306635; WO 92/06989)进行了描述。针对VZV的单克隆抗 体利用人类(WO 86/02092; WO 91/16448; WO 95/04080; EP148644; Nemeckova S et al., 1996; Fo皿g S et al.， 1985; Sugano T et al.， 1987; Yokoyama T et al., 2001; Ito M et al., 1993 )或鼠类来源(EP321249; Vafai A and Yang W, 1991; Montalvo E and Grose C 1986; Forghani B et al., 1994; Grose C et al., 1983; Lloyd-Evans P and Gilmour J, 2000; Shankar V et al" 2005; Garcia-Valcarcel M et al., 1997 )的三源杂交瘤 或杂交瘤来分离和表达。重组的VZV结合和/或中和性抗体片段已
经在噬菌体展示文库中进行了鉴定并且作为单链可变区片段
(Kausmally L et al" 2004; Drew P et al., 2001 )或Fab( Suzuki K et al., 2007; Williamson R et al.， 1993 )而表达。抗VZV鼠类单克隆抗体已 被人源化(WO 95/31546)。
虽然疫苗和系统性抗病毒剂都已带来重大改进，^f旦是该疾病仍 持续存在。治疗减少但并没有消除可能以不可预测模式显示的许多 VZV并发症。可以更有岁支地4全测和阻断VZV在种群中感染和繁殖 的新抗体和抗体片段的鉴定以及生产，对于建立这种感染性疾病的 治疗和/或预防的改进治疗仍然是特别重要的。

发明内容
本发明提供新抗体序列，其结合并中和vzv，并且可以用于检 测、治疗、抑制、预防和/或减轻vzv感染或vzv相关疾病。
一组人类抗体序列在重组噬菌体上展示并且vzv特异性结合 活性已在嗟菌体文库中检测到。编码两个抗体片段的重链和轻链可
变区并且具有VZV中和性活性的DAN序列一皮鉴定并称为DDF-VZV1和DDF-VZV2。确定了负责VZV特异生物学活性的相 应蛋白序列和互^卜决定区(CDR)。
本发明的序列可以利用用来用于生产重组蛋白的适当技术，用 于生产具有VZV特异结合性和中和性性能的重组蛋白，其为全长 抗体、抗体片段形式，或功能蛋白(尤其是融合蛋白)的任何其他 形式。
在VZV感染和VZV相关疾病的管理中具有治疗、预防和/或 诊断效用的组合物可以利用本发明的蛋白来制备。这样的组合物可 以用来补充或代替基于抗病毒化合物和/或静脉内免疫3求蛋白 (IVIg )制剂的现有VZV治疗。
本发明的另外的实施方式，包4舌分离的DNA禾口蛋白序列、载 体、重组噬菌体和宿主细^^包以及医学方法和用途，在以下描述中才是 供。


图1:对于表达DDF-VZV1 ( VZV陽1 )、 DDF國VZV2 ( VZV國2 ) 的重组噬菌体制剂、或用作阴性对照的不相关人类Fab (e-137)的 VZV结合活性的特异性。该结合活性利用用于纟反涂^隻(或4反包#皮， plate coating)的指定抗原以总蛋白揭:耳又物(对于MRC-5细胞)或 纯化蛋白(对于牛血清白蛋白，BSA)形式在ELISA中测量。
图2: ( A)对于DDF-VZV1的重《连可变区的DNA (小写字母) 和蛋白(大写字母)序列的比对(DDF-VZV1 VH; SEQ ID NO.: 1 和2 )。予贞测的CDR ( HCDR1 、 HCDR2和HCDR3; SEQ ID NO.: 3、 4禾口 5 )力口下划纟戋。(B )只于于DDF画VZV1的丰至4连可变区的DNA (小 写字母)和蛋白(大写字母)序列的比对(DDF-VZV1 VL; SEQ ID
10NO.: 6和7 )。予贞测的CDR ( LCDR1、 LCDR2和LCDR3 )力口下划线。
图3: ( A)只寸于DDF-VZV2的重《连可变区的DNA (小写字母) 和蛋白(大写字母)序列的比对(DDF-VZV2 VH; SEQ ID NO.: 8 和9 )。预测的CDR( HCDR1 、 HCDR2和HCDR3; SEQ ID NO.: 10、 11和12)力口下划线。(B)对于DDF-VZV2的轻4连可变区的DNA (小写字母)和蛋白(大写字母)序列的比对(DDF-VZV2 VL; SEQ ID NO.: 13和14 )。预测的CDR ( LCDR1 、 LCDR2和LCDR3 ) 力p下划线。
图4: VZV感染的MRC-5细J包并用DDF-VZV1 (A)和 DDF-VZV2 (B)染色的免疫荧光。细胞膜用白线指示而核膜用白 色虚线指示。在未感染细胞上利用这些Fab没有获得染色。
图5:，于于DDF-VZV1 ( A )和DDF-VZV2 ( B )的VZV中和 活'1"生，^口在p蓝菌体衣壳蛋白(phage cost proteins )上展示的部分纯 化的人类重组Fab所表达的。噬斑减少的剂量响应分析与相应浓度 的不相关人类Fab (el37)平行实施。百分比值通过比较在没有任 何Fab的情况下利用VZV预孵育获得的凝:据而进行计算。
图6: (A)对于FLAGhis标签的正向连接物(pDD-FLAGhis 正向SEQIDNO:15)利用Spel和Nhel消4匕，并克隆入用于取 cp3申序列的pDD载体中，其中FLAGhis标签带有在其与相应的反 向引物(pDD-FLAGhis反向SEQ ID NO: 16 )商己对之后连续由该 寡核芬酸编码的蛋白标签(FLAGhis标签SEQ ID NO: 17)的指 示(WO 07/007154)。 (B)含有一皮克隆入pDLacI-FLAGhis载体中 的抗体片段的重链(HC)和轻链(LC)的DNA片段的示意图。该 HC序列被克隆入在Pe旧4言号序列(Pe旧)与FLAGhis标签序列 (FLAGhis )之间的框架中。该LC序列一皮克隆入带有PelB信号序列(Pe旧)的框架中并且其表达由LacZ启动子(LacZ )驱动。在 该两个表达单元之间，才示i己基因(Zeocin; Zeo基因)和4空制LacZ 启动子的基因(Lacl基因)利用它们自身的启动子进行克隆。编码 cp8f的序列(cp8*)在缺乏功能启动子和翻译起点的情况下不被转 录和翻译。相关限制^f立点(restricyion sites )，尤其是用于克隆HC (Spel和Xhol )、 LC ( Xbal和Sacl)以及Lacl基因(Stul)的那 些被指示。利用pDLac系统表达DDF-VZV1的相应Nhel-Bgll片,殳 作为SEQ ID NO.: 18 4是供。(C )利用pDLac-VZVl-FLAGhis纯化 表达的DDF-VZVl-FLAGhis的考马,斤(coomassie )染色。该图示 出了从亲和层析柱中洗脱的五个连续流分(部分，fractions )。这些 流分收集到一起，浓缩并储存在-20。C以备将来4吏用。
图7: (A)人类Fab DDF-VZV1的重《连的蛋白序列，如利用 pDLac-VZVl-FLAGhis表达的(DDF-VZV1 CHTag; SEQ ID NO.: 20 )。相应的DNA序列作为SEQ ID NO.: 19才是供。利用pDD载体 初始克隆的该重《连的可变区(SEQIDNO.:2)加下划线。PelB序列 包括在氨基酸1和26之间。氨基酸155-260对应于人类Ig Y-l链C 区的氨基酸1-106 ( SwissProt登录号P01857)。氨基酸262-275对 应于FLAGhis序列。(B )人类Fab DDF-VZV1轻4连的蛋白序列， ^口矛J用pDLac-VZVl-FLAGhis表达的(DDF-VZV1 CL; SEQ ID NO.: 22)。相应的DNA序列作为SEQIDNO.: 19^是供。利用pDD载体 初始克隆的该轻f连的可变区(SEQIDNO.:7)力卩下划线。PelB序列 包括在氨基酸1和22之间。氨基酸129-234对应于Ig k链C区的 氨基酸1-106( SwissProt登录号P01834 )。 ( C )人类Fab DDF-VZV2 重链的蛋白序列，如利用pDLac-VZV2-FLAGhis表达的(DDF-VZV2 CHTag; SEQ ID NO.: 24 )。相应的DNA序列4乍为SEQ ID NO.: 23 提供。利用pDD载体初始克隆的该重《连的可变区(SEQIDNO.:9) 加下划线。Pe旧序列包括在氨基酸1和26之间。氨基酸152-257 只寸应于人类Ig Y-l链C区的氨基酉臾1-106 (SwissProt登录号P01857 )。氨基酸259-272对应于FLAGhis序列。(D)人类Fab DDF國VZV2轻《连的蛋白序列，如利用pDLac画VZV2-FLAGhis表达的 (DDF-VZV2 CL; SEQ ID NO.: 26 )。相应的DNA序列4乍为SEQ ID NO.:25^是供。利用pDD载体初始克隆的该轻链的可变区(SEQ ID NO.: 14 )力口下划线。PelB序列包括在氨基酸1和22之间。氨基酸 135-240对应于Ig k《连C区的氨基酸1-106 ( SwissProt登录号 P01834)。
图8: 3n利用pDLac系统表达和纯4b的人类Fab DDF-VZVI和 DDF-VZV2的VZV中和活性。(A )每种Fab以指定浓度4吏用并且 计算噬斑减少。(B)每种Fab以指定浓度单独使用或以包含等量的 每种Fab的Fab制剂j吏用。噬斑减少的剂量响应分析与利用相同系 统(el37)产生的相应浓度的不相关人类Fab平行实施。百分比数 值通过比较在没有4壬何Fab的情况下(阴性对照)利用VZV预孵 育获得的数据而计算-。
具体实施例方式
在WO 07/007154中描述的pDD噬菌粒和相关方法允i午融合至 两种预定噬菌体衣壳蛋白的一种或另一种的蛋白序列的克隆、表达 和选4奪。这种方式允许选择鉴定可以在重组噬菌体表面上差异表达 或展示的蛋白序列，因此以不同效力从噬菌体展示文库选择。
在本实例中，噬菌体文库通过克隆人类重《连和轻《连免疫3求蛋白 的可变区在pDD噬菌粒中构建。该文库针对VZV蛋白才是取物进行 淘选(或盘选，panned),并且对所选的克隆体随后在基于细胞的测 定中进4亍测试以确定呈现VZV中和活性的那些，如实施例中所示 出的。
13确定编码两种最有希望的克隆体(即DDF-VZV1 和 DDF-VZV2)的DNA序列，然后克隆入用于细菌表达的恰当载体 中。这些Fab的VZV-中和活性已利用用于VZV感染的体外模型， 作为在重组噬菌体(純化自细菌细胞培养物)表面上的两种融合蛋 白或作为亲和性纯化的重组人类Fab进4亍测试。
本发明l是供了能够结合和中和VZV并且包4舌在Fab DDF-VZV1或DDF-VZV2中鉴定的特定CDR (互补决定区)的新 蛋白序列。尤其是，本发明的HCDR3 (重4连可变区的CDR3 )中的 每一个(SEQ ID NO.: 5和SEQ ID NO.: 12 )分别表4i DDF画VZV1 和DDF-VZV2的抗原结合部分。
抗体的HCDR3可以祐 〖人为表征这才羊的抗体的抗原结合部分， 该部分能够结合抗原并因此发挥生物学活性(例如，结合和中和 VZV,如在实施例中示出的)。即使抗体的多个或所有CDR通常是 获得完整抗原结合表面所必要的，但HCDR3是不仅相对于序列而 且相对于长度在抗体之间表现出最高差异的CDR。事实上，HCDR3 序列和长度的差异性(多样性)是用于确定对大多数抗体的特异性 的基础(Xu J and Davies M, 2000; Barrios Y et al. 2004; Bond C et al., 2003 )。
含有本发明的特异性HCDR3 (组合或不组合来自相同Fab的 其他CDR)作为VZV结合部分的蛋白(其中这样的HCDR3已鉴 定)，可以在抗体蛋白框架内产生(KnappikAeta1.,2000)。 CDR的 组合可以在非常短的蛋白中彼此连接，该非常短的蛋白保持原始结 合性能，甚至在与抗体结构不相关的蛋白框架内并且没有破坏原始 结合活性(Ladner R, 2007; Kiss C et al" 2006 )。
在一个实施方式中，本发明提供了一种蛋白，包括与Fab DDF-VZV1的HCDR3具有至少90%同一'f生(或一致性，identity)的序列。连同HCDR1和HCDR2( SEQ ID NO.: 3和SEQ ID NO.: 4; 图2A)，该HCDR3包4舌在DDF-VZVl Fab的重《连可变区中 (DDF-VZVl VH; SEQ ID NO.: 2 )。已经确定了形成该Fab的轻4连 可变区(DDF-VZVl VL: SEQ ID NO.: 7 )，及其特定LCDR (轻4连可 变区的CDR)(图2B)。
在另一个实施方式中，本发明才是供了包括与FabDDF-VZV2的 HCDR3具有至少90%同 一性的序列的蛋白。连同HCDR1和HCDR2 (SEQ ID NO.: 10和SEQ ID NO.: 11;图3A )，该HCDR3包括在 DDF-VZV2的重《连可变区中(DDF國VZV2 VH; SEQ ID NO.: 9 )。已 经确定了形成该Fab的專至t连可变区(DDF-VZVl VL; SEQ ID NO.: 14 )及其特异性LCDR (图3B )。
如果本发明的蛋白是基于DDF-VZVl的序列，则它们应该包 括与SEQ ID NO.: 5具有至少90%同一'1"生的序列。尤其是，它们应 该包括与SEQ ID NO.: 2具有至少90%同一性的序列。更具体地， 这样的蛋白还应该包括选自由SEQ ID NO.: 3和SEQ ID NO.: 4组成 的纟且中的一个或多个序列。
可替换地，如果本发明的蛋白是基于DDF-VZV2的序列，则 它们应该包4舌与SEQ ID NO.: 12具有至少90%同一性的序列。尤其 是，它们应该包4舌与SEQ ID NO.: 9具有至少90%同一性的序列。 更具体;也，这才羊的蛋白还应该包4舌选自由SEQ ID NO.: 10和SEQ ID NO.: 11《且成的组中的一个或多个序列。
本发明的其他实施方式是编码两种Fab的重《连和轻《连可变区的 DNA序列，尤其是那些与对于DDF-VZVl的可变区(对于重4连为 SEQ ID NO.: 1;对于轻4连的为SEQ ID NO.: 6 )和DDF-VZV2的可 变区(对于重链的为SEQIDNO.: 8;对于轻链为SEQ ID NO.: 13 ) 已寻皮克隆和确定的原始DNA序列具有至少90%同一性的序列。这些DNA序列(或所选的部分，如由图2和图3易于确定的编码分 离HCDR和LCDR的那些部分)可以转移到其4也载体中，用于在 重纽j元体的已4口形式(侈'B口，全长、亲和't"生成熟的(affinity-matured )、 CDR移植(CDR-grafted)、或片,炎)之一或它们乂于其I武予VZV结 合性和中和性性能的融合蛋白中表达它们。
无i仑什么地方指出同一性水平，该同一性水平应该是在本发明 的相关序列的全长上确定的。
形成DDF-VZV1或DDF-VZV2 (或所选的部分，如分离的 HCDR和LCDR )的重《连和轻《连的可变区可以包4舌在具有特定亚型 的^元体内，尤其在全长人类重纽—抗体内。这种4元体可以包括「 DDF-VZV1或DDF-VZV2的VL和VH序列作为通过两个轻4连和两 个重《连形成的四聚复合体自然构象中的轻链和重《连可变区。当期望 全长人类抗体时，该抗体应该进一步包括选自由人类IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定区组成的组中的重《连恒定区。 例如，IgG亚型(或同种型，isotype)是几乎所有批准治疗用抗体 的抗体形式(LafflyEand Sodoyer R， 2005)。然而，分离自人类IgGl 的抗原结合部分可以转移到人类IgA序列上，并且所4寻的重纽—抗体 保持原始IgGl的活性，如最近利用能够抑制HIV感染的抗体所示 出的(Mantis N et al.， 2007 )。
可^,才灸地，形成DDF-VZV1或DDF-VZV2 (或所选的部分， 如分离的HCDR和LCDR )的重《连和轻链的可变区可以包括在用于 功能抗体片段的任何其他蛋白形式中，如在文献中以不同名称如 Scfv (单链可变区片段)、Fab (可变重链/轻链杂二聚体)、双特异 抗体、多聚肽体(peptabody )、 VHH (重链抗体的可变结构域)、分 离的重链或轻链、双特异性抗体、以及用于非临床/临床应用的其他 改造抗体变体(Jain M et al" 2007; Laffly E and Sodoyer R, 2005 )描 述的。DDF-VZV 1或DDF-VZV2的重组变体利用以标记Fab形式
16的pDD相容性表达载体(称为pDLac-FLAGhis )来生产(图6B是 相关DNA片,殳的示意图；SEQ ID NO.: 18是DNA序列的一个实例， 该DNA序列是针对用于产生DDF-VZV1的这样的片段)。产生包 括DDF-VZV1和DDF-VZV2标i己形式的基于pDLac-FLAGhis的载 体并用于生产DDF-VZV 1 HCtag以及DDF-VZV 1 LC( SEQ ID NO.: 19-22;图7A禾口 B )，或DDF-VZV2 HCtag以及DDF-VZV2 LC( SEQ ID NO.: 23-26;图7C和D )。
另外的抗体和抗体片萃殳可以通过用于改组轻链的方法，利用 DDF-VZV 1或DDF-VZV2的序列来产生。事实上，多种不同4元体 可以产生并利用单个重4连可变结构i或VH^f特定生物学活性进4亍测 试(如DDF-VZV 1或DDF-VZV2之一 )，该单个重f连可变结构i或 VH例如利用共同噬菌体展示(common phage display)才支术或在 WO 07/007154中描述的那些^支术与VL序列的文库进4亍组合。这种 方式可以允许依据亲和性、稳定性、特异性、和/或重组生产来确定 具有改进性能的VH/VL组合(Ohlin M et al., 1996; Rojas G et al., 2004; S腿ki K et al., 2007 )。
此夕卜，已知的是，抗体可以在特定位置加以修饰以便4吏抗体具 有改进的特性，尤其是用于临床应用(如更好的药代动力学分布或 对抗原更高的亲和性)。这些改变可以在DDF-VZV1或DDF-VZV2 的CDR和/或框架中形成。序列可以通过采用用于合理设计抗体的 <壬<可专门4支术力o以确定，其中利用亲和性成熟(affinity maturation ) 和其他方法(Kim S et al.， 2005; Jain M et al., 2007 )。
用于开发新的生物活性肽的基于抗体的策略还表明，合成含有 L-氨基S臾和/或D-氨基酸的CDR来源肽的可行性。这些分子可以在 以更加适当的药理学学分布下保持原始活性的特定活性(Levi M et al.， 2000; Wijkhuisen A et al., 2003 )。因jt匕，本发明的每一个HCDR3 以及与它们高度相似的序列、含有它们的融合蛋白、以及来源于它们的合成月太(例,含有D誦氨基酸或为逆反构象(retro-inverso conformation ))可以进行测试并用作VZV结合蛋白。
本发明的蛋白可以作为结合并中和VZV的4元体、4元体片,殳、 生物活性肽、或融合蛋白提供。这些可替换的蛋白应保持(如果没 有增强)这才羊的性能，如对于DDF-VZV1和DDF-VZV2 Fab确定 的。在融合蛋白的情况下，异源(heterologous)蛋白序列可以位于 VZV特异性部分(例如，特异性HCDR3或抗体片4殳的可变区)的 N-端或C-端位置，不会影响其正确表达和生物学活性。
术语"异源蛋白"是指，蛋白序列不是天然存在于该VZV特 异性部分(例如，抗体片^史)的N-端或C-端位置中。编码这种蛋 白序列的DNA序列通常通过重组DNA寺支术融合，并且包4舌编码至 少5个氨基酸的序列。目前通常选择这种异源序列用于对该VZV 特异性融合蛋白提供附加性能。这样的附加性能的实例包括对于该 融合蛋白的检测或纯化、另外的结合部分或生物学配体、或翻译后 修饰的更好手段(例如，磷酸化、糖基化、泛素化(或遍在蛋白化， ubiquitination )、 SUMO 4匕(或苏素4匕，SUMOylation )、或内蛋白 酵切割(endoproteolytic cleavage ))。
可替换地(或除了融合至一个或多个异源蛋白序列之外地)， 本发明的蛋白的活性可以利用轭合至不同化合物如治疗剂、稳定剂 或诊断剂来改进。这些药剂的实例是可以利用化学连4妄物或聚合物 结合的可检测标记(例如，放射性同位素、荧光化合物、毒素、金 属原子、胶体金属、化学发光化合物、生物发光化合物、或酶)。
本发明蛋白的vzv-特异生物学活性可以通过与化合物融合而改 进，如在诊断或治疗应用中改变代谢和/或稳定性的聚合物。治疗活 性可以通过与另 一治疗性蛋白融合而改进，如另 一抗病毒蛋白或改 变细胞代谢和/或活性的蛋白。用于选择和"i殳计蛋白部分、配体和适当连接物的手,殳(means )， 以及用于构建、纯化、4企测和^吏用融合蛋白的方法和策略在文献 (Nilsson et al., 1997; "Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO01/77137 )中提供，并且在临床和研究实验室中通常是可利用 的。例如，融合蛋白可以含有由商购抗体(包括标签如聚组氨酸、 FLAG、 c-Myc、或HA标签)识别的序列，其可以有利于该融合蛋 白的体内和/或体外鉴定、或其纯化。其他蛋白序列可以通过直4妄荧 光分析(如在绿色荧光蛋白的情况下)、或通过特定底物或酶(例 如利用蛋白水解位点)易于鉴定。
VZV特异性抗体、抗体片段和融合蛋白的稳定性可以利用与熟 ^口的载体蛋白如p藍菌体衣壳蛋白(cp3或cp8，分离或包4舌在重红L嗟 菌体中)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、胎牛血清白蛋白(BSA)、或 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合而改进。
本发明的蛋白也可以用于表4正在VZV外壳(envelope )上的中 和性抗原。事实上，DDF-VZV1和DDF-VZV2已净皮初始克隆，这 是因为它们在ELISA中与来源于VZV感染细胞系的细月包^是耳又物的 特异性结合(图1)，并且它们中和VZV感染的能力也利用VZV参 照(或对照，reference) 4朱通过体外中和测定来确定(图5和图8 )。 因此，本发明的蛋白可以用来定义与DDF-VZV1或DDF-VZV2竟 争的其他VZV结合性蛋白(例如为全长抗体、Fab和其他抗体片段、 生物活性肽、或融合蛋白形式)。这才羊的竟争性蛋白可以简单地含 有上文限定的任何HCDR3序列，可选地连同部分或完全不同于在 原始DDF-VZV1或DDF-VZV2序列中鉴定的那些HCDR和LCDR。
这样的竟争性蛋白(如对于本发明的抗体、抗体片段、生物活 性肽、或融合蛋白)可以通过展示它们与本发明的蛋白竟争的能力、 然后它们中和VZV感染的能力而进行选择和分离，如通过4壬何相关测定确定的，如在实施例或文献中描述的。本发明的背景4支术提 供了关于用于确定类似活性的不同方式的多篇参考文献。尤其是，
本发明的抗体、抗体片段、以及其他蛋白可以在用于表征vzv特
异生物学活性和只于于4元体片^殳(Kausmally L et al., 2004; Drew P et al., 2001; Suzuki K et al., 2007 )、鼠类或人类单克隆抗体(Grose C et al.， 1983; Montalvo E and Grose C, 1986; Sugano T et al" 1987; Forghani B et al" 1994; Lloyd-Evans P and Gilmour J, 2000 )、以及非 人/人类血清(Fowler W et al" 1995; Haumont M et al" 1997; Garcia-Valcarcel M et al., 1997 )的表^f立的测定中进4亍测试。
免疫荧光研究(图4 )表明，DDF-VZV1和DDF-VZV2识别不 同的VZV抗原，如过去对其他抗体和抗体片4殳所进^f亍的一样 (S画ki K et al.， 2007; Wu L and Forghani B, 1997; Grose C et al" 1983 )。文献提供了多个技术实例，利用它们可以确定VZV抗原和 由每一个Fab识别的特定表位并与过去确定的那些进4亍比4交。例如， 利用VZV蛋白和相关截短变体或合成肽的ELISA、免疫沉淀或蛋 白质印迹已用来确定相关表4立(Krah D， 1996, Sauerbrei A禾口 Wutzler P， 2006 )。尤其是，这样的表位已在糖蛋白E或糖蛋白B ( Fowler W et al., 1995; Haumont M et al" 1997; Garcia-Valcarcel M et al" 1997; Kjartansdottir Aet al., 1996 )以及并唐蛋白L:沣唐蛋白H复合体(Forghani B et al" 1994; Yokoyama T et al.， 2001 ; S腿ki K et al" 2007 )中被鉴 定。
因此，对于本发明蛋白的VZV相关预防、诊断和治疗用途的
更广泛表征和确认可以利用在文献中纟皮露的用于研究vzv发病机 理和免疫生物学的体外或体内测定(组织基或细胞基测定，在啮齿 动物中建立的疾病才莫式)中的一种或多种来实施，如在本发明的背
景4支术中斗既述的(Forghani B et al.， 1994; Vafai A et al.， 1991; Wu and Forghani, 1997; Fowler W et al" 1995; Maple P et al" 2006; Matsuo K et al., 2003; Kutinova L et al" 2001 ; Massaer M et al" 1999; Haumont
20M et al.， 1997; Grose C, 2006; Baiker 2004; Ku C et al., 2005; Taylor S and Moffat J., 2005; Zerboni L et al" 2005 )。
本发明的其他目的是编码上述抗体、抗体片,殳、融合蛋白或分 离CDR中任一种的核酸。实施例提供了这样的序列，尤其是编码 DDF-VZVl或DDF-VZV2重《连和轻《连的全长可变区(SEQ ID NO.: 1、 6、 8禾口13)。该才亥酉史应该与SEQIDNO.: 1、 SEQ ID NO.: 6、 SEQ ID NO.: 8和/或SEQ ID NO.: 13具有至少90%的同 一'性。这才羊的序 列，尤其是在它们中与特定CDR相关的那些(参见图2和图3)可 以包括在载体和DNA表达盒(或表达框,expression cassette )中， 例如,皮可才喿作地连4妄于表达载体中的启动子或克隆入基于pDD的 噬菌粒，以及在任何其他噬菌粒中。因此，包括表达本发明蛋白的 噬菌粒载体的重组噬菌体(如实施例中所示)可以用作用于纟企测和 /或中和VZV感染的手^:。
当期望全长人类抗体时，表达载体应进一步包括选自由IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定区组成的组中的重链恒 定区。编码感兴趣的重链和轻链的相关可变区的核酸序列应该被适 当地克隆入一个载体或不同载体的表达盒中，在这里它们被可操作 地连接至适当的调节序列(例如，启动子、转录终止子)。表达盒 应包括启动子、核4唐体结合位点(如果需要)、起始/终止密码子、 以及前导/分泌序列，其可以驱动单或双顺反子转录本对期望蛋白的 表达。
上文限定为能够结合和中和VZV的本发明的抗体、抗体片段、 HCDR、融合蛋白以及任何其他化合物可以利用用于转化适当的宿 主细胞的这样的载体以及允许将它们作为重组蛋白表达的良好建 立的技术来生产。这些制剂应提供足够量的重组蛋白(从微克到毫 克范围)以进行更广泛的表征和确i人用于VZV相关预防、-珍断和 治疗用途。基于pDD的噬菌粒(其中本发明的序列已借助相应的重组噬 菌体被克隆和表征)包含可转移(部分或全部)到载体中的DNA 序列，在这里原始Fab、或来源于它们的蛋白序列可以在宿主细胞 中作为重组蛋白净皮适当表达(如在利用pDLac-FLAGhis系统的实施 例中示出的)。这些载体应允许该重组蛋白在转录起始/终止调节序 列(其一皮选择为组成型活性或诱导型)的控制下在原核或真核宿主 细月包中表达。
包括本发明的核酸的宿主细月包可以是原核或真核宿主细J包，并 且应允i午分泌期望的重组蛋白。基本上富集这样的细月包的细月包系然 后可以被分离以提供稳定的细胞系。用于生产这样的蛋白的方法包
载体转化的宿主细月包，以及/人该宿主细月包i咅养物中回收蛋白。
这些核酸、重组噬菌体和宿主细月包可以通过采用普通重《且DNA :技术用于生产本发明的蛋白。简而言之，期望的DNA序列可以利 用限制酶消化噬菌粒进行才是取，或者使用原始噬菌粒作为用于聚合 酶链反应(PCR)的模板以及用于特异性地扩增重链和轻链的全长 可变区或仅仅它们的部分(如HCDR3 )的PCR引物进行扩增。
这样的DNA片段然后可以转移到更适当的载体中，用于在原 核或真冲亥宿主细月包中的进一步》务饰和/或表达，如在i午多书籍以及关 于如何克隆和生产重组蛋白的评论中描述的，包括由牛津大学出版 社出版的A Practical Approach"系列中的某些主题"("DNA Cloning 2: Expression Systems" ， 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems" ,1996; "Protein Expression" ,1999; "Protein Purification Techniques" , 2001 )。
乂于于真核宿主(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细月包)，可以采 用不同的转录和翻译调节序列，这耳又决于宿主的特性。它们可以来源于病毒源，如&泉病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调节信
号与具有高表达水平的特定基因有关。实例是疱渗病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择转录起始(transcriptional initiation)调节^f言号，其允i午瞬时(或纟且成型)
抑制和激活，并因此用于调节基因表达。在进一步克隆步-骤期间，编码抗体或融合蛋白的序列可以修改并再克隆入其他载体中，用于
在DNA水平的特定》务饰， <又在DNA和蛋白水平可以例如利用用于选择DNA序列的软件来确定，其中密码子使用和限制位点对利用净争定载体和宿主细月包来克隆和表达重《且蛋白是最适当的(Rodi D etal" 2002; Grote Aet al.， 2005; Carton J et al., 2007 )。蛋白序歹'J也可以与期望的抗体形式(Scfv、 Fab、全长人类抗体等)关联，或与一个或多个内在氨基酸的插入、耳又^或消除相关地添加。
这些4支术也可以用于抗体治疗性能的进一步结构和功能表征和优化(Kim S et al., 2005 )，或用于产生允许它们稳定的体内递送的载体(Fang J et al., 2005 )。例如，重组4元体也可以通过选4奪待融合至可变区的4争定Fc区(Furebring C et al., 2002; Logtenberg T,2007)、通过产生重组单《连抗体片,殳(Gilliland Let al., 1996)、通过融合稳定化肽序列(WO 01/49713 )、或者通过将ii射性化学品或聚合物加入到化学ff^饰的残基中(Chapman A et al., 1999 )而在结构和/或活性水平上进行修饰。
编码展示和所选蛋白序列的DNA序列， 一旦4翁入到合适游离基因(episomal)或非同源性或同源性整合载体中，就可以通过任何合适手段(转化、转染、轭合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直4妄樣史注射等)而引入到适当的宿主细胞中以转化它们。当选择特定质粒或病毒载体时要考虑的重要因素包括包含该载体的宿主细月包可以祐j只别并乂人不包含该载体的那些细月包中选择出来的便利性；在特定宿主中期望的载体拷贝的数量；以及是否期望"穿梭(shuttle )"不同物种的宿主细月包之间的载体。
已经通过引入的DNA稳定转化的细胞也通过引入一个或多个允i午选才奪包含表达载体的宿主细月包的标i己物而加以选4奪。标i己物也可以为营养缺陷型宿主(auxotropic host)才是供光营养、杀菌剂抗性，例如抗生素，或重金属如铜等，并且如果需要其可以是可切割的或抑制的。可选的标记基因可以直接连接至待表达的DNA基因序列，或通过共转染引入到相同细胞中。另外的转录调节性元件也可以是最佳表达所需的。
宿主细月包可以是原核或真核的。在原核宿主细月包之中，4尤选的是枯草軒菌(及^/Z^7&)和大肠杆菌(五.co//)。在真核宿主细胞之中，优选的是酵母、昆虫细胞(使用基于杆状病毒的表达系统)、或哺乳动物细胞如人类、猴、小鼠、昆虫(使用基于杆状病毒的表
达系统)和中华仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary， CHO )纟田月包，因为它们对蛋白分子4是供翻译后^务饰，包4舌正确4斤叠或在正确部位的某些形式的糖基化。酵母细胞也可以实现翻译后肽》务饰，包括糖基化。存在大量重组DNA策略，其利用强启动子序列和高拷贝数的质粒(其可以用于在酵母中生产期望的蛋白)。酵母识别克隆哺乳动物基因产品中的前导序列并分泌带有前导序列的肽(即，前肽)。
可利用作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并且包4舌许多可乂人美国典型培养物保藏中心(美国才莫式菌种收集中心，American Type Culture Collection ) ( ATCC )获4寻的7么生化细胞系，包括但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞(Hela)、幼仓鼠肾(BHK)纟田月包、猴肾细胞(COS)、 C127、 3T3、BHK、 HEK 293 、 Per.C6、黑色素瘤细月包和人肝细月包癌(例如Hep G2 )细胞和大量其他细胞系。在杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材冲牛是以试剂盒形式可商购获得的(例如，由
Invitrogen销售的)。
对于重组多肽的长期、高产率生产，优选稳定表达。例如，稳定表达感兴趣多肽的细胞系可以利用表达载体进行转化，该表达载体可以包含复制和/或内源性表达元件的病毒起点以及在相同或单独载体上的可选择标记基因。在引入载体之后，允许细胞在它们转换至选4^性培养基之前在富集培养基(enriched media)中生长l-2天。可选4奪标记物的目的是对选择赋予抗性，并且其存在允许成功表达所^ 1入序列的细月包生长和回收。稳、定转化的细月包的抗性克隆可以利用适于该细胞型的组织培养^支术增殖。基本上富集这才羊的细胞的细胞系然后可以分离以才是供稳定的细胞系。宿主细月包可以基于重组蛋白的表达水平进一步选择。
在利用噬菌体展示技术分离的免疫球蛋白可变链(尤其是人类免疫球蛋白可变链)的情况下，重要的修饰是所选Fab或scFV转化成具有优选亚型和恒定区的全长免疫王求蛋白。这种》务饰允i午例如产生由噬菌体展示文库来源的单链Fv或Fab构建的所有亚型的全长人类单克隆抗体，并在哺乳动物或昆虫细胞中表达。如在文献中广;乏4笛述的(Persic L et al.， 1997; Guttieri M et al" 2003 )，载体斗争另'J设计用于表达抗体，允许该序列融合至期望亚型(例如人类IgG )的恒定(Fc)区。抗体或融合蛋白可以在原核有才几体(例i口大肠才干菌；Sorensen H and Mortensen K, 2005; Venturi M et al., 2002 )、植物(MaJetal.，2005)、或真核细月包中作为重组蛋白表达，其允i午作为瞬时或稳、定转化细月包的高水平表达(Dinnis D and James D， 2005 )。这在抗体的表征必须利用更多要求和/或体内测定来实施时尤其是需要的。
形式的蛋白提供了不同策略，如在论文和书籍章段中综述的("Phage display: A Practical Approach" , vol.266, ed. Clackson andLowman H, Oxford Univ. Press, 2004; "Phage Display: A LaboratoryManual" ， ed. Burton D et al., CSHL Press, 2001; Corisdeo S and WangB, 2004; Benharl, 2001 )。
中表达时，不同载体和表达系统已设计用于生产转染细胞系的稳定池(Aldrich T et al., 2003; Bianchi A and McGrew J, 2003 )。重组抗体的高 K平、伊"匕的3急定表达已纟至实王见(Schlatter S et al., 2005 )，也由于细胞培养条件的优化(Grunberg J et al" 2003; Yoon S et al.,2004 )并通过选纟奪或改造具有更高水平纟元体生产和分泌的克隆体(Bohm E et al.， 2004; Butler M, 2005 )而实现。
上述限定为能够结合和中和VZV的4元体、4元体片l殳、生物活
性肽、融合蛋白、以及任何其他蛋白可以利用良好建立的技术进行纯化，这些技术允许从细胞培养物或从合成制剂中分离非重组/重组蛋白，即涉及才是取、沉淀、层一斤、电泳等的任何传统程序。用于抗
体纯化的方法可以利用容纳在柱中的固定化凝胶基质(NisnevitchM and Firer M, 2001; Huse K et al" 2002; Horenstein A et al" 2003 ),并且尤其是在用于底物如蛋白A、蛋白G或合成底物的抗体的一般亲和力上(Verdoliva A et al" 2002; Roque A et al" 2004 ),以及通过基于4元原或表4立的亲禾口层才斤(Murray A et al., 2002; Jensen L et al.，2004)。在清洗之后，蛋白通过pH或离子强度的变化而从凝胶洗脱。可4#纟灸;也，可以4吏用HPLC (高效液相色i普)。该洗脱可以利用通常用于蛋白纯化的水-乙腈基溶剂来实施。
上述限定为能够结合和中和VZV的抗体、抗体片,殳、生物活性肽、融合蛋白以及任何其他化合物可以用来检测、治疗、抑制、预防和/或减轻VZV感染。为此，这样的化合物可以用来制备诊断、治疗或预防组合物用于VZV感染和VZV相关疾病的医学管理。这些组合物可以包4舌上述基于人类DDF-VZV1和DDF-VZV2 的序列和活性的抗体、抗体片,殳、融合蛋白、CDR、以及4壬4可其他 化合物。这些组合物可以进一步包括不同的VZV中和性抗体或抗 体片段、静脉内免疫球蛋白(IVIg)制剂、类固醇、和/或抗病毒化 合物。不同的VZV中和性抗体或抗体片段应通过不同表位表征， 如已在文献中描述的那些。事实上，该文献示出了i午多实施例，其 中当针对病毒或人类耙标的两种或更多种抗体在药物组合物中组 合时，所得的组合物可以具有改进的治疗效力，这不是因为简单的 加和步文应(加性#文应)而是因为特定的协同效应(Logtenberg T, 2007 )。
药物组合物可以可选地包括任何药用赋形剂(vehicle )或载体。 这些组合物可以进一步包括(或者可以一起给予)任何另外的治疗 剂或预防剂，如疫苗、免疫调节l争月永内免疫球蛋白制剂、类固醇、 或抗病毒化合物。文献提供了作用于VZV复制的这样的化合物的 一些实例，并且已在人类中单独或联合静脉内免疫球蛋白制剂进行 了试验(Huang Y et al., 2001; Ca勿M et al" 2007; Koren G et al" 2002)。此外，最近的文献才是出，人类单克隆抗体可以用来补充(如 果可能并代替)现有治疗如静脉内免疫球蛋白制剂、类固醇、和/ 或抗病毒化合物，提供了降低这样的药物组合物的频率和/或剂量的 机会(Bayry J et al., 2007 )。
包括上述任一种蛋白(例如，抗体、抗体片,史、融合蛋白、生 物活性肽)和^f壬一种核酸的组合物可以以VZV相关i貪断、治疗或 预防目的而给予个体。这些组合物可以纟会予，作为用于VZV特异 性一皮动免疫的手段，其^是供通过靶向VZV病毒体可以抑制该病毒 在所治疗患者体内传播，并潜在地阻断病毒感染在该种群中爆发的 治疗性化合物(尤其是治疗性抗体或治疗性抗体片段)。取决于特定用途，该《且合物应向人类受治疗者(是一皮vzv感
染或由于住院、免疫4中制性或化疗治疗或^妻触患vzv感染个体而 被认为处于vzv危险的婴儿、孕妇、老年个体或任何其他个体) 4是供该化合物达一个4交长或4交短的时间l殳。为此，该组合物可以以 单个或多个剂量和/或利用适当的装置给予，其中通过不同途径肌 内、静脉内、皮下、局部、粘膜、通过雾化器、吸入器或作为滴眼 液，在非生物/生物可降解基质才才#牛中，或利用特定药物递送系统如 微珠。
尤其是，该组合物可以允i午局部和眼部给予，其表示々I定在皮 月夫和眼中存在VZV的有用方式(Arvin A， 1996; Quinlivan M and Breuer J, 2006; Iiesegang 丁， 2004 )。 jt匕夕卜，^元体禾口^元体片l爻在局吾戸施 加到角月莫时可以是有-文的(Brereton H et al., 2005; Nwanegbo E et al., 2007 )。
药物组合物应向受治疗者^是供治疗或预防有岁文量的化合物，其 允许该化合物在足够时间段中发挥其活性，尤其是用于局部给予， 假定在与继发性病毒血症相关的皮渗中存在病毒。期望的效果是通
过控制vzv感染、再激活和/或再感染，以及通过减少vzv感染的 至少一些临床表现而改善患者的状态。例如，该组合物应该以约
0.005至约50 mg/kg/体重的有效量给予，这取决于给予途径、给予 剂量次凄t、以及个体状态。
在具有i貪断用途的组合物的情况下，该化合物应利用通常在用 于才企测生物学样品中的病毒的临床和研究实验中建立的^支术(例 如，ELISA或其他血清学测定)进行才企测，或者当体内给予受治疗 者时，在全合予后至少1、 2、 5、 10、 24或更多个小时4企测。VZV的 检测可以利用本发明的蛋白来实施，代替或结合已建立用于监控处 于免疫竟争性和免疫缺失性宿主的危险人群中的慢性或急性VZV 感染的已知手,殳和禾呈序。本发明的蛋白还可以用于制备用于检测、治疗、抑制、预防和
/或减轻vzv感染、以及vzv相关疾病的组合物。这些疾病可能由
VZV感染的并发症导致(Dworkin R et al.， 2007; ^Weinberg J, 2007 )。
如在背景技术中指出的，存在大量带状疱渗的带状疱療并发 症，其具有神经、目艮部或内脏作用，可以具有显著和减弱作用，如 在疱渗后一申经痛的'l"青形中一冲羊(Oxman M et al., 2006; Liesegang T, 2004 )。此夕卜，VZV和相关并发症的再激活也已经在癌症患者 (Sandherr M et al., 2006 )或受炎症结締《且织疾病影响的患者，以 及通常在免疫抑制性治疗如皮质类固醇或化疗和其他基于抗体免 疫抑制性方案的患者中发现。
用于治疗、予贞防或i貪断vzv或vzv相关疾病的方法可以包括
给予如上限定的蛋白或核酸。该方法可以进 一 步包括给予不同的
VZV中和性抗体或抗体片,殳、静脉内免疫5求蛋白(IVIg)制剂、类
固醇和/或4元病毒4匕合物。
临床开发和应用应基于抗体药代动力学和药效学的表征(Lobo E et al., 2004 )、临床前和临床安全性凄t才居(Tabrizi M and Riskos L, 2007 )、以及符合对于治疗性重组抗体的商业生产规模配制和分析 表4正的官方要求(Harris R et al., 2004 )。
现在，将借助于以下实施例对本发明进行描述，这些实施例不 应解释为以4壬何方式限制本发明。
实施例
实施例1: ELISA中结合VZV蛋白换_取物的人类Fab的表达 和选捧才才泮+和方法
#4居文献(Burioni et al., 1998; "Phage Display: A laboratory Manual" , Burton DR et al., CSHL Press, 2001 )，编码人类IgGl的重 链和轻链的cDNA获自淋巴细胞，该淋巴细胞获自VZV-血清阳性 个体。才艮据PCT专利申请WO07/007154中描述的4支术，噬菌体文 库利用与pDD载体相容的克隆盒(或框，cassette)来构建，并且 Fab在文库中的重组噬菌体表面上表达。
通过基于pDD的Fab文库的淘选(或盘选，panning ) ,口阳寸生 克隆的测序进4亍人类Fab的选4奪，如文献(Burioni R et al. 1998 )
中所描述的。
特异性Fab的CDR通过比4交预测和通过IMGT/V-QUEST (Giudicelli V et al., 2004 ) 4是供的序列比对以及含有人类抗体的蛋 白序列的其他数据库(如由欧洲生物信息研究所提供且利用FASTA (http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html)可4叟索的那些)来P艮定。
来《^#的入类#恥敏的蛋冷提承#的*备
细胞系MRC-5 ( ATCC登录号CCL-171 )，其是通常用于VZV 分离和增殖的人类胚胎肺成纤维细胞细胞系，被用于制备用来淘选
噬菌体展示文库和在ELISA中测试Fab的VZV特异性材并牛。MRC-5 细胞保持在含有失活的10%胎牛血清(FBS)、 50 (ig/ml的青霉素、 100 pg/ml《连霉素(streptomycine )和2mM L-谷氨酰胺的？文进的^f尹 戈尔(Eagle) i咅养基中。这些细月包(VZV感染或未感染的MRC-5) 一皮刮耳又并再悬浮在 250 ml的溶解纟爰冲液(50 mM Tris-HCl pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.02% 叠氮化钠；0.5% Triton-X)中，在冰上聘育20分钟，然后在4。C 下以12000 rpm离心2分钟。所得上清液的蛋白浓度利用BCATM 蛋白测定试剂盒(Pierce) —式两份地确定。未知样品的蛋白浓度 参照在已知浓度的牛血清白蛋白(BSA)的连续,希释(0mg/ml二空 白-2.000 mg/m卜最大值)加以确定和报告。所有样品的吸光度利用 设置为540 nm的分光光度计进行测量。
^/^蛋^提承^^力萄逸fp五丄75^
蛋白涂4隻利用以下抗原在96孑L板上实施用VZV感染的 MRC-5人类成纤维细胞的细胞溶解产物(ELLEN抹；ATCC;登录 号VR-586 );流感病毒抗原的商购制剂(Virion Ltd.);未感染MRC-5 的细月包溶解产物；牛血清白蛋白(BSA)。每一个才羊品在碳J菱盐IC 沖液中稀释(每孔为25 jil终体积中100纳克的总蛋白)并且该板 在4。C下孵育过^复。在用蒸4留水洗f条之后，该寺反在37。C下通过在 具有P/。BSA的PBS中孵育1小时而去于闭。
z使用在文献中4皮露的方案，利用40 jil含有以下Fab的未稀释 样品来实施ELISA: DDF-VZV1、 DDF-VZV2和e137、制备的不相 关Fab ( Bugli F et al., 2001 )。该Fab在一式两份孔中测试。在37°C 下利用每种Fab孵育1小时并利用具有0.1%吐温-20 (Tween-20) 的PBS清洗5次之后，加入40 pi羊抗-人Fab、过氧化酶-辄合物 (Sigma; Cat no. A0293 )并在37°C下孵育1小时。3口上重复4反清洗 并通过向每个孑L中力口入40 pi的底物(TMB底物i式剂盒；Pierce) 而进行酶促反应。ELISA反应在37。C下进行15分钟。通过加入终 止溶液(H2S04)来终止酶活性并且利用设置在450nm的分光光度 计来测量吸光度。^ f ￡丄/&4 #。哞和^y定的FW斜W
方案与在利用pDD或其他噬菌粒如pGem变体的文献中描述 由々刃卩些类4以("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Burioni R et al., 1998; Burioni R et al.， 2001 ; WO07/007154 )。
简而言之，文库的单个大肠4干菌(Eco/O克隆在具有抗生素 并^卜充了 IPTG的200 ml超级肉汤(super broth ) ( SB; 3.5%月夷酵解 胨(细菌用胰蛋白胨)，2%酵母提取物，0.5。/。NaCl)培养基中生长， 收获并用磷酸盐緩沖盐水(PBS)清洗。细胞溶解限于通过利用受 控月永冲在4。C下声波降解的周质空间。周质揭:耳又物中的Fab通过在 4。C下在JA-10转子中通过以12000 rpm超离心45分4中而部分纯化。 产物利用Centricon过滤器(Centricon filters )过滤并;农缩10次。
部分纯4匕的Fab的;农度通过利用免疫纯(ImmunoPure)羊抗-人IgG [F(ab,)2](其纟吉合至'』96孑L才反(Costar; Cat no. 3690 ) 6勺表面 上)(Pierce; Cat. No. 31132)的夹心ELISA在周质l是取物中确定。 在37。C下孵育1小时后，该4反用去离子水清洗6次并利用具有3% BSA的170 jal/孑LPBS封闭。在37°C下再孵育1小时后，向每个孔 加入在具有1% BSA的PBS中的50 fil每个Fab的连续3倍稀释液、 或已知浓度的对照人类Fab( Cappel; Cat. No. 6001-0100 )，并在37°C 下孵育1小时。然后该^反用TPBS (具有0.05%。土温-20的PBS )清 洗6次。然后抗体结合通过力。入50 pl的石咸性石粦酸酶專厄合的羊抗-人 抗体(Pierce; Cat. No. 31312)来确定，并在37。C下孵育1小时。 利用TPBS如上重复才反清洗，并且向每个孑L中加入100 (al对；肖基苯 基磷酸二钠(Sigma )。 ELISA反应进行60分钟并且将结果与对照 人类Fab对比i会制成图。
结果重组噬菌体的文库才艮据pDD #支术(WO07/007154)来产生并 在从用VZV临床分离物感染的人类成纤维细胞的细胞系获得的蛋 白提取物上进行淘选。还与利用来自没有感染VZV的相同细胞系 的对照蛋白拔:耳又物的相同文库平行地实施5 4仑淘选。
通过第三轮，针对对照蛋白提取物淘选的样品的噬菌体效价低 于104,同时针对VZV提取物淘选的样品的噬菌体效价在第三轮高 于104,在第五l仑达到105。该值表明在它们结合VZV抗原的表面 Fab上表达的重组噬菌体中的文库的进步性富集。
在第五4仑淘选之后获得的多于260个克隆在ELISA中单个测 试，并且它们中的86个被确认为阳性。所选克隆中HCDR3的PCR 和序列分析鉴定了表征人类Fab (现在称为DDF-VZV1和 DDF-VZV2)的两个重《连。表达DDF-VZV1或DDF-VZV2的重组 噬菌体的反应活性针对VZV特异性蛋白提取物以及针对不相关抗 原(未感染细胞，牛血清白蛋白)进行测试，证实了他们在ELISA 形式中的强结合活性(图1 )。结合的特异性也利用流感病毒抗原(所 选Fab对其不显示任何显著亲和力)力。以证实。
对于DDF-VZV1和DDF-VZV2，确定了这些Fab的全长重《连 和轻《连可变区的DNA序列，以及相应的CDR (图2和图3 )。利用 用于蛋白表达的基于大肠杆菌(Eco/O的系统，这些Fab还是再次 克隆入其他载体中，用于获得进一步测定的足够的重组蛋白。
实施例2:在VZV感染的细JJ&^^N^上测试的DDF-VZV1和 DDF-VZV2的性肯fe
材料和方法
KZ厂#一弄^人类/^6的哞^^/，刀^/;t利用104-105 MRC-5细月包在Costar 24孔才反中进4亍噬斑减少测 定，这些细胞在其中在37。C下孵育72小时之后通常形成汇合单层 的条件下接种到该板中。使用的VZV病毒4朱是临床分离物。
Fab如实施例1中指出的那样部分纯化并以具有相同体积的悬 浮在维持i咅养基(maintenance medium )的无VZV细月包原'液(ELLEN 抹；感染0.01复数(或多重性，multiplicity))的各种浓度(0.01、 0.1、 1、 10和50 pg/ml)混合。在没有Fab (空白对照)或存在对 人类丙肝病毒特异的不相关Fab ( el37; Bugli F et al., 2001 )的情 况下，对照由相同体积的维持培养基和病毒构成。
在37°C下孵育1小时之后，将250 jal的病毒片段Fab混合物 或对照混合物接种到孔中(一式两4分)并从其中回收培养基。板在 37°C下孵育2小时以允许吸附未中和的病毒。移出培菌液(或接种 物，inocula)并加入1.5ml的维持培养基。在细l包培养条件下孵育 1周之后，用PBS清洗细胞，利用乙醇在室温下固定10分钟并用 1%结晶紫溶液染色10分钟。用蒸馏水清洗才反三次并计lt溶菌斑。 每一个Fab的中和能力通过计凄t单个溶菌斑和计算与对照才羊品相比 病毒扭王计lt减少的百分lt而确定。
每一个Fab的中和能力通过借助于焚光显樣"竟(Olympus)计 数单个荧光细胞，以及计算与对照样品相比VZV阳性细胞数量减 少的百分凄t来确定。
名建處^为Vf
MRC-5细胞在含有无菌玻璃盖玻片的Costar 24-孔板中进^亍培 养。当细胞培养物以单层汇合(通常在37。C下孵育7天后形成) 时，细胞用病毒-Fab混合物或对照混合物感染如下。移出i咅养基， 并利用VZV Ellen参照4朱以高感染复数对细胞单层进行感染(250ial/孔；感染0.1-1的复凄t),用指定浓度的半纯化Fab预先孵育，在 37°C下孵育1小时。在没有Fab (空白对照)或存在只于人类丙肝病 毒特异性的不相关Fab (e8)的情况下，对照由等体积的维持培养 基和病毒构成。在37°C下孵育^反2小时以允许吸收未中和的病毒。 移出i备菌液并向每个孑L中》文入1.5ml的具有2% FBS的MEM。
在VZV感染后72小时进行免疫荧光测定。在移出培养基后， 细月包单层用PBS清洗一次，并在室温下在,令曱醇-丙酮;容液(1:2比 例；保存在-20。C下)固定10分钟。固定的细胞利用DDF-VZV1 或DDF隱VZV2的酉己制4勿4乍为#刀;欠4元体(或一#元，primary antibody ) 在潮湿环境中在37。C下孵育30分钟，用PBS清洗，最后用抗-人 类IgG Fab特异性FITC-轭合物(Sigma )在潮湿环境中在37°C下 孵育30分钟。作为对照，细胞〗叉利用二次FITC标记的抗体制备， 其中商购抗-VZV抗体4要照制造商的i兌明书4吏用(Argene; Cat. No. 11-017)。另夕卜，用巨细月包病毒感染的MRC-5细月包利用相同的 DDF-VZV1或DDF-VZV2的制剂作为初次抗体进4亍测试。载3皮片 用伊文思蓝对比染色，用甘油纟爰冲液固定，最后通过荧光显孩吏4竟 (Olympus)进行观察。
结果
对于DDF-VZV1和DDF-VZV2两者的中和和结合活性的进一 步分4斤通过利用部分纯4匕的Fab制剂来进4亍。
相比于表现出在感染细月包中的核染色的商业鼠类单克隆抗体， 在免疫荧光中，DDF-VZV1 4朱更强烈地染色在核(周)区域中的 VZV感染细胞，在这里组装VZV病毒体。DDF-VZV2抹更强烈地 染色月包质区中的VZV感染细月包(图4)。在没有初次4元体或利用 DDF-VZV1和DDF-VZV2情况下在纟殳有感染或感染巨细月包病毒的 MRC-5细力包上没有获4寻染色。这些凝:才居还通过在由用VZV感染的个体皮肤获得的细胞(其已经;故短暂培养然后在免疫荧光中进行观 察)上实施的免疫荧光而确i人。
p藍斑减少的凄t才居表明，当用VZV预先孵育时，DDF-VZV1和 DDF-VZV2被赋予强的中和活性。事实上，当相比于对照(没有 Fab或有不相关Fab的VZV )时，这些Fab的加入以剂量依赖性方 式决定p藍扭王形成的减少(图5)。
实施例3:利用pDD-相^l'l!i^Ji载体来产生和确i人DDF-VZVl 和DDF-VZV2
才才一+禾口方法
^Z)丄ac-i^JG/^我雄的设##。^7建
含有DDb盒(其中Zeocine基因用作标记基因(WO 07/007154 )) 的pDD载体已通过用含有两个标签和终止密码子的Nhel-Spel合成 连接物代替包括0口3*序列的5^/-A^e/片4爻进行修饰。这样的连接 物通过退火两个寡核香酸(SEQ ID NO:15和16)产生。所得的双 链DNA分子用S/7e/和A^e/进行消化并制备用于克隆到相应线性化 pDD载体中的步骤。最后的载体通过限制和序列分析进行表征以便 确i人两个标签序列的框内插入。LacI基因/人称为pET28的商购质粒 (Invitrogen )进行PCT扩增，然后插入到Zeocin基因与驱动待融 合至FLAGhis标签的蛋白表达的LacZ启动子之间的Stul位点中。
利用含有DNA冲莫板(20-30 ng)、商购PCR緩沖液(lx; Invitrogen )、引物(0,2 (iM )、 dNTP ( 0.25 mM )、 Taq DNA聚合酶 (0.25单4立；Invitrogen )以及 jc (至50 pi的纟冬体禾口、)的;昆合4勿来 进4亍PCR反应。反应在热循环4义(Perkin-Elmer)中进4亍如下5 分4中94°C， 30个4盾环的94。C 30秒、50-55。C 30秒、72°C 1分钟。^f立点定向突变(或定点突变，site directed mutagenesis) PCR利用 Pfti融合Taq聚合酶(Stratagene )如上所述在相同的扩增条件下进 行。用限制性酶对DNA的消化4要照制造商的i兌明书实施(New England Biolabs )。细菌p蓝菌体T4-DNA连4妄酶(Boehringer )用于 使所制得的DNA片段连接到适当的载体中。载体:插入DNA的摩 尔比为1:3并且DNA的总浓度为约50 ng。连4妄反应在20 jxl中进 4亍如下DNA (50 ng),连4妄纟爰沖液(lx )， 10 mM ATP( 1 |il )， T4 DNA 连_|妻酶(4单位)以及水(直至20 fil )。 T4连接反应在15。C下实 施过夜。TG1或XL-1蓝色大肠杆菌竟争性细胞利用CaCl2方案制备 并用包括pDLac-FLAGhis载体的连接混合物转化。
编码DDF-VZV1和DDF-VZV2的重《连和轻《连的序列利用适当 的限制^立点克隆入 pDLac-FLAGhis 中。最纟冬载体 (pDLac-VZVl-FLAGhis和pDLac画VZV2画FLAGhis )通过限制和序 列分析进行表征以-使确认两个抗体序列的框内插入(或符合读框的 才翁入,in frame insertion )。
大肠杆菌(E.coli ) XL-1 蓝是待用作对照的转化 pDLac画VZVl-FLAGhis、 pDLac-VZV2画FLAGhis 、或表达e509的 pDLac-FLAGhis变体、HCV特异性Fab ( Bugli et al.， 2001 )。
所得^^朱用于在细菌培养物中生产Fab。为此，将由转化获得的 单个菌落接种到10 ml的含有四环素(10 jig/ml)、氨千西林(100 jug/ml)禾口十專莱審素(zeocin) (50 pg/ml)的SBi咅养基中。 <吏纟田菌 在37°C下生长12小时。在该孵育时间之后，将500jal它们稀释在 100 mL的补充了相同抗生素的SB中并4吏其生长6-8小时直至它们 达到0.6 OD。加入异丙基-|3 -D-石克代-半乳糖普(IPTG )至1 mM的 终浓度，并将细胞在30。C下在旋转摇床中孵育另外的14小时。通过以5000 g离心20分钟来收获细菌，再悬浮在1 mL的磷酸盐緩冲 盐水(PBS )中，并通过冷冻-解冻(或冻融)程序(在-80。C和37°C 下的三个步骤)溶解。细胞石争片通过在室温下以15000 g在离心冲几 (microfuge )中离心5分4中而移出。
上清液用于利用抗-Fab和抗-His抗体4全测的蛋白质印迹分析， 以便;险测Fab表达。进行SDS-PAGE，加载有或没有|3-巯基乙醇的 样品(还原和非还原条件下)，然后以350mA实施2小时印迹；硝 基纤维素纸首先用丽春乡工(Ponceaus Red)染色以确i人出现的印迹， 然后利用10。/o牛奶/PBS/吐温0.1% (封闭溶液)4吏其在4。C下搅拌 过^_。在用PBS/吐温0.1%清洗一次之后，硝基纤维素利用-束才艮过 氧4b物酶(HRP) 4厄合的抗-Fab抗体(Sigma)或利用HRP库厄合的 抗-His标签抗体(Roche)在室温下在搅拌下孵育1小时。在用PBS/ 吐温0.1 %清洗三次之后，力口入SuperSignal West Pico 4匕学发光底物 (Pierce )并分别对膜显影30秒、1分钟和5分钟。
将用抗-Fab 4企测的〗言号与抗-His HRP-扼合的4企测进4亍比4交。它 们两者显示 60 kDa的大条带，只于应于天然形式的Fab片|殳(当'澄 清细胞提取物利用非还原条件而在凝胶中运行时)。当利用还原条 件4吏相同的样品经受SDS-PAGE时，如果4吏用抗-His抗体^f义为重《连 ( 25kDa)。利用抗-Fab的4企测表明存在由于未净皮标记而不能纟企测 的轻链。
对于FLAGhis标记的Fab的较大规模生产，含有四环素(10 (ig/ml)、氨千西林(100 (ag/ml)和博莱霉素(zeocin ) (50 jag/ml) 的超级肉汤的一升等分试样利用用特异性pDLac-FLAGhis载体转 化的一个细菌菌落进行接种，并在旋转摇床中在37。C下生长7h， 如所述利用IPTG诱导并在30。C下生长过^复。细胞通过离心收获， 利用25mL的PBS再悬浮并声波降解。细胞碎片通过离心(15000 g， 50分钟)去除，并通过IMAC对0.22 pm过滤的上清液进4亍纯化。标准Qiagen纯化方案如下将NiNTA树脂(Qiagen )用结合 緩沖溶液(磷酸盐纟爰沖液，10mM咪峻)平4軒，然后4吏过滤的上清 液与该树脂(300laL树脂/100mL培养物)混合并在4°C下在搅拌 下留置1小时。该溶液以400 g离心5分钟以回收连接至该树脂的 Fab片段并收集流出物。树脂用5倍体积的结合緩冲液10 mM咪唑 清洗以去除非特异性结合。His-Flag Fab片段用3倍体积洗脱緩沖 液(石粦酸盐纟爰冲液，500 mM NaCl, 500 mM 。米峻)进4亍洗脱。洗 脱的等分试样通过SDS/12.5。/。聚丙烯酰胺凝力交电泳进行分析，并利 用考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹进行才企测。
结果
DDF-VZV1和DDF-VZV2的活性已经作为部分纯4b的Fab和 重组噬菌体进行了初步测试。进一步的确认需要利用适当的细菌表 达系统测试以纯化重组蛋白形式的这样的抗体片段。
带有感兴趣Fab的噬菌粒通常转移到用于生产可溶性分子的合 适表达载体和/或适当的细菌抹(例如，琥珀非抑制剂(amber non-suppressor)中。在避免这才羊的專毛时分子克隆步骤的情况下，更 有效的方式是产生一种具有与原始pDD载体中的那些相容的限制 位点的表达载体，其中原始pDD载体用于鉴定这样的Fab。此夕卜， 标签序列的存在允i午更容易;也纯化和;险测Fab。
i殳计并构建这样的表达载体，称为pDLac-FLAGhis。其基于 pDD载体，其中用于cp3W々编码序列^L编码两种蛋白标签(FLAG 肽，包含8个氨基酸和6-组氨酸标签)的序列代替，随后是终止密 码子(图6A)。组氨酸标签使Fab可以通过亲和层析进行纯化，例 ^口利用IMAC (固定4匕金属亲详口层才斤，immobilization metal affinity chromatography )纯4b系统。FLAG标签在才企测测定(例如ELISA ) 中可以是非常有用的。其中这两个标签已被克隆和融合至重組蛋白的载体、以及用于斥企测或纯^匕FLAGhis才示i己的蛋白的手革殳已经描述 在文献中(Pagny S et al" 2000; Koivunen P et al" 2004; Komatsu M et al.， 2004 )。
已经利用pDD噬菌粒初始鉴定和表征的Fab(或任何其他蛋白 序歹'J )可以利用DD盒才是取，该DD盒然后定向地克隆入 pDLac-FLAGhis载体中。以这种方式，原始融合至衣壳蛋白的序列 现在,皮克隆入在C-端具有FLAG标签和聚组氨酸标签的才匡架中。所 得载体含有在DD盒内的原始标记基因(例如Zeocin基因)，允许 选捧含有期望插入物的载体。作为用于^空制;f寺利用pDLac-FLAGhi 载体中的LacZ启动子表达的蛋白的转录的手段，已将LacI基因插 入到原始DD盒中(图6B )。
这种克隆策略提供两个优点。第一个优点是增大原始DD盒中 的两个LacZ启动子区之间的空间，避免可能的同源性重组。第二 个优点是从Lacl基因编码的阻遏蛋白，已知能够下调表达系统阻断 其结合至LacZ启动子的操纵子区。然后利用适当浓度的IPTG和/ 或葡萄糖调节诱导。在诱导之后，在LacZ启动子控制下克隆的序 列/PelB信号序列均被表达并耙向周质，在这里pe旧序列随后被酶 信号肽酶切割。在周质内，适当的氧化条件允许在重组蛋白中形成 二硫键和正确的蛋白折叠(例如组装到异质二聚体蛋白中的Fab的 轻链和重链)。FlAGhis标记的蛋白可以通过洗脱和测试用于亲和层 析的柱子的流分而纯化至同质性(图6B)。然后，这种蛋白可以在 利用例如商购抗-FLAG单克隆抗体(可获自Sigma)的蛋白质印迹 或免疫荧光中鉴定。
利用这种方式，生产DDF-VZV1和DDF-VZV2的FLAGhis标 记形式(图7)以及对照Fab，并在上述测定中进行测试。所选Fab 的这些重组变体i正实了关于VZV中和活性的原始7见察结果，表明 IC50为约2 (ig/ml (图8A )。然而，当两种Fab组合到单个制剂中时，这种制剂的VZV中和活性导致优异于含有相同量的单个Fab 的制剂。事实上，当Fab浓度从1 [xg/ml升至2吗/ml时，如果含有 单个Fab的制剂增加其活性10-15%，则含有1 jxg/ml的DDF-VZV1 和1 (ig/ml的DDF-VZV2的制剂具有显著更高的VZV中和活性， 其中IC50值低于2吗/ml (图8B)。这种效应，可能由于由两种Fab 识别的不同VZV特异性表位(参见图4),表明含有DDF-VZV1和 DDF-VZV2 (或具有类似性能的两种抗体或抗体片段)的药物组合 物可以4是供针对VZV感染和VZV相关疾病的更好治疗或予贞防作 用。
这里才是供的实-险证据4吏得DDF-VZV1和DDF-VZV2 (或基于 它们的特异性HCDR3并表现出类似性能的可替换蛋白序列)成为 用于涉及VZV感染和VZV相关疾病的it断、治疗或预防应用的候 选化合物。73: 313-21.Aldrich T et al" (2003). Biotechnol Prog. 19: 1433-8.Andrei G et al., (2005a). Antimicrob Agents Chemother. 49: 4671-80.Andrei G et al., (2005b). Antimicrob Agents Chemother. 49: 1081-6.Arvin A (1996). Clin Microbiol Rev. 9: 361-81.Baiker A et al., (2004). Proc Natl Acad Sci U S A. 101: 10792-7.Barrios Y et al" (2004). J Mol Recognit. 17,:332-8.Bayry J et al" (2007). Nat Clin Pract Neurology. 3:120-1.Benhar I, (2001). Biotechol Adv. 19: 1-33.Berarducci B et al" (2006). J Virol 80: 9481-96.Bianchi A and McGrew J, (2003). Biotechnol Bioeng. 84 : 439-44.Bohm E et al" (2004). Biotechnol Bioeng. 88: 699-706.Bond C et al., (2003). J Mol Biol. 332: 643-55.Bradbury A and Marks J (2004). J Imimmol Methods. 290: 29-49.Brereton H et al., (2005). Br J Ophthalmol. 89: 1205-9.Bugli F et al., (2001). J. Virol., 75: 9986-9990.Burgoon M et al., (2003). 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Zerboni L et al" (2005). Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 6490-权利要求
1.一种蛋白，包括与SEQ ID NO.5具有至少90％同一性的序列。
2. 根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包括与SEQ ID NO.: 2具有至少90%同一'f生的序列。
3. 根据权利要求1或2所述的蛋白，其中，所述蛋白进一步包括 与SEQ ID NO.: 7具有至少90%同一性的序列。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中，所述蛋白是抗 体、抗体片,殳、生物活性肽、或融合蛋白。
5. 根据权利要求4所述的蛋白，其中，所述抗体片段是可变重链 /轻链异质二聚体、或单链可变区片段。
6. 根据任一前述权利要求所述的蛋白，其中，所述蛋白结合并中 和水痘带状疱渗病毒(VZV)。
7. —种编码前述斥又利要求中4壬一项所述的蛋白的核酸分子。
8. 根据权利要求7所述的核酸分子，其中，所述核酸与SEQ ID NO.: 1具有至少90%的同一'I"生。
9. 一种载体，包括根据权利要求7或8所述的核酸。
10. —种重组噬菌体、 一种原核宿主细胞、或一种真核宿主细月包， 包括根据权利要求7-8中任一项所述的核酸。
11. 根据权利要求7至9中任一项所述的核酸或者根据权利要求 10所述的重组噬菌体或宿主细胞在生产根据权利要求1至6 中4壬一项所述的蛋白中的应用。
12. 根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白在制备用于检测、治 疗、抑制、预防和/或减轻VZV感染或VZV相关疾病的组合 物中的应用。
13. —种治疗、预防或诊断组合物，包括根据权利要求1至6中任 一项所述的蛋白。
14. 才艮据^5l利要求13所述的组合物，其中，所述组合物用于眼部 或局部给予。
15. 根据权利要求13或14所述的组合物，进一步包括不同的VZV-中和抗体、VZV-中和抗体片段、静脉内免疫球蛋白制剂、类 固醇、和/或4元病毒4匕合物。
全文摘要
本发明提供结合水痘带状疱疹病毒(VZV)并中和VZV感染的新抗体序列。该新序列可以被用于VZV感染的医学管理，尤其用于检测该病毒或用于制备在预防性或治疗性处理VZV感染中使用的药物组合物。
文档编号C07K16/08GK101663318SQ200880011074
公开日2010年3月3日 申请日期2008年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者罗伯托·布廖尼, 马西莫·克莱门蒂 申请人:里博瓦克斯生物工艺有限公司