专利名称：huTNFR1选择性拮抗剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及特异性结合于人肿瘤坏死因子1型受体 (huTNFRl)的配体，该配体包含一种或多种能够降低在人类中 配体的免疫原应答的人源氨基酸序列，和一种或多种能够选择 性结合于huTNFRl的氨基酸序列。本发明进一步涉及编码所述 配体的核酸以及用于治疗与huTNFRl相关的疾病的药物组合 物。
背景技术：
TNF是调节炎症及凋亡的关键细胞因子。依赖于细胞类型 和周围环境，TNF可具有相反作用，免疫刺激或免疫抑制，TNF 可介导凋亡，也可抗凋亡(Locksley等，Cell， 2001, No. 104, p. 487-501; Aggarwal B. B.， Nat. Rev. Immunol" 2003, No. 3， p 745-756J)。在人类中，TNF是总体上调节先天性免疫系统和炎 症反应的必需细胞因子，它也已被认为是许多慢性和急性疾病 的中心致病介体。具体地，在分别伴随有TNF和TNFRl过表达 的风湿性关节炎(RA)、 炎症性肠病如Morbus克罗恩(Morbus Crohn)病和溃疡4生结肠炎(colitis ulcerosa)、 4艮屑病、 一些罕见 遗传性疾病如颌骨增大症和周期性发热综合症中(Chatzantoni K, Mouzaki A., Curr. Top. Med. Chem.， 2006, No. 6, p. 1707-1714; Ueki等，Cell, 2007, No. 128， p. 71-83; Simon A., Van dcr Meer J. W.， Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2007, No. 292, p. R86-R98)， TNF体系已—皮确定为病理相关介 体。在导致所谓细胞因子症状的暴发型病毒或细菌感染中，已 知TNF的参与是关键性的，大量文献证实其在感染性休克和多脏器衰竭中，作为介体的至关重要的作用。TNF还牵涉其他许 多疾病，特别是包括肥胖症和2型糖尿病在内的代谢病 (Hotamisligil G. S., Nature, 2006, No. 444, p. 860-867; Storz等， FEBS Lett., 1998, No. 440， p 41-45)和某些类型的肝炎(Kusters 等，Eur. J. Immunol., 1997, No. 27, p. 2870-2875)。》匕夕卜，尽管 TNF在某些癌症局部治疗中具有已知治疗活性，其也被认为是 其他恶性疾病的3中瘤启动子，可能是通过N F - k B介导的凋亡抑 制牙口其4也存活途4圣(Luo等,Antibody engineering methods and protocols, 2004, Humana Press, Towota, p. 135-159)。 因， 临 床试验当前也开发出抗TNF的策略，作为 一些恶性血液病(例如 AML)的治疗方案。从机械论的观点，已证明在包括TNFR敲除 小鼠在内的许多冲莫型中，TNFR1是TNF的病理表型的主要介体 (Locksley等，Cell, 2001， No. 104, p 487-501; Agga面l et al.， Nat. Rev. Immunol. , 2003, No. 3， p. 745-756)。
在一些'f曼性炎症疾病中，TNF中和试剂，特别是抗TNF抗
体和可溶性TNFR-Fc融合蛋白，^皮广泛应用于临床上。三种干 护uTNF作用的药物已一皮批准Remicade (Vilcek and Feldmann, 2004) (Centocor/Tanabe) 、 Enbrel (Immimex/Wyeth)和Humira (Celltech/Abbott)。这些药物均耙向TNF本身。这些药物被批准 用于治疗风湿性关节炎(RA)、青少年RA、银屑病关节炎、克隆 氏症(Crohn，s disease)和僵直性脊推炎。TNF靶向药物在RA上显 示巨大成功，但是其治疗效果仅仅持续有限的时间，而且有些 患者对抗TNF抗体治疗是先验的(priori)不作反应的(refractory) 或者会产生抗性。此外，例如在克罗恩病(Morbus Crohn)方面， 利用CDP571( —种人源化TNF特异性单克隆抗体)的临床试验结 果确实是比预期前景差，需要开发出新的观念和靶向 TNF/TNFR体系的试剂。除了预期的 一 般性免疫抑制之外，获批准的抗TN F药物还 显示出额外的副作用，如产生抗dsDNA抗体、狼疮和神经炎症 性疾病。患者在 一 般性TNF阻断下的免疫抑制状态伴随着感染 传染性疾病的风险增加，包4舌共生体在内。在"Lenercerpt研 究"(1999)中，用于治疗MS的抗TNF药剂的临床试-验不得不停 止，因为疾病状态变得更坏，而不是更好。当时未预期的不良 反应的机械论背景目前较为清楚，其涉及TNFR1和TNFR2在该 疾病中的差异化作用，TNFR1信号传播神经元坏死，TNFR2信 号活化髓鞘片再生。总之，如下概述，更多的证据显示旨在受 体选择性靶向TNF作用的全新治疗策略在多数情形下应优于对 TNF信号传导的一^:性阻断。例如，在下面详述的一些动物疾 病模型中，TNF作用的矛盾效应通过不同受体TNFR1和TNFR2 的不同功能来解释。目前，所获得的有关受体水平上的TNF作 用机制的知识确实开发出新型治疗策略，旨在对其中 一种受体 进行药理学阻断，从而潜在地导致更特异化效果。
例如，视网膜缺血为糖尿病的并发症，其中的视网膜神经 元经历TNF诱导的凋亡，从而导致失明。TNFR2敲除小鼠的视 网膜显示出凋亡增加，但是TNFR1敲除小鼠的视网膜与野生型 相比，显示出凋亡减少(Fontaine等，J. Ne訓sci, 2002, No. 22, RC216)。
同样，EAE为多发性硬化(MS)的动物模型。其特点在于直 接针对髓鞘产生原发性自体免疫炎症。髓鞘特异化反应随后减 退，而其他抗原表位取代成为自体免疫抗原。在TNF敲除小鼠 显示对髓鞘的较弱原发性炎症的同时，髓鞘特异化免疫反应不 再减退。在TNFR1敲除小鼠中，原发性炎症同等减弱，但是随 后减退，这表明TNFR2足以介导TNF的长期免疫抑制功能，同 时该炎症通过TNFRl介导(Kassiotis G., Kollias G., J. Exp. Med.,2001, No. 193, p. 427-434; Kollias等，Curr. Dir. Autoimmun.,
2002, No. 5, p. 30-50; Owens等，Nat. Med., 2001, No. 7, p. 161-166)。
同样，在诱导毒素(双环己酮草酰二腙(cuprizone))的可逆的 CNS脱髓鞘作用的小鼠模型中，类似于多发性硬化(MS)中的脱 髓鞘作用/再生阶段，有说服力的证据是，撤回毒素下的髓鞘再 生是TNF依赖性的，并且选择性需要TNFR2信号传导、引起少 突细胞前体扩增以及分化为形成少突细胞的成熟髓鞘片 (Arnett等，Nat. Neurosci., 2001, No. 4， p. 1116—1122)。少突细月包 再生的TNF依赖性的发现反映出人类患有MS的情形旨在用 TNFR1 -Fc融合蛋白进行MS完全TNF阻断的临床试验中，TNF 的阻断伴随着疾病的恶化而不是治疗效果，这与上述动物模型 的结果一致。
此外，例如 一 旦通过神经传递素谷氨酸酯(glutamate)明显 触发NMDA受体，小鼠的皮层神经元经历兴奋性毒素死亡。谷 氨酸酯是从诸如敲击时出现的缺血条件下(氧气缺乏)的垂死组 织中释放出来的。可4吏得原始培养的神经元，充分抵抗包括 PI3K-AKT-NF-KB途径的TNFR2依赖性兴奋性中毒。相比之下， TNFR1信号促进了谷氨酸酯诱导的细胞死亡(Marchetti等，J. Biol. Chem., 2004, No. 279， p. 32869-32881),从而表明在CNS 中TNFR1和TNFR2的不同作用。
因此，在急性和慢性神经变性、视网膜缺血、敲除模式以 及多发性硬化的各种模型中，TNF的完全阻断不具有明显的治 疗效果，相反却直接损害或降低受影响组织的再生能力。因而， 特异化阻断TNFR1、炎性TNFR以及维持TNFR2功能，给出了用 于这些疾病的有前景的治疗方法。
同样，在分别伴随有TNF和TNFR1过表达的风湿性关节炎
9(RA)、银屑病以及一些罕见遗传性疾病如颌骨增大症和周期性 发热综合症中，TNFR1被认为或已被明确地确定为疾病的有关 受体。TNFR1和2的不同功能在克罗恩病方面也变得明显起来， 其中，仅 一 小部分患者对抗TNF疗法作出反应，而在 SLE(Komata等，Tissue Antigens, 1999, No. 53, p. 527-533)中，分 别抵抗治疗和疾病易感性，均与TNFR2突变有关4关。
因此，利用受体选4奪性抗体以耙向TNFRH、表一种在这些 慢性炎性疾病中建立抗TNF策略的替代方案(alternative)。这样 可看出患者体内的特殊关联性，所述患者在经过重复治疗周期 时变得对抗TNF试剂不作反应。此外，由于全面并持续的TNF 阻断与先天的和适应的免疫应答的功能性缺陷有关联，起因于 传染性疾病的并发症的风险在这些患者体内大量增加。选择性 干扰TNFR1通过TNFR2维持TNF的应答，这应该有益于患者的 全面免疫能力。
发明人之前对人TNFR1特异的拮抗小鼠单克隆抗体 (mab)H398的体内和体外功能研究支持选择性TNFR1阻断作为 强有力的治疗方案(Thoma等，J. Exp. Med., 1990， No. 172, p. 1019-1023; Grell等，Cell, 1995, No. 83, p. 793-802; Moosmayer 等，Ther. Immunol., 1995, No. 2, p. 31-40)。该鼠源性抗体及其 重组小鼠scFv衍生物通过竟争性抑制TNF结合人TNFR1,在体 外广泛中和TNF活性；显示mab在防止狒狒体内细菌诱导的致 命性休克症状方面是有效的，其中H398表现与该物种的TNFR1 交叉反应。无法评估临床试验中抗体H3 9 8在TNF4衣赖性的慢性 疾病方面的治疗步丈果，因为抗体为鼠源性(mouse origin)， 需要 承受对鼠源性抗体的急性不良反应和/或经过重复性治疗周期 迅速发展的免疫应答的风险。
因此，需要有新型物质，该物质作为患者体内的TNF拮抗剂，应该有效并特异地与人TNFRl(huTNFRl)相互作用，并且 经过给药于人后应该具有降低的(即可耐受的)免疫原应答。
发明内容
因此，本发明隐含的技术问题是提供新型低免疫原 huTNFRl-配体，其作为适于人的TNF作用拮抗剂，作为治疗各 种TNF介导的疾病的治疗剂。
根据本发明，上述问题通过提供huTNFRl-配体解决，该配 体包4舌具有长口下的蛋白质结构(proteinaceous construct): (i) — 种或多种人源氨基酸序列，该人源氨基酸序列能够降低在人中 所述huTNFR 1 -配体的免疫原应答，以及(ii)一种或多种非人源 氨基酸序列，该非人源氨基酸序列能够选择性结合于huTNFRl 。
在此，术语"huTNFR 1 -配体，，是指当给药于人时能够选择性 结合人TNT l型受体(huTNFRl)并同时显示降低的免疫原应答 的任何分子或分子组。通过结合于huTNFRl,所述huTNFRl-配体作为TNF和'淋巴毒素-a(LTa)的拮抗剂，它们是TNFR1的其 他天然配4本。
此处所用的术语"huTNFRl，，并不仅涉及人TNF l型受体， 同样还包括其中的任何部分，或者在结构上和/或功能上与 huTNFR 1有关的任何其他受体。
表达方式"降低的免疫原应答"是指一种免疫原应答，其相 比于仅包括非人源氨基酸序列的huTNFRl -配体的免疫原应答 而降低。仅包括非人源氨基酸序列的huTNFRl-配体的实例包括 非人源哺乳动物源，如啮齿动物源的肽、蛋白质和核酸，如鼠 源性抗体。
在此所用的表达方式"蛋白质结构"并不特别限定，其指含 有一个或多个肽键的任何分子或分子组，优选肽序列，并且结合于huTNFRl,同时显出在在人类中降低的免疫原应答。根据
本发明的蛋白质结构可进 一 步包括核酸和有机及无机化合物， 如糖类或脂肪酸。此外，蛋白质结构可包括经过共价键或非共 价键独立关联的一组分子，如融合蛋白。^f艮据本发明的另一个 实施方案，蛋白质结构可进一步与附加分子联合，如聚乙二醇
或曱氧基-聚乙二醇，即可将它PEG化。
本发明的huTNFR 1 -配体和/或蛋白质结构可通过任何本领 域技术人员已知的合适方法生产，像如通过包括构建合适质粒 或载体并在微生物或任何更高级的有机体内的表达的重组方 法，或者通过自动肽合成，如固相肽合成。
在此所用的表达方式"人源氨基酸序列，，是指在在人类中可 发现的该氨基酸序列。但是，该表达方式并不仅限于恰好在在 人类中发现的该氨基酸序列，还包括与人氨基酸序列有50%或 更高相似性的那些氨基酸序列。人源氨基酸序列的具体实例为 包含于人抗体内的氨基酸序列或者其中的片段。
此外，在此所用的表达方式"非人源氨基酸序列，，是指可在 非人类动物如非人哺乳动物体内发现的任何氨基酸序列。例如， 非人源氨基酸序列可以是非人抗体，如鼠源性抗体的序列。
在本发明的蛋白质结构中，人源氨基酸序列的优势在于降 低患者诸如免疫原的风险，这些优势与对非人源氨基酸序列 huTNFR 1 (例如在鼠源抗体H3 9 8中所发现的)的选择相结合。
才艮据如上述限定的huTNFRl-配体的另 一个实施方案，蛋白 质结构包括人源化抗体或者其中的至少一个片段。
在此所用的术语"抗体"是指可结合于抗原的任何种类的抗 体，包括天然抗体、变异抗体以及(半)合成抗体，只要该抗体 允许在给药人体时伴随有对其降低的免疫原应答。在优选的实 施方案中，该抗体或者其中的片段是通过如重组核酸技术而获
12得的人源化抗体("人源化重组抗体，，)或者其中的至少 一个片 段，或者抗体类的重组蛋白质。作为实例，对其没有限制，一
个片段可包含在抗体类重组蛋白，如双4连抗体(diabodies)、 scFv-Fc融合蛋白以及scFv-CH3融合蛋白。
抗体，或者其中的至少一个片段，或者抗体类重组蛋白质， 可包含一种或多种突变或变异，如增加、删除或替代的氨基酸 或核酸，只要对与huTNFRl的相互作用没有负效应即可。此外， 该抗体，或者其中的至少一个片段，或者抗体类重组蛋白质， 可包含一种或多种突变或变异，如增加、删除或替代的氨基酸
子的拮抗活性。特别地，该突变变体具有更好的亲和力和/或更 好的抑制活性。
根据本发明，术语"片段，，是指如上述限定的抗体的任何部 分，只要其具有通过 一 个(单价)或两个(二价)抗原(h u T N F R1)结 合位点结合于所要的抗原的能力即可。另外，本发明的片段可 包括来自所述抗体的几个不同部分。蛋白质水解(proteolytically) 或重组产生的抗体的单价片段的实例包括抗原结合片段 (Fab)、单链可变区片段(scFv)、可变区片段(Fv)、 二硫键稳定 性Fv(dsFv)、免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白轻链可 变区(VL)、互补决定区(CDRs)及其组合。本发明的蛋白水解加 工或重组的二^介片l殳的实例包4舌F(ab)2、双《连抗体、scFv-Fc 融合蛋白质以及scFv-CH3融合蛋白质。
例如，该抗体或者其中至少一个片段可以是衍生自鼠源性 抗体H398的人源化抗体或者其中的至少一个片段。
关于抗体的人源化技术不受限定，只要该抗体结合于所要 的抗原即可。人源化的实例包括但不限于，互补决定区移植 (CDR移植)(Jones等1986， Nature 321, 522-525)，特异性决定残基移植 (specificity determining residue grafting)(SDR移 植)(Kashmid等，2005， Methods 36， 25-34),可变区重塑(Roguska 等.，1994， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 969-973),通过C D R 移植的基于结构的选择和人源化(Hwang等，2005, Methods 36, 35-42),以及脱免疫(delmmunization)方案(Hellendorn等，2004, Cancer Cell International 4 (Sppl. 1)， 20)。
在此所用的表达方式"人源化抗体"是指利用蛋白质工程减 少外来("非人，，)蛋白质序列的量的任何抗体，其通过将人抗体 内发现的序列与如啮齿动物抗体不变区和/或可变区框架或框 架残基进行交换达到。
在本发明的具体实施方案中，上述限定的huTNFRl-配体的 蛋白质结构可以是人源化抗体，该抗体含有人源氨基酸序列和 非人如啮齿动物源的该序列。
此处所用的术语"scFv"是指任何免疫球蛋白的重链和轻链 的可变区的融合，其通过接头连接，接头是如由丝氨酸、甘氨 酸或者任何其他的天然或非天然氨基酸组成的肽。
在上述限定的huTNFRl-配体的进一步的实施方案中，该至 少一个片段选自由所述片段的Fab区、scFv、基因工程或翻译 后加工的重组衍生物和所述片段的化学改性衍生物组成的组。
才艮据上述限定的huTNFRl-配体的具体实施方案，该至少一 个片段是包括根据SEQ ID NO.: 9的氨基酸序列的scFv。
在上述限定的huTNFR1-配体的进一步的实施方案中，该蛋 白质结构包括选自由SEQ ID NOs: l至6或其中的部分组成的、 赋予与huTNFRl结合的组的一种或多种互补决定区(CDRs)，其 中所述CDRs优选包含于一种或多种非人源氨基酸序列中，该氨 基酸序列能够选择性结合如在上文蛋白质结构(ii)所述的 huTNFRl 。上述限定的huTNFRl-配体的CDRs,如SEQIDNOs: l至6， 可以任何组合存在，如可存在两种、三种、四种、五种或六种 所述CDRs。另外，任何一种CDRs的多拷贝或遗传性变型均可 存在于本发明的huTNFRl-配体中，只要当给药于人时配体显示 对人TNFRI的充分亲和力和降低的免疫原应答即可。
根据huTNFRl -配体的具体实施方案，该蛋白质结构包括根 据SEQ ID NO.: 7的氨基酸序列作为重链可变区(VH)，以及根据 SEQ ID NO.: 8的氨基酸序列作为轻链可变区(VL)。
在本发明的还另一个实施方案中，上述限定的huTNFRl-配体包括允许与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的附 加标签。不特别限定有关本发明中所用的标签，只要当给药于 人体时其对huTNFR 1 -配体与huTNFRl的结合或者免疫原应答 没有影响或具有耐受性负面影响即可。合适标签的实例包括 His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep匿标签、Calmodulin-标签、GST-标签、MBP-标签以及S-标签。
在上述限定的huTNFRl-配体的另 一个实施方案中，蛋白质 结构进一步包括通过翻译后化学接合或者通过重组基因技术非 共价结合或共价结合其中的生物学上可接受的化合物。
在此所用的表达方式"生物学上可接受的化合物"并不特别 限定，是指用于生物环境中如有机体中的任何化合物，还包括 所述生物学上可接受的化合物的药物学可接受性。对其没有任 何限制，根据本发明的生物学上可接受化合物的实例是，肽、 蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类，以及其他有机和无机化合 物。生物学上可接受化合物优选发挥附加正效应，例如改进的 生物化学/生物物理性能，如增加的溶解性、延长的稳定性、 改进的拮抗活性，以及改进的药动学性能，如增加的体内半衰 期、增强的组织渗透、血脑屏障通过和降低的毒性。根据旨在改进上述限定的huTNFRl-配体的药动学性能的
一个具体实施方案，生物学上可接受化合物选自由血清蛋白组 成的组。
在如上述限定的huTNFR1-配体的另一个实施方案中，该生 物学上可接受化合物为白蛋白。根据具体实施方案，该生物学 上可接受化合物为人血清蛋白(HSA)。
在如上述限定的huTNFRl-配体的进一步的实施方案中，生 物学上可接受化合物包括白蛋白结合区(如来自细菌)、由天然 或非天然氨基酸组成的白蛋白结合肽、具有白蛋白结合活性的 一种或多种酰链、聚乙二醇或曱氧基-聚乙二醇。在上述限定 的huTNFR1-配体的还进一步的实施方案中，生物学上可接受化 合物包括对血清蛋白成分特异的另 一种抗体或其片段，或者结 合血清成分的天然或合成配体(例如白蛋白)。
在旨在改进如上述限定的huTNFRl-配体的药动学性能的 进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括靶向细胞表 面分子或者细胞外基质成分的另 一抗体。作为实例，抗HIR(人 胰岛素受体)或者抗TR(转铁蛋白受体)抗体已用于经过血脑屏 障的主动转运，以及递送化合物至大脑(Boado等，2007, Bioconjug. Chem., Epub ahead of press)。
在旨在改进如上述限定的huTNFRl -配体的功能性活性的 进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括结合TNFR1 另 一抗原决定部位的抗体，区别于通过上述限定的TNFR1配体 所识别的抗体，从而改进该双特异性试剂的总结合性 (binding)(亲和力)和选择性。
根据上述限定的huTNFRl-配体的另 一个实施方案中，该蛋 白质结构包括根据SEQ ID NO.: 10的融合蛋白。
本申请的另 一方面涉及编码上述限定的huTNFRl-配体的核酸。
本发明的核酸并不特别限定，并且可包含DNA或RNA。该 核酸可进一步包括用于检测或分离步骤的序列，像如荧光标签 或组氨酸标签(His-tag)。该核酸可进一步包含人工构件如人工 DNA、 RNA或PNA构件。此外，本发明的核酸可以任何合适方 式生产，如重组或通过化学合成，如固相合成。
本发明的另 一方面涉及包括上述限定的核酸序列的载体。 本发明的载体并不特别限定，只要其可用于转染合适宿主细胞 并适于外源基因表达即可。
用于构建载体的方法对于本领域技术人员是公知的，并且 描述于各种出版物中。特别地，用于构建合适载体的技术，包 括功能性成分如启动子、增强子、终止和多腺苷酸化信号、选 择标记、复制起点、剪接信号和前导序列的描述，相当详细地 评述于Sambrook等，1989及在其中所引用的参考资料中。载体 可包括但并不限于，质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/小染色体 (如ACE)、 MAR载体，或者病毒载体，如杆状病毒、反转录病 毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱渗病毒、逆转录病毒、噬菌 体。适于原核表达的载体的实例包括pABl(Kontermann等， 1997)。真核表达载体也代表性地包括促进细菌内载体增殖的原 核序列如复制起点和用于在细菌内选择的抗生素抗性基因。包 含可操作性连接一种或多种多核苷酸的克隆位点的多种真核表 达载体，对于本领域技术人员来说是公知的，并且一些可从如 下/〉司商购例^口 Stratagene， LaJolla, CA; Invitrogen, Carlsbad ， CA; Promega, Madison, WI; BD Biosciences Clontech， Pak) Alto, CA; Lonza Biologies PLC, Slough, Berkshire， England。 真核载 体的实例为pCDNA3、 pSecTag和pEE 6.4。
在优选的实施方案中，表达载体包括至少一种核酸序列，该核酸序列是编码目标肽/多肽/蛋白质的转录和翻译核苷酸序 列必需的调节序列。
本发明进一步方面涉及寄主细胞，该寄主细胞包含上述限 定的核酸或上述限定的载体。本发明的寄主细胞并不特别限定，
其包括用于生产huTNFRl-配体和/或蛋白质结构或其中的部分 的所有细胞。适于本发明的寄主细胞的实例包括原核细胞和真 核细胞，如酵母、植物细胞、昆虫细胞以及不同种源的哺乳动 物细胞和整个转基因有机物(转基因植物，转基因动物)。原核 细胞的实例包括大肠杆菌(E. coli)/TGl和假单胞种(spec)。动物 细胞的实例包括仓鼠细胞，优选BHK21、 BHK TK-、 CHO 、 CHO-Kl、 CHO-DUKX、 CHO-DUKX Bl和CHODG44细胞或者 该细胞系任何一种的衍生物/子代。在本发明的进一步实施方案 中，寄主细胞为小鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0细胞或者该 细胞系任何一种的衍生物/子代，可用于表达本发明huTNFRl-配体的哺乳动物细胞的实例概括于表l中。 表l:真核生产细月包系
细胞系 顺序号 NS0 ECACC No. 85110503
Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC CCL-10
BHK TK- ECACC No. 85011423
HaK ATCCCCL-15 2254-62.2(BHK画21书t生物) ATCC CRL-8544
CHO ECACC No. 8505302
CHO野生型 ECACC 00102307
CHO-Kl ATCC CCL-61
CH()-DUKX(= CHO duk画，CHO/dhfr-)ATCC CRL-9096<formula>formula see original document page 19</formula>
ATCC CRL-9010 (Urlaub等，1983) ATCC CRL-1781 ATCC CCC-93 ATCC CCL-14 ATCC CRL-1573 ATCC CRX-1651 ATCCTIB-196 ATCC CRL-8644 ECACC No. 87111906
最优选在无血清条件下建立、采用、完全培养寄主细胞， 可选地在无任何动物源蛋白质/肽的培养基中培养寄主细胞。商 业上可3臭4寻的i咅养基3口 Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen， Germany) 、 RPMI-1640 (Sigma) 、 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma)、极限必需培养基(MEM; Sigma)、 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma)、 CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA)、 CHO國S-lnvtirogen)、无血清CHO 培养基(Sigma)和无蛋白CHO培养基(Sigma)，均为代表性的适 合的营养液。任何一种培养基必要时可用如下的多种化合物实 例补充荷尔蒙和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表 皮生长因子、类胰岛素生长因子)、盐(如氯化钠、钓盐、镁盐、 磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苦、胸苷)、谷酰胺 (glulamine)、 葡萄糖或者其他等效能源(equivalent energy sources)、抗生素和痕量元素。也可包括适合浓度的任何其他必 要补充物，此对本领域技术人员是公知的。在本发明中，优选 无血清培养基，但是补充有合适量的血清的培养基也可用于培 养寄主细胞。为了表达选择基因的遗传修饰细胞的生长和选择，
19将合适的选4奪试剂加入培养基中。
此外，提供了一种药物组合物，该组合物包括上述限定的
治疗有效量的huTNFRl-配体以及可选地选自由下述组成的组 的一种或多种附加成分药物学可接受载体、药物学可接受盐、 助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂，或者其中的任何组合。
根据另 一 个实施方案，上述限定的药物组合物用于治疗 风湿性关节炎、4艮屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性 炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代 谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病(优选多发性 硬化、帕金森病和阿尔茨海默病)、以TNF/TNFR1作为致病介体 (causative pathologic mediator)的基因遗4专疾病(<尤选周期性发 热综合症、颌骨增大症和癌)。
如上所述，本发明的huTNFR1-配体可进一步用于制备药 剂，用于治疗任^TTNF有关的疾病。
进一步提供用于治疗患有选自下述疾病的患者的方法风 湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎 症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢 病、急性神经退4亍性疾病、慢性神经退行性疾病(优选多发性硬 化、帕金森病和阿尔茨海默病)、以TNF/TNFR1作为致病介体的 基因遗传疾病(优选周期性发热综合症、颌骨增大症和癌)，该 方法包括将治疗有效量的上述限定的huTNFR 1 -配体给药于所 需患者的步骤。
根据本发明，上述限定的huTNFRl-配体可用于根据现有技 术(Jespers等，1994, Biotechnology)的导向选择步骤，以分离来 自人免疫球蛋白基因文库的功能等效性huTNFRl特异性抗体， 从而进一 步减小所述试齐'J的潜在免疫原(immunogenicity)。
因此，根据本发明的另一方面，提供huTNFRl-配体，该配体包括具有如下的蛋白质结构(i) 一种或多种人源氨基酸序
列，该人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFR 1 -配体的 免疫原应答，以及(ii) 一种或多种氨基酸序列，该氨基酸序列 能够选择性结合于huTNFRl,该huTNFRl是通过将上述限定的 蛋白质结构用作模板导向选择而获得的。
此夕卜，提供一种方法用于生产huTNFRl-配体，该配体当施 用于人体时具有降低的免疫原应答，该方法包括以下步骤(a)
提供上述限定的蛋白质结构，(b)利用所述蛋白质结构的一种或 多种氨基酸序列，特别是非人源氨基酸序列，作为模板，通过 导向选择，识别能够选择性结合huTNFRl的一种或多种人源氨 基酸序列，以及(c)构建所述配体，该配体包括在步骤(b)下识别 的至少一种或多种氨基酸序列。
本发明的另 一 方面涉及包括具有下述的蛋白质结构的 huTNFRl-配体的用途(i)一种或多种人源氨基酸序列，该人源 氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFRl-配体的免疫原应 答，以及(ii) 一种或多种非人源氨基酸序列，该非人源氨基酸 序列能够选择性结合于huTNFRl,在识别和构建另 一低免疫原 huTNFRl-配体中作为模板用于导向选择，该低免疫原 huTNFRl -配体包括基本为或 <又为人源的氨基酸序列。
图l表示下述序列的比对:小鼠单抗抗体H398 Vh和Vl序 列、最接近人种系序列的VH(VHl-69 = l-e = DP-88)和Vl(A3 = DPK15)，以及通过CDR移植产生的人源化Vh和Vl序列(IZI-06.1 VH, IZI-06.1 VL)。 H398和人种系序列之间不同的氨基酸用星号 标记。表示出了框架区(FR)和互补决定区(CDRs)。
图2表示密码子优化的IZI-06.1 VH和IZI-06.1 VL(上道(lane))的DNA序列和相应氨基酸(下道)；各氨基酸始开始和末 端的斜体字不属于IZI-06.1 VH和IZI-06.1 VL,而是涉及用于克 隆/加工的氨基酸序列并包含某些限制酶的剪切位点。
图3表示H398 FV(浅灰色)和IZI-06.1 FV(深灰色)主链的重 叠模型结构，a)两个才莫型结构的侧视图，b) CDR区H1-H3和 Ll-L3的俯视图。用WAM (Whitelegg和Rees, 2000)产生模型， WAM-用于在(Web. 5 Prot. Eng. 13, 819-824)上模拟抗体的改进
算法。结构通过Pymol可视化(DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA)。
图4表示产生细菌载体以表达Fab片段的克隆方案。
图5a表示IMAC(l)准备后，利用非还原的12。/。的凝胶的SDS PAGE之后，在硝化纤维素上的蛋白质印迹(westernblot)。经过 根据标准程序的抗人Fab-AP、 AP染色的检测，将15)iL样品应用 于凝胶。缩写PP^周质提取物，DL= IMAC中的流动，W二清洗 组分(Wash fraction), F二组分(Fraction)。
图5b表示在12%凝胶上SDS PAGE后IMAC( 1)纯化的考马 斯染色。标记的左边部分表示非还原凝胶，右边部分表示在还 原条件下的凝胶。样品体积为15pL。
图6表示结合于受体阳性细胞的IZI-06.1 -Fab的饱和结合曲 线和衍生的斯卡查德图。已减去非特异性结合。所得数据显示， 结合TNFRl -Fas的IZI-06.1 -Fab是饱和的和具有特异性的，其表 观亲和力Ko等于0.778 nM。
图7表示'J、鼠胚胎成纤维细胞的流式细胞术分析，其稳定表 达由TNFR1的胞外域(ED)和死亡受体Fas的胞质域组成的嵌合 受体，TNFR1-Fas(A)，或者由TNFR2-ED和Fas组成的嵌合受体 (TNFR2-Fas) (B),或者删除了 TNFR1的半胱氨酸富集域(CRD) 的嵌合受体，ACRD1-TNFR1-Fas (C和D)，或者CRD1交换突变体，该突变体由含有TNFR2的CRD1的TNFR1-Fas分子组成， CRD1TNFR2-TNFR1-Fas (E和F)。 这些转染子用2.5pg/ml的 IZI-06.1-Fab (A-C、E,白色柱状图)、TNFRl特异性抗体mAb225 (D和F,白色柱状图)、TNFR2特异性抗体80M2 (B，白色加粗 柱状图)在冰上將育两小时，或者i"又仅用二抗作为对照进行处理 (灰色柱状图)。孵育缓冲液为PBA(PBS + 0.05%牛血清白蛋白+ 0.02% NaN3)。纟田胞用FITC标记的二抗孵育(80M2和mAb225: 山羊抗小鼠IgG; IZI-06.1 Fab:山羊抗组氨酸标签(anti-HIS-tag)) 细胞通过流式细i包术分析。对活细胞进行门控，并给出各抗体 的总荧光密度(MnX)。 (Coi^对照值)。
图8表示涉及由IZI-06.1 .抑制TNFR1的图表。Kym I细胞在 处理前 一 天4秦种于96孑L板(在RPMI1640中10.000细月包/孑L +5%FCS)。第二天将细胞用100ng/ml huTNF三倍稀释处理。对 照为滴定PBS。 16小时后细胞通过结晶紫实验分析。OD吸光度 在5 5 0nm测得。将结果作为对照(PB S处理过的细胞)的百分数显 示。上栏(Upper panel):估计1.25ng/ml huTNF为足以诱导最大 毒寸生的齐寸量。下斗兰(Lower panel): 25pg/mlH398、 H398—Fab或 人源化I-1398-Fab预孵育60分钟之后，应用1.25ng/ml恒量 huTNF-,所有均以三倍稀释。16小时后细胞通过结晶紫实验分 析。OD吸光度在550nm测得。将结果作为对照的百分数显示。
表9表示scFv IZI-06.1的组成是结构VH-VL (a)和VL-VH (b) 以及scFv白蛋白融合蛋白质(c)。所有结构包含用于可溶性表达 的N末端前导序列和六组氨酰标签(His6),以及在scFv分子情况 下的myc标签。接头序列显示为黑条。
根据本发明的huTNFRl-配体以高特异性结合人TNFRl,与 该受体的CRD1相互作用。出乎意冲牛地，huTNFRl-配体以非常高 的特异性结合人TNFRl,远超出鼠源性抗体H398的特异性。因而，如上所述的人TNFR1-配体非常有效地防止TNFR1 、 TNF和 LTa的配体天然产生的行为和生物活性，并优于现有技术中所 述的鼠源性抗体H398的拮抗活性。由于人源氨基酸序列的含 量，该配体具有有利的低免疫原性。因此，本发明的huTNFRl-配体允许治疗患有与TNFR1关联的疾病的患者，避免对配体产 生急性不良反应和/或迅速产生免疫应答的风险，同时受益于针 对huTNFRl的非人源氨基酸序列的高选择性和阻断效率。
具体实施例方式
本发明将在下面实施例中进一步说明，但对本发明并没有 任何限定。 实施例
实施例1:电子(in silico)生成基于小鼠单抗抗体H398序列 和人种系IgV基因序列的抗TNF受体1拮抗剂
利用H398重链可变区(VH)和轻链可变区(Vl)( Moosmayer 等，Ther. Immunol" 1995, No. 2, p. 3 1-40)氨基酸序歹'j ，在V base 数据库(http:〃vbase.mrc画cpe.cam.ac.uk/)和IgBlast中搜索相似的 人种系V片段。该搜索识別出61.2-62.2%全相似性的几种VH种 系序列(DP75， DP8, DP88)以及80.0-81.0。/o相似性的几种VL种系 序歹'J(DPK15, DPK13, DPK27, DPK28)。将所识另'J的序歹'J与H398 的VH和Vi进行比对，CDR结构临界的氨基酸、VH/V^临界部分 禾口 ；摔才示区^口戶斤述iK另ll (O'Brien S.， Jones T., Antibody engineering a lab manual, Springer, 2001, p. 567-590; Lo B. K. C， Antibody engineering, methods and protocols, Humana Press, 2004, p. 135-159)。 CDR区利用Kabat、 Chothia、 AbM和Contact的限定来 指定 (Martin A. C. R.， Antibody engineering, a lab manual, Springer, 2001, p. 422-439)。》匕夕卜，L1-L3详口H1-I-12的夫见范分类确定如下Ll-4、 L2-l、 L3-l、 Hl-l、 H2-3 (Martin A. C. R.， Antibody engineering, a lab manual, Springer, 2001, p. 567-590》 对于CDR置换，CDRs卩艮定如下氨基酸L24-L34 (CDRLl)、 L46-L56 (CDRL2)、 L89-L97 (CDRL3)、 H26-H35 (CDRH1)、 H47-H65 (CDRH3)和H95-H102 (CDRH33)。我们选择VH种系 片段VHl-69(l-e, DP88)和V^种系片段A3(DPK15)作为人受体 序列。将所有的六个CDRs插入这些人可变种系片段(图1)。将 所得特定序列分别指定为IZI-06.1 VH (SEQ ID NO.: 7)和 IZI-06.1 VL (SEQ ID NO.: 8)。
实施例2:合成IZI-06.1 VH和IZI-06.1 VL的DNA序歹'J 编码两个人源化可变区(IZI-06.1 VH， (SEQ ID NO.: 7), IZI-06.1 VL (SEQ ID NO.: 8))的密码子优化DNA通过GeneArt (Regensburg， Germany)合成，并加入适当的克隆位点(图2)。 实施例3: H398和IZI-06.1 Fv片段的模型结构 利用Web Antibody Modelling server (WAM) (Whitelegg N. R. J., Rees A. R., Web. Prot. Eng., 2000, No. 13, p. 819画824)产生 H398和IZI-06.1 Fv的模型结构。两个模型结构的比对显示出蛋 白质主链和包括CDRs在内的侧链结构的高度 一 致性，除了 CDRH3显示出轻微扭曲(图3)。这样，H398模型和IZI-06.1模型 的CDRH3顶部的Asp96已/人抗原结合口袋(pocket)移出约 0.38誰。
实施例4:克隆IZI-0&l和构建单价Ig片段(Fab形式) 编码抗体IZI-06.1的可变重链和轻链区(VH, V。的基因通过 GeneArt合成，并插入含有适当克隆位点的载体pPCR-Script内 (pPCR-Script-IZI-06.1-VH,pPCR-Script-IZI-06.1-VL)。为了克隆 Fd片段(VH-CH1)(=构建pABl-IZI-06.1-Fd)， 质粒 pPCR-Script-IZI-06.1-VH用限制酶Sfil和Xhoi消化，将所得片段克隆入用相同酶消化的载体pABl-CHl中(含有人免疫球蛋白yl
重链的CH]区的基因)。为了克隆轻链(VL-CL)(=构建
pABl-IZI-06.1-L),质粒pPCR-Script-IZI-06.1画vl用限制酶Sfil 和Ascl消化，将所得片段克隆入用相同酶消化的载体 pAB1-Ch1(含有人C 区的基因)。包括编码有核糖体结合位点 (RBS)的载体和pelB前导序列的轻链基因是通过来自质粒 pABl-IZI-06.1-L的PCR、并利用引物A (5'-GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTT TCC ACG GCA TGC AAA TTC-3') (SEQ ID NO.: 11)和B(5'-ACG ACG GCC AGT TCT AGA TTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA-3') (SEQ ID NO.: 12)来扩增。在该步中，分别 在5'和3'末端引入Hindill和Xbal位点。PCR产物用卩艮制酶Hindill 和Xbal消化，并克隆入用相同酶消化的质粒pAB1 -IZI-06.1 -Fd 中。这导致最终的细菌表达质粒pABl-IZI-06.1-Fab,其编码抗 体IZI-06.1的Fab片段，该抗体IZI-06.1包括Fd片段C-末端的六组 氨酰标签。
实施例5:表达体系
载体pABl (Kontermann等，1997)
细月包E.coli TG1 (Stratagene， La Jolla, U.S.A.)
基本原理根据标准步骤，在Pi^调控下表达IZI-06.1-Fab, 并进行IPTG诱导。通过加入氨节青霉素完成筛选。
N-末端peLB前导序列允许周质表达靶基因产物，前者通过 周质内的蛋白酶解加工从靶蛋白中去除。用EDTA和溶菌酶去 稳定细菌细胞壁，将靶蛋白作为可溶性蛋白分离。剩余的细菌 细胞用蔗糖/石克酸4美缓冲液以球芽形式维持渗透性稳定，避免细 胞溶解。细胞通过离心一皮分离。
表达-.
步骤分批、摇瓶培养预培养50mL LB培养基加入100(ig/raL氨千青霉素和1 %葡 萄糖，接种一个大肠杆菌单菌落。30°C,摇床孵育(125 rpm)， 过夜。
主要培养1L LB培养基加入100^g/mL氨千青霉素和lo/o葡 萄糖，接种5。/。(V/V)预培养物(pre-culture)。 30。C摇床孵育(125 rpm)。在OD6。Q( 3小时孵育时间)通过加入IPTG(1 mM最终浓度) 诱导蛋白质表达。表达时间为在25。C时3.5小时。
才是取在4000g时离心IO分钟，收集培养物。重悬沉淀物 (pellets)于50mL周质溶解緩沖液PPA (PPA: 30 mM Tris-HC1， 1 mM EDTA, 20%蔗糖)中。加入50ng/mL溶菌酶，冰上孵育悬浮物 30分钟。然后18.000g离心去除球芽。上清液(周质提取物)用 200x体积PBS透析，过夜。
该表达/提取方案的典型收率为~ l-2mg Fab IZI-06.1/L培 养物。
实施例6: 纯化
基本原理用两个连续IMAC进行三步纯化方案，然后是 尺寸排阻色语法(size exclusion chromatography) (SEC)。 IZI-06.l携带C-末端myc-His-标签(见pABl,克隆策略)。第一和 第二步纯化为IMAC(固定金属离子亲和色^"法)。His-标签内的 组氨酸残基在琼脂糖基质上特异结合配体螯合的镍离子。第二 步IMAC用于浓缩产物。SEC利用EPLC以半制备方式进行 (Pharmacia, Germany).该步才艮据表观分子量分离，允许分离靶 蛋白较高分子量的集合物，以及较高和较低分子量的蛋白质和 非蛋白质污染物。特别地，错折叠和/或非加工靶蛋白质IZI-06.1 在SEC中显示较高的表观分子量，可从正确折叠的生物活性的 产物中分离。
IMAC(l): 27柱HiTrap 5 mL(樣离子螯合)(Amersham Pharmacia)。上样4x50 mL周质提取物(透析)。流速0.5-1.0 mL/min
洗涤组分25mM磷酸钠IC沖液，pH 8.0; 0.5 M NaCl; 25mM咪哇，5x体积(柱)。
洗脱25 mM石粦酸钠緩冲液pH 8.0; 0.5 M NaCl; 500 mM咪哇，
组分8x3.5 mL
IZI-06.1主要在组分2和3中洗提(图5a， 5b)。合并组分2-4并用500x体积PBS透析。所得透析液通过第二步IMAC浓缩(IMAC2)。IMAC(2):
柱HiTrap 1 mL(镍离子螯合)(Amersham Pharmacia)。上样2x3 mL从IMAC(l)透析的组分(进行两次)。流 速0.5-1.0 mL/min
洗涤组分25mM磷酸钠緩冲液，pH 8.0; 0.5 M NaCl; 25mM咪哇，5x体积(柱)。
洗脱25 mM磷酸钠緩沖液，pH 8.0; 0.5 M NaCl; 500 mM
咪哇
组分8x1.0 mLSEC/FPLC:
柱Superdex 200 (Pharmacia)
洗脱液PBS(无菌过滤)
上样200jiL组分2或3，来自IMAC(2)
流速0.25 mL/min
组分Nr. 1-5: 1 mL， Nr. 5-35: 0.5mL
IZI-06.1 Fab主要存在组分24/25中(通过生物测定的活性Fab)，少量在组分20/21中(较小活性的Fab,可能主要为错折叠蛋白质)。
实施例7: IZI-06.1 Fab的功能活性结合特征，通过等效结合研究确定结合亲和力为了确定对TNFR1的亲和力，在4°C用》丈射性标记的IZI-06.1 Fab进行饱和结合研究。利用氯胺T法用1251标记抗体。概括地说，室温下，10[ig纯化蛋白质和3.7xl()7贝克勒尔Na1251以及氯胺T在磷酸盐緩冲液(pH 7.4)中孵育。用二硫化钠(Na-disulfite)和过量Nal终止反应，利用PD1 O柱(Pharmacia)通过凝月交过滤分离标记蛋白质。收集l毫升组分。在组分2和3中洗提蛋白质，游离1251在组分7至9中检测。所得蛋白质浓度为2.7(ig/mL，放射性为120.000 cpm/ng。通过孵育恒量的带有增加数量的表达小鼠成纤维细胞的TNFRl -Fas的标记IZI-06.1 Fab来确定生物活性材料。所得双曲线用于拟合通过线性回归的单位点结合方程，并且外推的最大结合值(Bmax)表示生物活性材料的百分数(约10%)。来自该分析的数据用于计算在下述实验中所用的抗体浓度。
为了确定IZI-06.1 Fab的亲和力(KD值)，200.000个TNFRl -Fas阳性细胞在冰上孵育3小时，标记的IZI-06.1浓度增加(在150fil的总体积中2.5-50 ng)。作为结合緩冲液，使用磷酸盐緩沖盐水+2%胎牛血清+0.02% NaN3 。通过共孵育具有未标记IZI-06.1各自浓度180倍的细胞来确定非特异性结合。结合的1 "I-Fab用Y计数器确定，所得数据用于拟合单位点结合双曲线，该曲线含有饱和结合常数Kd:
结合量(Bound)^(BmaxX[IZIFab])/ ([IZIFab]十KD)数据的曲线配合适度是通过执行线性化变换来评价的，也称为斯卡查德图。所得数据显示，结合于TNFR1的IZI-06.1是饱和的和具有特异性的，表观亲和力K。 = 0.778nM。
结合特征，TNFR1选择性，通过受体区交换/删除的抗原决定部位定位和FACS分析
His-标签阳性IZI-06.1-Fab用于确定分别为TNFR1结合或TNFR1-Fas结合的特异性，还用于表征通过抗体衍生物识别出的抗原决定部位。图7 A表示间接的免疫荧光流式细胞计数术分析。相比于阴性对照，IZI-06.1-Fab阳性染色TNFR1-Fas嵌合体表达细胞(检测试剂FITC标记的His特异性抗体。已知相比于使用TNFR1特异性mab225的间接IF(图7D),相对低密度的染色的主要原因在于所用的不同的二次检测试剂(His-标签特异性检测抗体对抗小鼠Ig检测抗体))。相比于阴性对照，没有特异性结合出现于TNFR2-Fas表达细胞上，TNFR2特异性抗体80M2作为阳性对照(图7B)。没有特异性染色出现于TNFR1-Fas结构为阳性的细胞上，其中膜远端半胱氨酸富集区(CRD)已被去除(图7C)。不过，该结构易被另一TNFRl特异性mab, mab225检测出(图7D)。此外，没有特异性染色出现于表达功能性(信号活性)TNFR1 -Fas结构的细胞上，其中膜远端CRD 1已被TNFR2的置换(图7E)。再有，该受体嵌合体易一皮mab225检测出，已知其结合CRD1外侧的TNFR1 。图7C-F中所示凄t据因而允许得出此结论IZI-06.1识别TNFR1的CRD1。发明人知道，CRD1关键性地涉及到通过影响CRD2构造的TNF结合，后者连同CRD3提供其中 一种配体直接接触位点(发明人未公开出版的资料)。抑制TNF作用
检测Kym-1人4黄紋月几肉瘤(rhabdomyosarcoma)细胞系模型中纯化的IZI-06.1 Fab的拮抗活性，其为TNF高度敏感(LD50低于100pg/ml sTNF,无需抑制蛋白质合成)，通过TNFR1和TNFR2应答(后者信号途径先前显示经由NF-KB信号传导诱导内生TNF表达，随后膜凋亡自养信号传导经由TNFRl表达TNF(Grell等.，EMBO J., 1999, No. 18, p. 3034-3043))。将IZI-06.1 Fab的拮抗活性与小鼠mab H398和酶法制备的来自H398的Fab比较。图8显示通过IZI-06.1 P，ab由Kym-1细胞上细胞毒素行为介导的有效而完整的TNF阻断，与H398 Fab相比，浓度4氐两4咅至四4咅。相比于较低浓度下的单^介Fabs,如上述结果所期望的全长mab,显示较高的中和活性，可能由于二价试剂的较低解离速率(lower offrate)(较高亲和力)。重要的是，mab H398不会达到体外分析中在该灵敏度下的TNF活性完全阻断，因为在高浓度下它由拮抗剂转变为不完全激动剂。这可通过TNF R交联的剂量依赖性增加来解释，从而潜在形成配体独立性、功能性TNFR信号传导复合体(也参见Moosmayer等，Ther. Immunol" 1995, No. 2, p. 31-30)。
总之，根据本发明，其中一个惊人而想不到的关键特征是，TKFR1特异性拮抗剂IZI-06.1 Fab显示出相比于现有的相同特异性的d 、鼠F ab的更优良的TNFR1阻断活性，并优于全长mab,这是由于其完全缺乏受体交联能力，即，IZI-06.1 Fab缺乏任何固有的信号传导潜能，所以成为名副其实的TNFR1拮抗剂。
实施例8:单链IZI-06.1 Fab及其衍生物
克隆和表达scFv IZI-06.1 (VH-VL):
scFv IZI-06.1 (VH-VO是通过两步法产生的克隆入噬菌体载体pHEN2 ,引入编码的如下载体 1 5个残基接头(GGGGSGGGGSGGSAQ) (SEQ ID NO.: 13)、 N-末端pelB前导序列、C-末端myc标签、六组氨酰标签(His6)。为了可溶性表达，通过消化带有限制酶Sfil和Notl的pHEN2-scFv IZI-06.1 (VH-VL)质粒DNA，将所得片段克隆入用相同酶消化的表达载体pABl来获得scFv编码序列。表达和纯化如下进行2L 2xTY 、100!ig/mL氨千青霉素、0.1%葡萄糖，与20ml过夜培养的转化TG1接种，在37。C生长至指数期(OD6。(^0.8)。蛋白质表达通过加入l mMIPTG来诱导，在室温下让细菌再生长3小时。细胞通过离心收获，并悬浮于100ml 30 mM Tris-HCl， pH8.0, 1 mMEDTA, 20%蔗糖中。加入5mg溶菌酶后，细胞在冰上孵育15至30分钟。加入10mM Mg2S04后，纟田胞以10.OOOg在4。C下离心30分钟。上清液用PBS透析并负载于Ni-NTA柱上(Qiagen, Hiiden,Germany),该柱用50mM磷酸钠緩冲液，pH7.5, 500 mM NaCl，20 mM咪唑进行平衡。清洗后(50mM磷酸钠緩冲液，pH7.5，5 00 mM NaC 1 ， 3 5 mM咪唑)，His标记的重组抗体片段用5 0mM磷酸钠缓沖液，pH7.5， 500 mM NaCl， 100mM洗脱。合并蛋白质组分并用PBS透析。蛋白质浓度以分光光度确定并利用各蛋白质所计算的E值(E-value)进行计算。
克隆和表达scFv IZI-06.1白蛋白融合蛋白质scFv IZI-06.1 (VH-VL)人白蛋白融合蛋白质是通过如下产生的将DNA编码的来自质粒pABl的scFv IZI-06.1 (V『Vl)作为Sfil-Notl片4殳克隆入含有cDNA编码的人白蛋白的质粒pSecTagA-HAS中。质粒DNA用Lipofectamine 2000 (Invitrogen，Karlsruhe, Germany)转染入HEK293细胞中。稳定转染子通过用博莱霉素Zeocin(300[ig/ml)选择来产生。在RPMI, 5。/。FCS至900/0的汇合中扩增和生长细胞。针对蛋白质生产，细胞在Opti-MEM(Invitrogen， Karlsruhe, Germany)中培养，每三天置换培养基3-4次。合并上清液并通过石克酸铵沉淀法浓缩(60%饱和度)蛋白质，然后负载于Ni-NTA柱(Qiagen, Hilden， Germany)。通过IMAC的纯化如上所述进4亍。
权利要求
1.一种huTNFR1-配体，所述huTNFR1-配体包括具有以下的蛋白质结构(i)一种或多种人源氨基酸序列，所述人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFR1-配体的免疫原应答，以及(ii)一种或多种非人源氨基酸序列，所述非人源氨基酸序列能够选择性地结合于huTNFR1。
2. 根据权利要求l所述的huTNFRl-配体，其中所述蛋白质 结构包括人源化抗体或者其至少一个片段。
3. 根据权利要求2所述的huTNFRl-配体，其中所述至少一 个片段选自由所述片段的Fab区、scFv、基因工程或翻译后加工 的重组衍生物和所述片段的化学修饰衍生物组成的组。
4. 根据权利要求3所述的huTNFRl-配体，其中所述至少一 个片段是包含根据SEQ ID NO.: 9的氨基酸序列的scFv。
5. 根据权利要求l至4任一项所述的huTNFRl-配体，其中 所述蛋白质结构包括一种或多种互补决定区(CDRs),所述互补 决定区选自由赋予与huTNFRl结合的SEQ ID NOs: l至6或其部 分组成的组。
6. 根据权利要求l至5任一项所述的huTNFRl-配体，其中 所述蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.: 7的氨基酸序列作为重 链可变区(VH),以及根据SEQ ID NO.: 8的氨基酸序列作为轻 链可变区(VL)。
7. 根据权利要求l至6任一项所述的huTNFRl-配体，其包 括附加标签，所述附加标签允许与生物学上可接受的化合物特 异性相互作用。
8. 根据权利要求l至7任一项所述的huTNFRl-配体，所述 蛋白质结构进一步包括通过翻译后化学接合或者通过重组基因 技术非共价结合至其上或共价结合至其上的生物学上可接受的化合物。
9. 根据权利要求8所述的huTNFR1-配体，其中所述生物学上可接受化合物选自由血清蛋白组成的组。
10. 根据权利要求8或9所述的huTNFRl-配体，其中所述生物学上可接受化合物为白蛋白。
11. 根据权利要求8至10任一项所述的huTNFRl-配体，其中所述蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.: IO的带有人血清白蛋白的融合蛋白。
12. —种编码根据权利要求l至ll任一项所述的huTNFRl-配体的核酸。
13. —种载体，包括根据权利要求12所述的核酸序列。
14. 一种寄主细胞，包含根据权利要求12所述的核酸或根据权利要求13所述的载体。
15. —种药物组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求l至ll任一项所述的huTNFRl-配体，以及可选地选自由以下组成的组的一种或多种附加成分药物学可4妄受载体、药物学可接受盐、助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂，或其任何组合。
16. 根据^又利要求15所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病，优选选自多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病，以TNF/TNFR1作为致病介体的基因遗传疾病，优选选自周期性发热综合症、颌骨增大症和癌。
17. —种治疗患有选自下述的疾病的患者的方法风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、'艮性神经退行性疾病，优选选自多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病，以TNF/TNFR1作为致病介体的基因遗传疾病，优选选自周期性发热综合症、领骨增大症和癌，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求l至ll任一项所述的huTNFRl -配体给药于所需患者的步骤。
18. —种huTNFRl-配体，所述huTNFRl-配体包括具有以下的蛋白质结构(i) 一种或多种人源氨基酸序列，所述人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFRl-配体的免疫原应答，以及(ii) 一种或多种氨基酸序列，所述氨基酸序列能够选择性结合于huTNFRl ，所述huTNFRl-配体通过使用根据权利要求l至ll任一项所述的蛋白质结构作为模板进行导向选择获得。
19. 一种生产当施用于人类时具有降低的免疫原应答的huTNFRl-配体的方法，所述方法包括以下步骤(a) 提供根据权利要求1至11任 一 项所述的蛋白质结构，(b) 利用蛋白质结构的一种或多种氨基酸序列，作为模板，通过导向选择，识别 一种或多种能够选择性结合huTNFRl的人源氨基酸序列，以及(c) 构建包括在步骤(b)下识別的至少一种或多种氨基酸序列的所述配体。
20. 包括具有下述的蛋白质结构的huTNFR1-配体的用途(i) 一种或多种人源氨基酸序列，所述人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFRl-配体的免疫原应答，以及(ii) 一种或多种非人源氨基酸序列，所述非人源氨基酸序列能够选择性结合于huTNFRl,作为间质用于导向选择识别和构建另 一低免疫原huTNFRl酉己体，所述低免疫原huTNFRl-配体基本上仅包括人源氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种特异性结合人肿瘤坏死因子1型受体(huTNFR1)的配体，该配体包括能够降低在人类中配体的免疫原应答的一种或多种人源氨基酸序列，以及能够选择性结合huTNFR1的一种或多种氨基酸序列。本发明进一步涉及编码所述配体的核酸和用于治疗与huTNFR1相关的疾病的药物组合物。
文档编号C07K16/28GK101679520SQ200880009245
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月13日 优先权日2007年3月19日
发明者克劳斯·普菲岑迈尔, 彼得·谢里奇, 罗兰德·康特曼, 赛宾·明克尔 申请人:斯图加特大学