专利名称：：2,4-双酮喹啉生物碱及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种新的生物碱，具体来说涉及一种双酮喹啉生物碱及其制备方法和在抗癌、抗污损生物幼虫附着方面的应用。
背景技术：
：芸香科植物富含香豆素和生物碱，但是目前从芸香科小芸木属大菅(必'cr，W歴/a7cato历)中仅分离得到少量的咔唑类生物碱和U引哚类生物碱(参考文献KongYC,ButPPH，NgKH，LiQ，ChengKF，WatermanPG，A.oc力e瓜，1988，16:485;NakaharaK'TrakoontivakornG，AlzorekyNS,etal.，/4ric.尸。。dOe瓜，2002，50:4796-4802;MaCY,CaseRJ，WangYH，etal.，尸Ja/te，2005，71:261-267)。
发明内容本发明的目的是从大菅中分离出新的具有实用价值的双酮喹啉生物碱，另一目的是提供该生物碱的制备方法，还有一个目的是开发它的应用。我们利用色谱分离技术从大菅中分离得到新的喹啉生物碱，这种生物碱具有抗癌作用和抗污损生物幼虫附着作用，从而实现了本发明的目的。本发明的2，4一双酮喹啉生物碱，特征是其结构由下述式(1)表示其中R《H2C00CH3或CH2C0CH3。结构以式(l)表示的，R《H2C00CH3的化合物的高分辨质谱HRESI-MSm/z264.0884(C13H1405N+[M+H]+，计算值264.0872);结构以式(1)表示的，R《H2C0CH3的化合物的高分辨质谱服ESI-MSm/z248.0931(C13H1405N+[M+H]+，计算值248.0923)。以式(1)表示的化合物的氢谱CH-腿R)数据和碳谱("C-醒R)数据见表1，这些数据都是以四甲基硅烷(TMS)为内标，分别在500MHz和125MHz的核磁共振仪上测定，溶剂都是CDCl3，化学位移以ppm为单位，耦合常数/，单位为Hz。根据力-顧R谱数据，结构以式(l)表示，其R《H2C00CH3的化合物有一个ABCD苯环系统(SH7.98(dd，/=7.6，1.4Hz)，7.23(t,/=7.5Hz),7.67(dd，/=7.8，1.5Hz)，7.17(t，/=8.3Hz))，两个甲基(SH3.49(s，N_CH3),3.62(s，0CH3))和一个亚甲基(SH2.98(2H，式(l)dd，/=18.7，14.6Hz))，13C-匿(DEPT)表明该化合物具有两个甲基(Sc30.5(N-CH3)，52,3(OCH3))，一个亚甲基(Sc43.8),四个次甲基(Sc128.6，123.9,136.4，115.2)和六个季碳(Sc170.5，78.4，192.9,120.4，142.5,169.1)。在HMBC谱中，SH3.49(s,N-CH3)和Sc170.5(C-2)，115.2(C-8)与142.5(C-IO)，SH4.19(s,OH)和Sc170.5(C_2)与192.9(C-4)的相关性表明该化合物是2，4-双酮喹啉生物碱，从亚甲基SH2.98(H-1')和Sc169.1(C-2')，170.5(C-2)'78.4(C_3)与192.9(C-4)'甲基SH3.62(s,0CH3)和169.1(C-2')的相关性可以推断出，具有乙酸基甲酯且位于C-3的位置。将结构以式(l)表示的，R《H2C0CH3的化合物的^-丽R和"C-NMR(DEPT)数据与上述I^CH2C00CH3的化合物比较，证实这两个化合物都是2，4-二酮喹啉生物碱，只是支链不同。在R《H2C0CH3的化合物的HMBC谱中，SH3.22(dd，,15.9，25.0Hz，H-l')和5c206.1(C-2'),170.7(C-2),77.0(C-3)与193.0(C-4)，SH2.10(3H，s，H-3')禾口Sc51.1(C-1')与206.1(C-2')的相关性表明化合物具有丙酮基而且位于C-3的位置。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(1)将大菅(必'Ci^历eJ鹏Z^cM，)切碎，用乙醇提取，提取液浓縮得到粗提取物；(2)将步骤(l)得到的粗提取物悬浮于水，用乙酸乙酯萃取，将得到的乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以石油醚-丙酮溶剂系统作为洗脱液，体积比从9:1到3:7进行梯度洗脱，将体积比7:3梯度的馏分点板，进行薄层层析分析，以体积比为10:1的氯仿-丙酮溶剂系统作为展开液，将比移值为0.600.70的流分和比移值为0.450.55的流分分别合并，把前者脱去色素，得到式(1)表示的，其中R《H2C00CH3的化合物，把后者纯化得到式(1)表示的，其中R《H2COCH3的化合物。步骤(l)所述的浓縮可以采用常规的方法例如减压浓缩等。步骤(2)所述的脱去色素可采用常规的方法如凝胶色谱柱等，并以甲醇为洗脱溶剂，所述的纯化可以采用高压液相色谱，其条件是色谱管尺寸是50mmx10mm,毛细管5戶,流动相甲醇水为体积比45:55。实验结果式(1)表示的，其中R《H2C00CH3和R《H2C0CH3的化合物，对海虾的平均LDs。值分别为143.22ug/mL和354.99ug/mL，对藤壶幼虫平均抗附着活性浓度IC5。分别是13.14ug/mL和121.48ug/mL;式(l)表示的，其中R《H2C00CH3的化合物，对乳腺癌细胞的平均半数抑制率IC5。为357.21"g/mL，式(l)表示的，其中R《H2COCH3的化合物对乳腺癌细胞的平均半数抑制率ICs。为65.74yg/mL。实验结果证明本发明的2，4一双酮喹啉生物碱可用于抗污损生物幼虫附着和用于制备抗癌药物。本发明操作简单，得到的喹啉生物碱的生物毒性较低，能有效地抗癌，及抗污损生物幼虫附着，因而具有良好的应用前景。具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例l:式(l)化合物的制备以10kg大菅为原料，切碎后分别用95%和50%的热乙醇提取，将提取液浓缩，合并粗提取物。将粗提取物悬溶于2000mL水中，用乙酸乙酯萃取4次，得到乙酸乙酯萃取物113g，将乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析(高1.5m，直径10cm的玻璃柱)，以石油醚-丙酮溶剂系统为洗脱液，从体积比9:1到3:7进行梯度洗脱，将体积比7:3梯度的馏分点板，进行TLC(GF^)分析，以体积比为10:1的氯仿-丙酮溶剂系统为展开液，将乾值约为0.65和/f值约为0.5的流分分别合并，A值约为0.65的流分再用凝胶S印hadexLH-20(给分离条件等参数)除色素，溶剂甲醇冲洗，得到化合物l共4.0mg，外观为无色油状，根据上述的结构分析证实其结构用式(l)表示，其中R《H2COOCH3，分子式为<:13!11305化化学名称是3-羟基-3-乙酸甲酯-N-甲基-2，4-二酮喹啉(3-hydroxy-N-methyl-2,4-quinoldione-3-methylacetate);A值约为O.5的流分用高压液相色谱(250mmx10咖，i.d.5//m,MeOH/H20,45:55)纯化，得到化合物2共86.7mg，外观为无色油状，根据上述的结构分析证实其结构用式(l)表示，其中R《H2C0CH3，分子式为C13H1304N，化学名称是3-羟基-3-丙酮基-N-甲基-2，4-二酮喹啉(3-hydroxy-3-aGetonyl"N-methyl—2，4-quinoldione)。实施例2:细胞毒活性试验一海虾生物致死法取海虾卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24h，除去卵壳及未孵化的卵，海虾幼虫继续培养24h，备用。依照Solis的改良法，取96孔细胞培养板，每孔加200nL含1015个海虾幼虫的人工海水液，制成测试培养板。设置一个空白对照组和两个样品组，其中每组各设三个平行孔，在空白对照组加5uL二甲基亚砜溶液(DMSO)，样品组1加入实施例1得到的化合物1，样品组2加入实施例1得到的的化合物2，使两个样品组中三个平行孔的终浓度分别为500ug/mL、50wg/mL、5wg/mL,室温培养24h后，在双目解剖镜下检测计数海虾死亡个体数目。海虾生物致死活性用校正死亡率表示，按下列公式计算校正死亡率=(对照组存活率一处理组存活率)/对照组存活率X100X。并将校正死亡率输入SPSS计算软件，计算LCs。。结果得出，化合物1的平均LD5。值为143.22ug/mL;化合物2的平均LD5。值为354.99ug/mL。实施例3:噻唑蓝(MTT)法测试化合物抗乳腺癌的活性试验收集HNNY-LQ-8601乳腺癌细胞，接种100uL于96孔板中，每孔细胞数大约为l.OX105个，孔板放入C02培养箱中培养24小时。加入10倍稀释的，实施例l得到的化合物lIOOpL，取3个平行，培养24小时，阴性对照不加药物。再吸出培养液，每孔加完全培养基150uL和浓度2mg/mL的MTT50uL,培养4小时后吸出液体，力口DMS0150iiL，振荡10min，酶标仪490nm下测定结果。计算细胞生长抑制率，计算公式如下生长抑制率W)二[(A,—A^)/(A,—A扣)]X100%。再利用SPSS软件计算，得出结构用式(l)表示的，R《H2C00CH3的化合物对乳腺癌细胞的平均半数抑制率IC5。为357.21yg/mL。实施例4:MTT法测试化合物抗肺癌的活性试验收集HNNY-LQ-8602肺癌细胞，接种100uL于96孔板中，每孔细胞数大约为l.OX105个,孔板放入C02培养箱中培养24小时。加入10倍稀释的，实施例1得到的化合物2100uL，取3个平行，培养24小时，阴性对照不加药物。再吸出培养液，每孔加完全培养基150yL和浓度2mg/raL的MTT50uL，培养4小时后吸出液体，加DMS0150uL，振荡10min，酶标仪490nm下测定结果。按照实施例3的方法计算细胞生长抑制率，再利用SPSS软件计算，得出结构用式(l)表示的，R《H2C0CH3的化合物对乳腺癌细胞的平均半数抑制率IC5。为65.74ug/mL。实施例6:抗污损生物幼虫的附着活性采用24孔板分别测定实施例1得到的两种化合物的抗藤壶幼虫的附着活性。每个板孔中加入lmL含有1015个成熟的藤壶幼虫的培养液，将实施例1得到的两种化合物分别溶于DMS0，然后用灭菌海水稀释成浓度IOOug/mL,10iig/mL，1.0ug/mL和0.1ug/mL。每个浓度3个平行，并以无菌海水做空白对照。将培养板置于室温下培养24小时，在解剖镜下统计附着的幼虫数，用SPSS程序进行统计分析。统计结果显示，化合物l在浓度100ug/mL,10ug/mL，L0g/mL和0.1yg/mL时对藤壶幼虫的平均附着率分别是17.2%，28.1%，55.6%，60.0%;化合物2在浓度100ug/mL,10ixg/mL，1.0yg/mL和0.1ug/mL时对藤壶幼虫的平均附着率分别是32.7%，45.9%，53.3%，60.0%，空白对照组对藤壶幼虫的平均附着率为63.6%。根据幼虫附着抑制率=(空白对照一附着率)/空白对照X100。/。的公式计算化合物的抗幼虫附着活性，得出化合物l的抗幼虫附着活性浓度ICs。是13.14ug/mL，化合物2的平均抗幼虫附着活性浓度ICs。是121.48yg/mL。权利要求1.下述式(1)表示的化合物式(1)其中R＝CH2COOCH3或CH2COCH3。2.权利要求l所述化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1)将大菅(Mcr溯e化历/^cato历)切碎，用乙醇提取，提取液浓縮得到粗提取物；(2)将步骤(l)得到的粗提取物悬浮于水，用乙酸乙酯萃取，将得到的乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以石油醚-丙酮溶剂系统作为洗脱液，从体积比9:1到3:7进行梯度洗脱，将体积比7:3梯度的馏分点板，进行薄层层析分析，以体积比为10:l的氯仿-丙酮溶剂系统作为展开液，将比移值为0.600.70的流分和比移值为0.450.55的流分分别合并，把前者脱去色素，得到式(1)表示，其中R《H2C00CH3的化合物，把后者纯化得到式(1)表示的，其中R《H2C0CH3的化合物。3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征是步骤(l)所述的浓縮是减压浓縮，步骤(2)所述的脱去色素采用凝胶色谱柱，并以甲醇为洗脱溶剂，所述的纯化采用高压液相色谱，其条件是色谱管尺寸是50mmx10mra，毛细管5戶，流动相甲醇水为体积比45:55。4.权利要求l所述的化合物在抗污损生物幼虫附着中的应用。5.权利要求l所述的化合物在制备抗癌药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种新的双酮喹啉生物碱及其制备方法和应用，其结构用式(1)表示，其中R＝CH<sub>2</sub>COOCH<sub>3</sub>或CH<sub>2</sub>COCH<sub>3</sub>，并通过将大菅(Micromelumfalcatum)用乙醇提取后的粗提取物用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，用体积比从9∶1到3∶7的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，将7∶3梯度的馏分点板，用体积比为10∶1的氯仿-丙酮溶剂系统进行薄层层析分析，将比移值为0.60～0.70和0.45～0.55的流分分别合并，把前者脱去色素，得到式(1)表示的，其中R＝CH<sub>2</sub>COOCH<sub>3</sub>的化合物，把后者纯化得到式(1)表示的，其中R＝CH<sub>2</sub>COCH<sub>3</sub>的化合物。本发明化合物生物毒性较低，可用于抗污损生物幼虫附着及制备抗癌药物。文档编号C07D215/00GK101429158SQ200810219869公开日2009年5月13日申请日期2008年12月11日优先权日2008年12月11日发明者浩尹,偲张,漆淑华,罗雄明申请人:中国科学院南海海洋研究所