专利名称：猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的分离纯化制备方法
技术领域：
发明涉及一种鹅去氧胆酸(3 α，7 α —二羟基一5 β 一胆甾烷酸)的分离纯化制备方法，主要涉及从家禽及动物胆汁，特别是猪胆膏(汁)或下脚料(提取胆红素或猪去氧胆 酸之后的下脚料)中提取，以及分离纯化鹅去氧胆酸的制备方法。
背景技术：
鹅去氧胆酸(3α，7α—二羟基一5日一胆甾烷酸)0^110如0”(^01丨(^(^(1(简称 ⑶CA)，1824年首次发现在鹅胆汁中，1924年，wieland和windaus在不同的胆(人和鹅)中 发现了鹅去氧胆酸，它是一种最易溶的胆汁酸，被命名为鹅去氧胆酸。鹅去氧胆酸具有平喘化痰镇咳和抗炎的作用，其利胆作用尤为显著，它是通过减 少胆固醇的吸收，合成，使胆汁内胆固醇下降，从而阻抑胆固醇结石形成和促其溶解，并且 能有效降低胆固醇饱和度。鹅去氧胆酸还作为制取熊去氧胆酸(3α，7β—二羟基一5β—胆甾烷酸，简称 UDCA)的中间体。熊去氧胆酸是名贵中药熊胆所含的主要成分，在临床上用于治疗各种胆疾 及消化道疾病。目前，传统名贵药用动物胆汁非常紧缺，寻找有开发前景的药用动物胆汁和 人工合成品为热门研究项目。进一步发掘动物胆汁的药用价值，分析动物胆汁的药用成分 并揭示其作用机理，使动物胆汁得到综合开发利用。因此，制备鹅去氧胆酸对于进一步制备 熊去氧胆酸也具有很重要的意义。鹅去氧胆酸主要有家禽的胆汁或动物胆汁中提取，由于家禽，特别是鹅的胆汁量 少而不容易收集，人们就转向了猪胆汁，特别是提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚料中 提取。传统的提取制备工艺过程复杂，收率低，特别是纯度上不去，还不到98% (HPLC)，其 它物质(猪去氧胆酸，石胆酸偏高)含量不能满足临床需求；并且使用大量不安全的有机溶 剂。工艺主要分以下几类1.以中科院上海有机化学所周维善院士为代表的硅胶柱层析法。《医药工业》， 1988，19(12) 529-30 ；2.以沈阳化工学院和周维善院士为代表的合成法，(中国专利CN1869043A等)3.以山东博尔德生物公司为代表的大孔树脂法(中国专利CN1775798A)4.以常德云港生物公司为代表的钡盐，钙盐法(中国专利CN1830996A， CN1869044A 等)5.以美国专利 USP4213911. 4022806. 4163017. 4316849 等为代表的精制工艺。由于受原料产地，工业化生产条件，环境要求，特别是工艺技术的成熟度导致了鹅 去氧胆酸的提取，分离纯化困难，工业化生产不能达标上量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于大规模工业制备高纯度鹅去氧胆酸的方法，回避了现有技术的缺陷。采用安全低毒，简单实用的方法得到含量大于等于98% (HPLC法，高效 液相检测)，猪去氧胆酸<0.5%，石胆酸<0. 的鹅去氧胆酸(⑶CA).发明的目的是通过以下技术方案实现的1.皂化处理；2.氧化处理；3.澄清处理；4.猪去氧胆酸粗品的制备；5.下脚料的收取，氧化及澄清处理；6. 一次钙盐；7. 二次钙盐；8.大孔树脂吸附；9.精制得到高纯度的鹅去氧胆酸(⑶CA)，含量大于等于98% (HPLC)，其它物质 猪去氧胆酸 HDCA<0. 5 % (HPLC)，石胆酸 LCA<0. 1 %。详细工艺如下(1)皂化.10% —15% NaOH，温度 100— 120°C。时间 18 — 26 小时；(2)氧化，工业 双氧水0. 5—2%，以达到类白色为准；(3)澄清，用1+1天然澄清剂0. 5—5/万，温度80— IOO0C,PH9—14,0. 5—2小时，板框压滤得澄清滤液；(4)用稀盐酸调PH2—3，得粗胆酸，用 乙酸乙酯8倍溶解，活性碳1倍，回流2小时，将滤液浓缩到1/5结晶，得猪去氧胆酸。用乙 酸乙酯重结晶得熔点198°C以上的猪去氧胆酸(HDCA) ； (5)将二次猪去氧胆酸的乙酸乙酯 回收完毕，剩下黑褐色的胆膏状物，加双氧水氧化，1+1天然澄清剂澄清，得澄清滤液；(6) 一次钙盐；加入黑褐色的胆膏状物1倍量工业氯化钙(含量高效液相色谱检测为要求。克 分子比鹅去氧胆酸氯化钙=1 1. 1)温度60—80°C，时间2小时，板框压滤之后加入碳酸 钠置换鹅去氧胆酸，加入克分子比为氯化钙的1. 1，温度90—100°C，时间1一3小时；(7) 二 次钙盐，以(6)的比列，工艺条件成钙盐后，用300—1000倍的去离子水洗涤，毕，调PH2. 0— 3. 5得粗品鹅去氧胆酸；⑶粗品鹅去氧胆酸溶于碱水，PH6. 0-8. 0，上弱碱性或强碱性大 孔树脂吸附饱和后，水洗除去杂质，稀碱液解析，以薄层层析来判断接收的起始点，终止点， 调PH3真空干燥；(9)将鹅去氧胆酸溶于乙腈混合溶剂回流2小时，加入活性碳10%，热滤， 结晶。重结晶得鹅去氧胆酸精品含量大于等于98% (HPLC)，含猪去氧胆酸<0.5% (HPLC)， 石胆酸<0. 1%，薄层层析(TLC)一个鹅去氧胆酸主斑点，一个较轻微的猪去氧胆酸斑点。本发明的优点与效果整个工艺具有操作简便，安全，成本低廉，易于工业化生产，易于得到高纯度的 鹅去氧胆酸，含量大于等于98% (HPLC)，含猪去氧胆酸<0.5% (HPLC)，石胆酸<0. (HPLC)。
图1，为提取猪去氧胆酸后下脚料的高效液相色谱图<23.67 % >.采集日期 和时间2007-6-15 14:11 32 ；用户名=Admin ；样品名称供试品；注入量20 μ 1 ；方 法文件名C:\ChromatoSolution-Light\Data\Projectl\ 无标题.gem ；报告名C:\ ChromatoSolution-Light\Sample\模版 . gcr ； 保存路径 :D \Data\pro ject 1 \CDCA\ 12.gcd ；使用仪器类型液相色谱；梯度方式恒流；仪器型号LC-10ATvp ；检测器紫外；柱温 (°C ) 40 ；波长(nm) 205 ；柱型号:C18图2，为鹅去氧胆酸成品高效液相色谱图<98. 80% >.采集日期和时间2007-6_27 21:30:53 ；用户名Admin ；样品名称CDCA ；注入量20 μ 1 ；方法文件名C:\Chromato So Iut ion-Li ght\Data\Projectl\ 无标题.gem ； 艮告名:C: \Chromato Solution-Light\ Sample\模板.gcr ；保存路径D: \Data\projectl\CDCA\17. gcd ；使用仪器类型液相色谱； 梯度方式恒流；仪器型号=LC-IOATvp ；检测器紫外；柱温(°C ) 40 ；波长(nm) 205 ；柱型 号:C18
图3，为鹅去氧胆酸成品高效液相色谱图<98.50% >.采集日期和时间2007-6-27 20:22:43 ；用户名Admin ；样品名称:CDCA ；注入量20 μ 1 ；方法文件名:C:\Chromato So Iut ion-Li ght\Data\Projectl\ 无标题.gem ； 艮告名:C: \Chromato Solution-Light\ Sample\模板.gcr ；保存路径D: \Data\projectl\CDCA\14. gcd ；使用仪器类型液相色谱； 梯度方式恒流；仪器型号=LC-IOATvp ；检测器紫外；柱温(°C ) 40 ；波长(nm) 205 ；柱型 号:C18
具体实施例方式1.在分离鹅去氧胆酸过程中，皂化12% NaOH，温度110°C，时间24小时；氧化双氧 水用量1.5%，澄清剂用量5/万，温度100°C，PH10，时间1小时，结晶PH3，得到粗胆酸。用 乙酸乙酯重结晶得到高熔点的猪去氧胆酸(198°C以上)。2回收乙酸乙酯后的黑褐色膏状物，需进一步氧化，澄清，双氧水用量1.0% — 3.0%，澄清剂用量0. 5—5/万。3. 一次钙盐氯化钙温度为65°C，时间2小时，加入量克分子比为1 :1. 1，以高效液 相色谱检测计算，鹅去氧胆酸氯化钙=1 :1. 1.加入碳酸钠温度95°c，时间2小时，加入量 克分子比为1 :1. 05，以加入氯化钙计算。4. 二次钙盐，同一次钙盐工艺，成钙盐后用500倍量去离子水水洗，至钙盐水溶液 中无粗鹅去氧胆酸为止，调PH3. 0。5.鹅去氧胆酸溶解后，上弱碱性或强碱性大孔树脂吸附，鹅去氧胆酸母液PH为 6. 5o6.鹅去氧胆酸中，用稀碱液解析时，用薄层层析来判断接收的起始点，终止点。7.精制时，活性炭加入量为鹅去氧胆酸10%。回流2小时。8.根据薄层层析的杂质斑点情况可有选择的选择溶剂来结晶，以去除杂质胆酸， 使其鹅去氧胆酸大于等于98% (HPLC)猪去氧胆酸<0.5% (HPLC)，石胆酸<0. 1%。9.在提取纯化鹅去氧胆酸过程中，原料可以是禽类胆汁胆膏，可以是动物类胆汁 胆膏或是其提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚料，前提是不变质，霉变。
权利要求
一种鹅去氧胆酸(3α，7α—二羟基—5β—胆甾烷酸，CDCA)的制备方法，其特征是，所用的原料为家禽及动物胆汁，胆膏或其提取胆红素，猪去氧胆酸之后的下脚料，包括以下步骤(1)皂化.10％—15％NaOH，温度100—120℃。时间18—26小时；(2)氧化，工业双氧水0.5—2％，以达到类白色为准；(3)澄清，用1+1天然澄清剂0.5—5/万，温度80—100℃，PH9—14，0.5—2小时，板框压滤得澄清滤液；(4)用稀盐酸调PH2—3，得粗胆酸，用乙酸乙酯8倍溶解，活性碳1倍，回流2小时，将滤液浓缩到1/5结晶，得猪去氧胆酸。用乙酸乙酯重结晶得熔点198℃以上的猪去氧胆酸(HDCA)；(5)将二次猪去氧胆酸的乙酸乙酯回收完毕，剩下黑褐色的胆膏状物，加双氧水氧化，1+1天然澄清剂澄清，得澄清滤液；(6)一次钙盐；加入黑褐色的胆膏状物1倍量工业氯化钙(含量高效液相色谱检测为要求。克分子比鹅去氧胆酸氯化钙＝11.1)温度60—80℃，时间2小时，板框压滤之后加入碳酸钠置换鹅去氧胆酸，加入克分子比为氯化钙的1.1温度90—100℃，时间1—3小时；(7)二次钙盐，以(6)的比列，工艺条件成钙盐后，用300—1000倍的去离子水洗涤，毕，调PH2.0—3.5得粗品鹅去氧胆酸；(8)粗品鹅去氧胆酸溶于碱水PH6.0—8.0上弱碱性或强碱性大孔树脂吸附饱和后，水洗除去杂质，稀碱液解析，以薄层层析来判断接收的起始点，终止点。调PH3真空干燥；(9)将鹅去氧胆酸溶于乙腈混合溶剂回流2小时，加入活性碳10％，热滤，结晶。重结晶得鹅去氧胆酸精品含量大于等于98％(HPLC)，含猪去氧胆酸<0.5％(HPLC)，石胆酸<0.1％，薄层层析(TLC)一个鹅去氧胆酸主斑点，一个较轻微的猪去氧胆酸斑点。
2.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，在分离鹅去氧胆酸过程中，皂化12% NaOH，温度110°C，时间24小时；氧化双氧水用量1. 5 %，澄清剂用量5/万，温度100°C， PH10，时间1小时，结晶PH3，得到粗胆酸。用乙酸乙酯重结晶得到高熔点的猪去氧胆酸 (198°C 以上)。
3.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，在提取分离鹅去氧胆酸过程中，回收 乙酸乙酯后的黑褐色膏状物，需进一步氧化，澄清，双氧水用量1.0%—3.0%，澄清剂用量 0. 5—5/万。
4.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，在提取分离鹅去氧胆酸过程中，一次钙 盐氯化钙温度为65°C，时间2小时，加入量克分子比为1 :1. 1，以高效液相色谱检测计算，鹅 去氧胆酸氯化钙=1 :1. 1.加入碳酸钠温度95°C，时间2小时，加入量克分子比为1 :1. 05， 以加入氯化钙计算。
5.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，二次钙盐，同一次钙盐工艺，成钙盐后 用500倍量去离子水水洗，至钙盐水溶液中无粗鹅去氧胆酸为止，调PH3. 0。
6.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，鹅去氧胆酸溶解后，上弱碱性或强碱性 大孔树脂吸附，鹅去氧胆酸母液PH为6. 5。
7.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，鹅去氧胆酸中，用稀碱液解析时，用薄 层层析来判断接收的起始点，终止点。
8.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，精制时，活性炭加入量为鹅去氧胆酸 10%。回流2小时。
9.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，根据薄层层析的杂质斑点情况可有选 择的选择溶剂来结晶，以去除杂质胆酸，使其鹅去氧胆酸大于等于98% (HPLC)猪去氧胆酸 <0. 5 % (HPLC)，石胆酸 <0.1%。
10.根据权利要求1叙述的制备方法，其特征是，在提取纯化鹅去氧胆酸过程中，原料 可以是禽类胆汁胆膏，可以是动物类胆汁胆膏或是其提取胆红素或猪去氧胆酸之后的下脚 料，前提是不变质，霉变。
全文摘要
一种猪胆膏或下脚料中鹅去氧胆酸的分离纯化制备方法，涉及从家禽及动物胆汁或提取胆红素猪去氧胆酸的废弃下脚料中提取纯化鹅去氧胆酸的工业制备方法。其过程是皂化，氧化脱色，澄清处理，制备一次钙盐，二次钙盐，大孔吸附树脂吸附，解析结晶，精制等生产工艺。整个工艺具有环境友好，安全无毒，成本低廉，易于工业规模化生产鹅去氧胆酸。含量大于等于98％，高效液相色谱检测。其它物质猪去氧胆酸含量<0.5％，石胆酸<0.1％。薄层层析一个鹅去氧胆酸主斑点，一个较轻微的猪去氧胆酸斑点。
文档编号C07J9/00GK101830956SQ20081017680
公开日2010年9月15日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者于露, 付常清, 付焕全, 吴紫梦, 吴茂芝, 曹雪松, 毕小升, 毕思宾 申请人:毕小升;毕思宾