专利名称：一种抗猪细小病病毒的转移因子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药物及其制剂领域，更具体地说，是涉及一种抗猪细小病病毒的转移
因子及其制备方法。
背景技术：
猪细小病病毒病(porcine parvovirus infection,PPI)又称猪繁殖障碍病。是由猪细小病病毒引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。
各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。传染源主要来自感染细小病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒能通过胎盘垂直传播，感染母猪所产的死胎、仔猪及子宫内的排泄物中均含有很高滴度的病毒，而带毒猪所产的活猪可能带毒排毒时间很长甚至终生。。感染种公猪也是该病最危险的传染源，可在公猪的精液、精索、附睾、性腺中分离到病毒，种公猪通过配种传染给易感母猪，并使该病传播扩散。
污染的猪舍是猪细小病病毒的主要储藏所。在病猪移出、空圈4. 5个月，经彻底清扫后，再放进易感猪，仍可被感染。污染的食物及猪的唾液等均能长久地存在传染性。
仔猪、胚胎、胎猪通过感染母猪发生垂直感染；公猪、肥育猪和母猪主要是经污染的饲料、环境经呼吸道、生殖道或消化道感染；初产母猪的感染多数是经与带毒公猪配种时发生的；鼠类也能传播本病。 该病具有很高的感染性，易感的健康猪群_旦病毒传入，3个月内几乎可导致猪群100%感染；感染群的猪只，较长时间保持血清学反应阳性。该病多发生于春、夏季节或母猪产仔和交配季节。母猪怀孕早期感染时，胚胎、胎猪死亡率可高达80% 100%。母猪在怀孕期的前30 40天最易感染，孕期不同时间感染分别会造成死胎、流产、木乃伊、产弱仔猪和母猪久配不孕等不同症状。病毒的感染率与动物年龄呈正比。 病变主要在胎儿，可见感染胎儿充血、水肿、出血、体腔积液、脱水(木乃伊化)及
坏死等病变。 该病目前尚无有效治疗方法，主要采取预防措施。可对种猪，特别是后备种猪进行疫苗接种预防该病。 尽管目前市场上有一些抗猪细小病的临床用药，但是现有药剂的争对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是发病后采用的，不能起到预防的作用。对于易感染猪细小病的猪群。每年定期的对猪接种猪细小病病毒疫苗是预防猪细小病的有效方法，其次应增强营养或药物干预，提高自身免疫力，通过药物提高机体抵抗力或免疫力也是一种预防猪细小病的有效方法。 转移因子(TF， Transfer Factor)是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。自美国著名的免疫学专家Lawrence发现和研究转移因子以来，世界各国不但进行了许多理论研究，而且进行了大量的临床应用研究，使得转移因子成为目前应用广泛的增强免疫制剂。 目前已报道的提取的转移因子大多数都是关于非特异性转移因子的制备方法。本发明采用病毒免疫抗原的方法提取特异性的转移因子，提取方法在已报道的传统方法基础上加以改进，縮短生产时间，简化生产工艺。 采用特殊的病毒免疫抗原提取抗猪细小病病毒的转移因子，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效的抗猪细小病病毒的转移因子及其制备方法。 本发明的第一个目的是提供一种简单有效的抗猪细小病转移因子的制备方法，步骤包括 (1)先用注射用水洗净用猪细小病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗； (2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1 2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1000 3000rpm捣碎3 5次，每次3 5min，制得猪脾匀浆液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5 10min ; (4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HC1调pH5. 0 6. 0或者加入0. 1 0. 3%柠檬酸，4°C ， 3000 8000rpm离心10 30min，收集上清液； (5)上清液用O. 2iim中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液； (6)将超滤得到的滤液用0. 22 ii m滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪细小病病毒转
移因子原液，4t:保存。 在具体实施方案中，实施上述步骤之前，步骤还包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪的步骤。这些步骤，可选用常规技术实施。其中，所述的制备病毒抗原步骤，优选将猪细小病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液30 4(TC培养24 72h。取鸡胚尿囊液，-2(TC反复冻融4 8次，3000 8000rpm离心10 30min，弃去沉淀收集上清液。其中，猪细小病病毒株选自本申请人保藏的中国经典毒株PPV(Genbank accessionN0.AY583318)或PPV-II(Genbank accession NO. AB076669)。 所述的提取病毒抗原步骤，优选上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10% 80%， 150000 200000rpm离心2 4小时，根据猪细小病病毒分子量确定猪细小病病毒所在离心管的位置，吸出备用； 所述的病毒抗原免疫猪步骤，优选挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3 5次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7 10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20°C保存，备用。 本发明的第二个目的在于提供通过上述方法所制备的转移因子。 在一个优选实施方案中，上述方法使用的猪细小病病毒株选自本申请人保藏的
4中国经典毒株PPV(Genbank accession NO. AY583318)或PPV—II(Genbank accessionNO. AB076669)。 由于转移因子是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，目前并没有明确的组分或结构，制备方法或所用病毒株的不同，所得的转移因子也会差异，因此通常在生产过程中是通过限定制备方法和所用病毒株来明确转移因子。在本发明中，由于限定了具体的制备方法和特异的病毒株，因此所得到的转移因子具有组分稳定、纯度高、活性好等特点，具有很好的应用前景。 本发明的一种抗猪细小病病毒的转移因子及其制备方法，具有以下优点
1、猪脾脏属于屠宰场的下脚料，原料来源容易； 2、组织经组织捣碎机捣碎后，采用大功率的超声波设备处理，縮短反复冻融时间，
而且也避免了因高压均质机破壁处理时由于筋膜的存在而堵塞高压均质机； 3、离心前用稀盐酸调节pH，使大部分蛋白絮凝，使得离心后的上清液的澄清度明
显好于以前的方法；而且有利用后续的微滤、超滤操作； 4、在匀浆液中加入0. 1 0. 3%柠檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，简化后面的离心处理； 5、本发明既可基于前期的常规病毒抗原免疫步骤，又可优选本发明的免疫步骤，具有灵活高效的优点。 6、所述转移因子的提取方法，显著地縮短了生产时间，简化了生产工艺。 7、提取物经体外生物活性试验及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性起
效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可
增强抗病能力。该提取物可做成口服、注射、喷雾等剂型，便于使用。 8、本发明所用的病毒株，属于申请人保藏的中国经典毒株PPV(Genbankaccession NO. AY583318)或PPV-II (Genbank accession NO. AB076669)，与常规蓝耳病毒株相比，具有更高的免疫原性，因而采用该病毒株免疫抗原的方法所提取的转移因子，包含特异性好和纯度高的低分子肽与核苷酸复合物，其活性水平明显优于常规方法和常规病毒株所制备的转移因子。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1 : 抗猪细小病病毒转移因子的制备 1、将猪细小病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液37t:培养48h。取鸡胚尿囊液，-2(TC反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10%、20%、30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、80 % ， 150000rpm离心4小时，根据猪细小病病毒分子量确定猪细小病病毒所在离心管的位置，吸出备用； 3、得到的猪细小病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰
5杀猪，取脾脏于-2(TC保存，备用； 4、从得到的猪脾脏提取抗猪细小病病毒转移因子 (1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机2000rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀桨液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5min ; (4)将(3)中得到的匀浆液用HC1调pH5. 0， 4°C ， 5000rpm离心30min，收集上清液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纤维柱微滤，收集滤出液； (6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0. 22 m滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4t:保存，即得到抗猪细小病病毒转移因子原液。
实施例2: 抗猪细小病病毒转移因子的制备 1、将猪细小病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液37t:培养72h。取鸡胚尿囊液，-2(TC反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为15%、30%、45% 、60% 、75% ， 180000rpm离心3小时，根据猪细小病病毒分子量确定猪细小病病毒所在离心管的位置，吸出备用； 3、得到的猪细小病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫IO天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-2(TC保存，备用； 4、从得到的猪脾脏提取抗猪细小病病毒转移因子 (1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1500rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀桨液；
(3)猪脾匀桨液用超声波(4KW、3KHz)处理10min ; (4)将(3)中得到的匀桨液用加入O. lX柠檬酸，混匀，4。C，6000rpm离心30min，收集上清液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纤维柱微滤，收集滤出液； (6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0. 22 ii m滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4t:保存，即得到抗猪细小病病毒转移因子原液。
实施例3 : 对本发明所述工艺制备的抗猪细小病病毒转移因子的检测 对实施例1、2所述工艺制备的抗猪细小病病毒转移因子进行以下检测 1、紫外分光光度测定上述所得样品在252士2nm处有一吸收峰，且ABS26。/ABS28。
> 2. 0。
2、标准液为淡黄色，pH值在6. 0 8. 0之间。 3、细菌学检验上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。 4、20%磺基水杨酸检测上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均成阴
性，其不含大分子蛋白质。 5、核酸含量测定上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为667. 56 y g/mL、648. 76ii g/mL。 6、多肽含量测定上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为7. 58mg/mL、7. 35mg/mL。 7、转移因子活性测定根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰花结的百分率分别为31. 7%、30. 4%，比对照组分别增加20. 9%、19. 6% (P《0. 01)。 8、过敏性、毒性试验取健康小白鼠IO只，雌雄各半，口服本品浓縮液，相当于正常口服剂量的100倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结果无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。 9、用猪细小病病毒抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。 通过上述实施例，我们发现所提取的抗猪细小病转移因子可以全面抑制猪细小病病毒，能保护正常机体细胞免受猪细小病病毒的感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防猪细小病、保护正常机体细胞免受猪细小病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪细小病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
权利要求
一种抗猪细小病病毒的转移因子的制备方法，步骤包括(1)先用注射用水洗净用猪细小病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆液；(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪细小病病毒转移因子原液，4℃保存。
2. 权利要求1所述的方法，其中在实施上述步骤之前，还包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪等步骤。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述的制备病毒抗原步骤，包括将猪细小病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液30 4(TC培养24 72h。取鸡胚尿囊液，_201:反复冻融4 8次，3000 8000rpm离心10 30min，弃去沉淀收集上清液。
4. 权利要求2所述的方法，其中所述的提取病毒抗原步骤，包括上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10 % 80%， 150000 200000rpm离心2 4小时，根据猪细小病病毒分子量确定猪细小病病毒所在离心管的位置，吸出备用。
5.权利要求2所述的方法，其中所述的病毒抗原免疫猪步骤，包括挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3 5次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7 10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20°C保存，备用。
6. 权利要求1或2所述的方法，其中猪细小病病毒株选自本申请人保藏的中国经典毒株PPV(Genbank accession N0.AY583318)或PPV-II (Genbank accession NO. AB076669)。
7. 权利要求1至6的方法所制备的转移因子。
全文摘要
本发明公开了一种天然高效抗猪细小病病毒的转移因子及其制备方法，包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪、从免疫猪的脾脏中提取抗猪细小病转移因子等步骤。使用本发明的转移因子可以起到预防猪细小病病毒、保护正常机体细胞免受猪细小病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪细小病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
文档编号C07K1/14GK101759773SQ20081015434
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者李旭东, 管于平, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司