专利名称：乳酸杆菌外膜蛋白提取工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种作为微生物添加剂的 乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法。
背景技术：
药物词料添加剂的广泛运用，尤其是抗生素饲料添加剂的利用，在动 物防病治病等方面发挥重要作用的同时，也给畜牧生产和人类带来了一定 的副作用。首先是抗生素在杀灭致病菌的同时，也杀灭了对动物机体的有 益菌，破坏肠道内微生物的微生态平衡，导致动物，特别是幼畜禽对病原 微生物的易感性。另外，长期饲喂抗生素会使动物机体内产生具有耐药性 的细菌，这些细菌对人畜均有害。为此，各国都在积极进行各种新型抗生 素替代品的研究开发，其中微生态制剂已目前研究的主要热点之一。
微生态饲料添加剂是根据微生态学理论研制的含有对动物有益微生物 的活菌制剂，它们通过维持动物肠道内微生态平衡而发挥作用，具有促进 动物生长发育，提高动物机体免疫力等多种功能，且无污染、无残留、无 耐药性和对环境无害等，是一类新型绿色环保饲料添加剂。这些禽畜用的 益生菌制剂含有芽孢杆菌，乳酸杆菌，粪链球菌，双歧杆菌，酵母等，光 合细菌和梭状芽胞杆菌属的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌 添加到仔猪和仔鸡饲料中。
微生态制剂的作用机理 一般认为微生态制剂对促进畜禽健康的作用 机理包括以下几个方面1.帮助寄主肠道有益菌群尽快达到或者维持其生态平衡；2.饱和肠粘膜的吸附位点，致使病原菌无法在肠粘膜上定植；3.发 酵碳水化合物，产生短链脂肪酸等代谢产物，降低肠道内pH值，从而抑制 肠道内发酵蛋白质的菌群活性，控制其发酵速度；4.刺激寄主免疫细胞的 活性，提高免疫球蛋白的水平；5.刺激寄主产生多种消化酶，协同寄主增 加对维生素等营养物质的消化吸收。
活菌微生态制剂在动物养殖中的作用活菌制剂始于上世纪初，有人用酸 牛奶来调整幼畜腹泻出现的肠道微生物菌群失调。后来，在研究中人们发 现用活菌制剂可防止畜禽的腹泻和肠炎，继之又发现活菌制剂还可改善动 物对词料的利用，并有利于促进畜禽的生长发育和肠道健康，从而扩大了 活菌制剂在畜牧生产中的作用和应用前景，概括起来，主要有以下几个方 面的作用。
改善动物胃肠道微生态环境研究表明，动物自身及许多致病菌不会产生 各种有毒物质，如胺、氨、细菌毒素、氧自由基等代谢产物。有些有益菌 可以阻止毒性胺和氨的合成或把它们分解中和细菌毒素，从而避免这些有 害物质对动物机体组织细胞的损害作用。 一些好氧菌则通过产生超氧化物 歧化酶来消除氧自由基，减少或消除氧自由基对细胞及细胞器膜质结构的 损害。乳酸菌能够产生有机酸和抗菌物质，降低肠道内pH值和氧化还原电 位，有利于宿主生长发育和维持肠道健康。
产生有益物质动物微生态活菌制剂能够在动物体内产生各种消化酶，合 成B族维生素、维生素K等动物所必需的营养物质；同时能促使动物体增 加对肠道内容物中钙、镁等营养物质的吸收。
建立和维持肠道微生态平衡研究表明，动物肠道内寄居的微生物，主要 为厌氧菌。通常情况下，肠道内有益菌和致病菌会保持一定比例，当条件发生改变时，致病菌大量繁殖引起平衡失调，从而导致动物体患病。当需 氧型益生菌进入消化道后，生长繁殖消耗肠道内大量氧气，通过"生物夺氧" 使需氧型致病菌大幅度下降，因而起到防止动物患病的作用。研究还发现， 益生菌能够有秩序地定植于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障， 这些屏障可以阻止病原微生物的定植，起着占位、争夺营养。互利共生或
拮抗作用，形成保护屏障，阻止病原菌的侵入，从而对致病菌的定植产生 抑制作用。
增强动物免疫能力和促进动物生长微生态制剂可作为非特异性免疫调节 因子，增强吞噬细胞的吞噬能力和细胞产生抗体的能力，刺激动物产生干 扰素，从而增强抗病能力。据报道，用活菌微生态制剂——益生素饲喂哺
乳仔猪，添加组腹泻率明显比对照组减少(3.91%, P<0.01)，成活率提 高79%。在10 2S日龄的仔猪饲料中添加益生素，试验组采食量平均比对 照组增加70g/d，增重提高4.2%。又有研究报道，在雏鸡中分别饲喂和不 饲喂乳酸杆菌制剂两个组的基础上，进行鸡的白痢沙门氏菌攻毒试验。结 果表明，饲喂乳酸杆菌雏鸡组与对照组相比，死亡率明显降低了20。^。还 有报道称在鱼虾饲料中添加微生态制剂，可使鱼虾增重提高10% 20%。
在畜牧生产中常用的微生态添加剂，乳酸菌和芽胞杆菌类益生菌为主 要的微生态添加剂。细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(outer membrane Protein, OMP)的免疫作用越来越受到科技人员的关注，并进行了 研究。实验证明，OMP具有良好的免疫原性，不仅可刺激体液免疫，而且 也可刺激细胞免疫作用。OMP有多种提取方法，张晓华等认为不同研究者 得到的同一种细菌OMP的SDS-PAGE图谱之所以有所不同，与细菌的培养 条件、OMP的制备方法以及菌株的不同有关。不同研究者制备的OMP其 免疫效果也不同。本试验采用高压细胞破碎机破壁、粗提、SDS沉淀、SDS和HEPES再次沉淀、超滤纯化提取的乳酸杆菌菌株OMP。
益生菌膜蛋白的提取方法有多种，在水提醇沉的基础上，常采用反复 冻融、酶解、超声波、膜处理等方法进行辅助提取或精制。但这些方法均 有一些不足之处反复冻融的缺点在于费时费力，且细胞破裂率低，有效
利用低，不易纯化；超声波提取膜蛋白的优势是提取时间短，勿须加热， 提取量多。但是，浸提物在长时间破壁会发生变化，生物活性降低，有效 破壁率低，提取量有限不利于工业化生产；酶解法提取缺点在于必须要有 合适的pH、温度，有效破比率低，提取量有限不利于工业化生产；超滤膜 技术应用的缺点是必须知道目的膜蛋白的相对分子质量才能选取有效超滤 膜，否则须预选确定选膜，单采用一种膜分离效果有限。超滤与微滤、纳 滤、反渗透及电渗析等多种性能的膜技术进一步联用，取代能耗大、费用 高、周期长且处理不彻底的传统工艺操作，将是多糖提取工艺发展的新趋 势；离子交换技术缺点在于根据膜蛋白特性选择不同的柱型、洗脱剂种类、 pH值和洗脱速率，同样提取量有限不利于工业化生产。
因此，为了在最大限度保持蛋白活性的基础上提取乳酸杆菌外膜蛋白， 使多糖的生物学功能研究更为准确，同时为了适用于工业化生产的需求， 需要一种简单、实用、经济、高效的乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法。
发明内容
本发明的第一个发明目的是提供一种乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法，包
括
(1) 利用高压细胞破碎机进行乳酸杆菌细胞的破壁；
(2) 粗提物进行6000rpm， 15min离心，取上清液；(3) 在上清中加2%十二烷酰肌氨酸钠溶液充分混匀，室温作用lh， 于4°C 10000r/min超速离心lh;
(4) 将沉淀用10mmoL/LHEPES和等量2X十二烷酰肌氨酸钠溶解， 室温作用2h，于4。C10000r/min超速离心lh，将沉淀适量的溶于10mmoL/L HEPES(pH7.4)中。
(5) 经过超滤处理后，分装。
在一个具体实施方案中，所述的高压细胞破碎机的工作参数，优选 1000bar、 50Hz。
在另一个具体实施方案中，所述的超滤，优选使用0.45pm的微孔滤膜 或截留分子量为6400道尔顿的超滤膜(层析柱等)。
有益效果
1、 高压细胞破碎机提取时间短，勿须加热，破碎机破壁效果好，破壁 率高，因此能获得较多的膜蛋白粗提物；
2、 高压细胞破碎机提取过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应， 浸提物在短时间内保持不变，生物活性不减，同时提高了破碎速度，縮 短了破碎时间，可极大地提高提取效率；
3、 经过几次离心后去除大量破壁后的细胞碎片及一些杂蛋白，再经过 超滤后达到了有粗提到精提的效果；
4、 经过试验发现，所得的乳酸杆菌外膜蛋白产量为0.5kg/L，活性为 2xlOS活性单位/mg，完全满足生产需要。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
7实施例l:乳酸杆菌外膜蛋白的提取
实施方案将乳酸杆菌及培养大量后，先用高压细胞破碎机破壁，将粗
提物进行6000rpm, 15min离心，取上清液，在上清中加2%十二垸酰肌氨 酸钠溶液充分混匀，室温作用lh，于4。C10000r/min超速离心lh，将沉淀 用10mmoL/L HEPES和等量2X十二烷酰肌氨酸钠溶解，室温作用2h，于 4°C10000r/min超速离心lh，将沉淀适量的溶于10mmoL/L HEPES(pH7.4)
中，经过超滤处理后，分装。
实施例2:外膜蛋白的产量和活性鉴定
根据实施例l的方法，利用紫外分光光度法测外膜蛋白含量，每2L菌 液，最终能得到lkg外膜蛋白。
另外，根据MTT法活性测定的方法，鉴定外膜蛋白或含有外膜蛋白的 微生物添加剂的活性，操作步骤如下
1、 接种细胞用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种于96 孔板中，每孔体积20(^1。
2、 培养细胞将培养板移入C02培养箱中，在37X:、 5。/。C02及饱和 湿度条件下，培养3-5天。培养时间取决于实验目的和要求。
3、 呈色培养第3-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20pl， 37°C， 继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液上清。每孔加入150plDMSO
(二甲基亚砜)，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4、 比色选择490nm波长，在酶标仪上测定个孔吸收值，记录结果。 结果发现外膜蛋白原液的活性为2xl08活性单位/mg;含有外膜蛋白
的微生物添加剂溶液4xl0S活性单位/mg，完全能满足生产需要。
权利要求
1、一种用于乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法，包括(1)利用高压细胞破碎机进行乳酸杆菌细胞的破壁；(2)粗提物进行6000rpm，15min离心，3次，取上清液；(3)在上清中加2％十二烷酰肌氨酸钠溶液充分混匀，室温作用1h，于4℃10000r/min超速离心1h；(4)将沉淀用10mmoL/LHEPES和等量2％十二烷酰肌氨酸钠溶解，室温作用2h，于4℃10000r/min超速离心1h，将沉淀适量的溶于10mmoL/LHEPES(pH7.4)中。(5)经过超滤处理后，分装。
2、 权利要求1的方法，其中所述的高压细胞破碎机的工作参数，优选1000bar、 50Hz。
3、 权利要求1或2的方法，其中所述的超滤，优选使用0.45pm的微孔滤膜或截留分子量为6400道尔顿的超滤膜(层析柱等)。
全文摘要
本发明提供一种作为微生物添加剂的乳酸杆菌外膜蛋白的提取方法，包括高压细胞破碎机破壁、粗提、SDS沉淀、SDS和HEPES再次沉淀、超滤纯化。其中，所述的高压细胞破碎机的工作参数，优选1000bar、50Hz，破碎2次，超滤优选使用0.45μm的微孔滤膜或截留分子量为6400道尔顿的超滤膜(层析柱等)。本发明方法去除大量破壁后的细胞碎片及一些杂蛋白，再经过超滤后达到了有粗提到精提的效果，并且，浸提物在短时间内保持不变，生物活性不减，同时提高了破碎速度，缩短了破碎时间，可极大地提高提取效率，能满足工业生产的需要。
文档编号C07K1/34GK101475625SQ20081015399
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者李旭东, 王小娥, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司