专利名称：一种纯化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及药用重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子蛋
白的纯化，特别涉及重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子的纯化方法。
背景技术：
1977年，Bugress等从小鼠肺条件培养液中发现_种能剌激粒细胞和巨噬细胞形 成集落的因子，命名为粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子(grnaulocyte-macorphgaeeolony stimulatingafetor， GM-CSF) 。 1984和1985年，小鼠和人的GM-CSF的cDNA分别克降成 功。GM-CSF主要是由T淋巴细胞在抗原或有丝分裂原的剌激下产生的；单核细胞、内皮细 胞、成纤维细胞等也可产生GM-CSF。 GM-CSF有127个氨基酸残基，含两个二硫键(C54_C%， C88-C121)，只有第-对二硫键与活性相关。不同来源的GM-CSF的相对分子质量范围为 14500-35000，相对分子质量差异是由于糖基化程度的不同，GM-CSF的等电点为3. 5_4. 5。 GM-CSF的生物学功能主要是对粒细胞系和单核细胞系细胞的维持存活、促进生长、诱导分 化和增强功能等。 在临床上，重组人GM-CSF制剂已作为治疗造血系统异常的有效药物，主要用于治 疗包括肿瘤化疗所致的造血障碍、艾滋病、骨髓移植、再障等各种原因引起的白细胞减少 症，能有效提高患者的免疫能力。 早在80年代中期wong等克隆了 rhGM-CSF的cNDA，并在哺乳动物细胞培养中得 到表达。所以目前基础研究和临床上应用的rhGM-CSF都是通过基因工程技术重组生产的。 利用重组克隆的方法在大肠杆菌中成功表达hGM-CSF是最具有吸引力的表达系统之一。据 文献报道，rhGM-CSF的cDNA编码成熟蛋白N端的碱基GC含量较高，还含有大肠杆菌极少 用的密码子，因此在大肠杆菌中重组表达时，阻碍了转录的速度，从而导致表达水平大幅度 下降。因此有文献报道对rhGM-CSF cDNA的5/端作了修饰，降低GC含量之后，表达水平有 所提高。另外，目前国内外已公开报道了许多关于将rhGM-CSF与其他细胞因子以融合蛋 白的方式表达方面的研究，并证明其作用显著高于单个因子或者两者合用的效果。从目前 对融合蛋白的一些研究结果来看，它比单个的细胞因子对造血细胞有着更高的综合促进作 用，因此它们有可能成为临床使用的新一代高效造血剌激因子。 重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子的分离纯化技术有许多中，其中色谱法已是 当前分离纯化最普遍的方法。目前，大多采用将复性后的重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激 因子经DEAE离子交换色谱，进行分离。选用这种色谱方法分离纯化工艺简单，成本低，但重 组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子蛋白的纯度通常只能达到90%左右。也有采用亲和色谱 或反相色谱，疏水色谱，离子交换色谱，凝胶色谱的组合等方法纯化重组人粒细胞巨噬细胞 集落剌激因子蛋白。但亲和色谱配体生产困难，费用高，且配体脱落影响产物纯度。而反相 色谱(RPLC)与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。由 于RPLC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等，纯化产物不必进行洗脱， 因此大大简化了操作步骤。另外，在RPLC中，蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用，从而表现出与其他色谱及电泳方法 不同的选择性，提供其他方法不能提供的信息，这成为RPLC在蛋白质分离分析中的又一有 利因素。 本专利采用反相色谱填料对重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子进行纯化，不仅 使其回收率达到满意的结果，还提高分离纯化后的蛋白纯度、比活和稳定性，大大简化了操 作步骤、縮短了生产周期。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，从对重组基因工程菌菌株的 分离纯化的手段的创新，来大幅度提高重组人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子分离纯化后的 蛋白纯度、比活、稳定性。 本发明解决的技术问题所采用的技术方案是在纯化工艺中采用了反相填料的精 细分离纯化步骤。包括步骤a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体 进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；d、 对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行
阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填 料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落剌激因子。 同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，蛋白电泳纯度由90%提高 到98%， HPLC纯度由90%提高到98%，其比活由1. 1 X 107lU/mg提高到2. 5X107IU/mg。 4t:条件下蛋白稳定性由原有的3个月提高到12个月。可见，采用本发明的重组人粒细胞 巨噬细胞集落剌激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高蛋白的纯度、比活、稳定性。
具体实施例方式以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发
明的限制。 实施例l 使用半制备型MKF-RP柱。 样品阳离子层析产物200ml，蛋白浓度1. Omg/ml。 配制洗脱液A为含50mmolNaCl和20mmo1 Tris-HCl缓冲液(pH 8)，洗脱液B为含 50mmolNaCl溶液20mmo1 Tris-HCl 60%乙腈(pH 8)。 先用洗脱液A洗脱，再用梯度洗脱15% _90%洗脱液8洗脱，10-55分钟收集样品 峰。 被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓縮后保存在4t:条件下。 实施例2 使用XK 50/30柱，用SBC MCL GEL型反相制备液相色谱填料装柱。
样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度1. 2mg/ml。 洗脱液A为20%磷酸盐缓冲液，洗脱液B为含0. 02% tween80的30%甲醇溶液， 流速为15ml/min。 梯度洗脱，在10-80分钟20% _ %洗脱液8洗脱，收集样品峰。收集样品时，收集中间部分。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓縮后保存在4t:条件下。 实施例3 使用Butyl-S印harose 4Fast Flow, XK50 H16层析柱。 样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度1. Omg/ml 。添加硫酸铵到0. 8M。 平衡液20mmol/ml Tris-HCl， PH8. 0,0. 8M硫酸铵 预洗脱液20讓ol/ml Tris-HCl， ffl8. 0，0. 5M硫酸铵 洗脱液20mmol/ml Tris-HC1， PH8. 0， 0. 2M硫酸铵 收集洗脱液洗脱部分，透析除盐即得。 在4。C条件下对实施例1、2、3的样品进行稳定考察，考察结果如下 0月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例12. 5X107IU/mg98%98%符合规定1. 2mg/ml
实施例22. 3X107IU/mg98%98%符合规定1.2mg/ml
实施例31. lX107lU/mg92%92%符合规定1. Omg,/ml 3月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例12. 5X107IU/mg98%98%符合规定1. 2mg,/ml
实施例22. 3X107IU/mg98%98%符合规定1. 2mg/ml
实施例31. 0X107IU/mg91%91%符合规定1.Omg/ml 6月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例12. 4X107IU/mg98%97%符合规定1. 3mg/ml
实施例22. 3X107IU/mg98%97%符合规定1. 2mg/ml
实施例30. 9X107IU/mg89%88%符合规定1. lmg/ml 12月
批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度
实施例12. 3X107IU/mg97%97%符合规定1. 2mg/ml
实施例22. 1 X 107IU/mg97%97%符合规定1. 2mg/ml
实施例30. 6X107IU/mg86%85%符合规定].Omg/ml 以上数据说明，通过反向填料方法获得的实施例1、2样品较实施例3，电泳纯度与 HPLC纯度在12个月内均大于97% ，比活达到2. 1 X 107IU/mg以上，其他各项指标也符合药
5典要求，实施例1、2样品可在4t:条件下放置12个月，实施例3样品在考察6个月时出现比 活降低，蛋白纯度下降的现象。说明通过反向填料方法获得重组人粒细胞集落剌激因子蛋 白更加稳定。
权利要求
一种重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的纯化工艺方法。其特征在于采用了反相填料层析分离。
2. 根据权利要求1所述的反相填料层析分离前的样品要求，其特征在于经过分离纯化 后的样本。
3. 根据权利要求2所述的分离纯化，其特征在于先经过阴离子柱层析处理，再经过阳 离子柱层析处理，最后进行精细分离。
4. 根据权利要求1所述的反相填料柱，其特征在采用半制备型柱和制备型柱。
5. 根据权利要求1所述的反相填料层析，其特征在采用反相色谱预装柱或反相填料预 装柱。
全文摘要
本发明涉及一种纯化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的方法。本发明首次将反相填料的精细分离步骤应用于重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的纯化工艺中。同现有技术相比较，采用本发明的反相填料精细分离，电泳纯度由90％提高到98％，HPLC纯度由90％提高到98％，其比活由1.1×107IU/mg提高到2.5×107IU/mg。可见，采用本发明的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高其蛋白纯度、比活、稳定性，将行效降低其在临床中的副作用。
文档编号C07K1/20GK101717429SQ200810137280
公开日2010年6月2日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者吕延杰, 吴志军, 王 忠 申请人:哈药集团生物工程有限公司;哈尔滨医科大学