专利名称：一种吸附分离高纯度绿原酸的新方法
技术领域：
本发明涉及一种吸附分离高纯度绿原酸的新方法，属于生物化工领域的天然产物提 取技术。
背景技术：
绿原酸是一种縮酚酸，属酚类化合物，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成 的一种苯丙素类化合物。绿原酸是一种重要的生理活性物质，具有抗菌、抗病毒、升高 白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。它是许多药材和中 成药的主要有效成分之一；同时，绿原酸含量又是某些成药的质量指标，也是许多果汁 饮料营养成分之一。因此，绿原酸不仅在医药工业，而且在食品、日用化工中有广阔的 应用前景。
目前用于提取绿原酸的原料有金银花、杜仲、葵花籽饼、废次烟叶、咖啡豆、苹果、 番茄等。现有绿原酸提取方法主要有水提醇沉法、水提石灰乳沉淀法、醇提铅盐沉淀法、 超声波法、酶法、超临界法、超滤法等，但这些方法在经行提取分离时存在着操作复杂、 提取得率低、提取物绿原酸含量较低、提取设备昂贵、产生有机溶剂污染、生产能力小 等不利用于工业规模生产问题。
利用树脂吸附法有吸附量大、选择性好、保护环境、再生容易、强度高、耐热耐氧 化、使用寿命长等优点，在工业上己经被广泛利用。专利CN1974527A公开了一种利用 大孔树脂分离绿原酸的方法，该方法用醇溶液提取杜仲叶，提取液经大孔树脂吸附解吸 过程得绿原酸，但是该方法采取了单级分离和醇提取绿原酸的方式；专利CN1730015公 开了一种从金银花中分离绿原酸的方法，该方法水提取金银花，提取液调pH，上大孔吸 附柱分离绿原酸，最后经乙酸乙酯萃取精制，但是该方法仍然采取单级分离的方式，而 且减少乙酸乙酯在绿原酸中的残留会带来额外操作成本增加。
利用多级分离系统可以实现更加高效、连续的分离，如Ramamurthy等报道了利用将 多级柱并联的方式分离芳香化合物的方法(Parallel column liquid chromatography with a single multi-wavelength absorbance detector for enhanced selectivity using chemometric analysis[J]J"fl/Wca C/j/附/ca爿"a， 2003， 490(1 2): 197 210);德国专利DE883806372 公开了一种除去咖啡豆提取物中咖啡因和绿原酸的方法，该方法将与80'C热水混合震荡3小时后的咖啡豆提取液通过二级联接的分别装填Sephadex G-15和Sephadex G-10的凝 胶色谱柱，在S印hadexG-15凝胶色谱柱中可保留56。/。的咖啡因，而在Sephadex G-10凝胶 色谱柱中可以保留73.4%的绿原酸，但是该方法实质上仍是单级分离单种物质。
总之，现有的方法均有间歇不连续化操作、上柱液和洗脱液利用率不高等缺点，使 得树脂分离技术在工业生产上的应用受到了阻碍，合理利用树脂的选择性吸附分离的优 势，优化分离工艺，将大大降低生产成本，提高生产效率，无毒环保，为绿原酸工艺开 辟全新的工业格局。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种分离绿原酸的新方法，使得该方法能适用于绝大多数 低成本绿原酸原液，并解决常规方法中利用大孔树脂对绿原酸的吸附和洗脱过程中对原 料液、洗脱液利用率低等特点，实现绿原酸的高效高纯度提取，并适宜工业生产。
为实现本发明的技术目的，本发明的技术方案是
一种吸附分离高纯度绿原酸的新方法，包括吸附过程、洗杂过程、洗脱过程，其特 征在于将绿原酸原液通过装填大孔树脂的、至少二级串联吸附柱动态吸附至穿透后，流 加洗杂溶液洗杂，最后用洗脱液经行洗脱至无绿原酸流出，并收集流出液。
本技术方案的具体操作步骤如下
(1) 吸附过程
将绿原酸原液通过装填有按常规方法处理后的大孔树脂的、至少二级串联的吸附柱 动态吸附穿透，其中一级吸附柱对绿原酸原液动态吸附至贯穿所需体积为2 BV 10 BV， 二级吸附柱对绿原原液动态吸附至贯穿所需体积为1BV 8BV， 二级以上吸附柱 对绿原酸原液动态吸附至贯穿所需体积为2 BV 10 BV，绿原酸提原液流速5 BV/h 30 BV/h;
(2) 洗杂过程
用洗杂液冲洗步骤(1),中经动态吸附达到穿透点的串联吸附柱，其中一级吸附柱 洗杂液所需体积为0.5 BV 4 BV， 二级吸附柱洗杂液所需体积为0.5 BV 2 BV， 二级 以上吸附柱洗杂液所需体积为0.5 BV 4 BV，洗杂液流速6 BV/h 30 BV/h;
(3) 洗脱过程
用洗脱液对步骤(2)洗杂后的串联吸附柱经行洗脱至无绿原酸流出，并收集流出 液即绿原酸纯溶液，洗脱时各柱温度为10'C 7(TC， 一级吸附柱洗脱液所需体积为2BV 10BV， 二级吸附柱洗脱液所需体积为2 BV 8 BV, 二级以上吸附柱洗脱液所需
体积为2 BV 10 BV，洗脱液流速6 BV/h 30 BV/h。
本发明所述的绿原酸原液包括金银花提取液、烟草提取液、杜仲提取液； 本发明所述绿原酸原液的绿原酸浓度为0.1 mg/mL 5.0 mg/mL， PH值为1 7; 本发明所述的大孔树脂包括非极性大孔树脂、中极性大孔树脂、弱极性大孔树脂； 本发明所述的各级吸附柱包括玻璃柱、耐有机溶剂、耐酸碱不锈钢柱、陶瓷内衬的
不锈钢柱、陶瓷柱；
本发明所述的各级吸附柱的高径比为1:4 1:10; 本发明所述的洗杂液包括水、酸溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液； 本发明所述的洗脱液包括甲醇、甲醇水溶液、酸性乙醇、酸性乙醇水溶液、酸性乙
酸乙酯、酸性丙酮、乙酸；
本发明所述的洗脱液pH值为1.0 8.0。
本发明的有益效果在于提供的一种高效吸附分离绿原酸的方法①对原料选择面 广，即适用于任何天然产物的含绿原酸原液，大大降低了原料成本；②不仅各级吸附柱 洗杂后溶液尾流还可以重复利用上柱，而且洗杂液是有机溶剂的还可以回收使用，进一 步降低了成本；③不仅实现了连续操作，而且对原液的处理量大，分离效果好； 操作 方法简单，控制参数少，无环境污染，易工业化放大。通过本发明所述的方法得到纯绿 原酸溶液经HPLC检测纯度可达92%，浓度可达0.1 mg/mL 0.8 mg/mL，可广泛应用于 食品，医药，化妆品等领域中。本方法制得的绿原酸纯溶液直接干燥得到的固体干燥绿 原酸粉无需再加工即可直接应用，便于运输。
图1本发明操作示意图
图l中的标记为①加料槽，②控速泵，③一级吸附柱，④二级吸附柱，⑤二级以 上吸附柱，⑥三通阀，⑦一级收集罐，⑧二级收集罐，③二级以上收集罐。
具体实施例方式
本发明所述的方法适用附图l所示的装置操作进行，其中绿原酸原液、洗杂液、洗 脱液在各步骤均通过加料槽中①加入，并通过控速泵②以一定速度行经串联吸附柱，串 联吸附柱的级数至少二级。串联吸附柱的吸附、洗脱过程都是利用三通阀(D来控制进料液和洗脱液体的流向和柱切换。
本发明所述的绿原酸的检测方法为HPLC法，检测条件如下 固定相Prevail Select C18 (4.6 mmX250 mm， 5 mm); 流动相乙腈:四氢呋喃:水(0.2。/。磷酸"10:5:85(v:v:v); 恒流泵LB-05 (北京卫星制造厂)；
操作系统N2000色谱工作站；
流速l.OmL'min";
柱温30°C;
紫外检测波长328 nm。
实施例l
本实施例采用pH值为6、浓度为5.0 mg/mL的金银花水提原液，串联吸附柱级数 为三级，各级吸附柱为高径比1:10 (015x150 mm)的玻璃柱，装填非极性大孔吸附树 月旨XDA-1 (西安电子树脂厂)。
原液依次通过一级吸附柱IOBV、 二级吸附柱8BV、三级吸附柱10BV，使各柱都 达到穿透点，控制溶液的流速为12 BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱 的柱温为25。C。选用水作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱4BV、 二级吸附柱2BV、三 级吸附柱4BV,洗脱流速为12BV/h，至流出液无糖无蛋白。接着用pH值为4的30y。 的乙醇-水溶液对一级吸附柱10 BV、 二级吸附柱8 BV、三级吸附柱10 BV进行动态的 洗脱，洗脱流速为12BV/h，柱温25。C,至流出液中无绿原酸；分别收集该洗脱过程中 一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到 绿原酸溶液纯度为89. 28%，收率为45.78%。
实施例2
本实施例采用pH值为7、浓度为4.0 mg/mL的烟草水提原液，串联吸附柱级数为 三级，各级吸附柱为高径比1:4 (015x60mm)的耐有机溶剂柱，装填中极性大孔吸附 树脂HZ-806 (上海华震科技有限公司)。
原液依次通过一级吸附柱2 BV、 二级吸附柱1 BV、三级吸附柱2 BV，使各柱都达 到穿透点，控制溶液的流速为5BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的柱 温为25。C。选用50%乙醇水溶液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱0.5 BV、 二级吸附柱0.5BV、三级吸附柱0.5BV，洗脱流速为6BV/h，至流出液无糖无蛋白。接着用pH 值为4的乙醇对一级吸附柱2BV、 二级吸附柱2BV、三级吸附柱2 BV进行动态的洗 脱，洗脱流速为6BV/h，柱温10'C，至流出液中无绿原酸；分别收集该洗脱过程中一 级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到绿 原酸溶液纯度为85. 34%，收率为40.78。/。。
实施例3
本实施例采用pH值为6、浓度为2.0 mg/mL的杜仲水提原液，串联吸附柱级数为 二级，各级吸附柱为高径比1:10 (0)15x150 mm)的耐酸碱不锈钢柱，装填弱极性大孔 吸附树脂XDA-5 (西安电子树脂厂)。
原液依次通过一级吸附柱7BV、 二级吸附柱4BV，使各柱都达到穿透点，控制溶 液的流速为15BV/h,控制一级吸附柱、二级吸附柱的柱温为25'C。选用1M盐酸水溶 液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱2BV、 二级吸附柱1BV，洗脱流速为15BV/h， 至流出液无糖无蛋白。接着用pH值为5的丙酮对一级吸附柱5BV、 二级吸附柱4BV 进行动态的洗脱，洗脱流速为15BV/h，柱温40'C，至流出液中无绿原酸；分别收集该 洗脱过程中一级吸附柱、二级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到绿 原酸溶液纯度为卯.56%，收率为52.97%。
实施例4
本实施例采用pH值为1、浓度为1.0mg/mL的金银花醇提原液(70。/。乙醇溶液浸提 48 h并将乙醇蒸出得到的金银花水原液)，串联吸附柱级数为二级，各级吸附柱为高径 比1:6 (015x卯mm)的带陶瓷内衬的不锈钢柱，装填中极性大孔吸附树脂HPD-750 (河 北沧州宝恩化工有限公司)。
原液依次通过一级吸附柱7BV、 二级吸附柱4BV，使各柱都达到穿透点，控制溶 液的流速为30BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱的柱温为25'C。选用丙酮50%水溶 液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱2BV、 二级吸附柱1BV，洗脱流速为30BV/h， 至流出液无糖无蛋白。接着用pH值为l的乙酸乙酯对一级吸附柱5BV、 二级吸附柱4 BV进行动态的洗脱，洗脱流速为30 BV/h，柱温25'C,至流出液中无绿原酸；分别收 集该洗脱过程中一级吸附柱、二级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得 到绿原酸溶液纯度为78. 72%，收率为38.21%。实施例5
本实施例采用pH值为6、浓度为0.5 mg/mL的烟草水提原液，串联吸附柱级数为 二级，各级吸附柱为高径比1:8 (0)15x 120 mm)的陶瓷柱，装填弱极性大孔吸附树脂 HZ-841 (上海华震科技有限公司)。
原液依次通过一级吸附柱10BV、 二级吸附柱8BV,使各柱都达到穿透点，控制溶 液的流速为12BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱的柱温为25。C。选用1M硫酸水溶 液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱4BV、 二级吸附柱2BV,洗脱流速为12BV/h， 至流出液无糖无蛋白。接着用pH值为2的乙酸对一级吸附柱10BV、 二级吸附柱8BV 进行动态的洗脱，洗脱流速为12BV/h,柱温70。C，至流出液中无绿原酸；分别收集该 洗脱过程中一级吸附柱、二级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到绿 原酸溶液纯度为60. 28%,收率为32.25%。
实施例6
本实施例采用pH值为5、浓度为O.l mg/mL的杜仲醇提原液(70%乙醇浸提48 h 并将乙醇蒸出得到的杜仲水原液)，串联吸附柱级数为三级，各级吸附柱为高径比1:10 (015x150 mm)的耐酸碱不锈钢柱，装填非极性大孔吸附树脂XDA-1 (西安电子树脂 厂)。
原液依次通过一级吸附柱7BV、 二级吸附柱4BV、三级吸附柱7BV，使各柱都达 到穿透点，控制溶液的流速为12 BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的 柱温为25'C。选用30%乙醇水溶液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱2BV、 二级吸附 柱1BV、三级吸附柱2BV，洗脱流速为12BV/h，至流出液无糖无蛋白。接着用pH值 为7的甲醇对一级吸附柱5BV、 二级吸附柱4BV、三级吸附柱5BV进行动态的洗脱， 洗脱流速为12BV/h，柱温10'C，至流出液中无绿原酸；分别收集该洗脱过程中一级吸 附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到绿原酸 溶液纯度为80. 23%，收率为30.12%。
实施例7
本实施例采用pH值为5、浓度为1.0 mg/mL的烟草醇提原液(70%乙醇浸提48 h 并将乙醇蒸出得到的烟草水原液)，串联吸附柱级数为三级，各级吸附柱为高径比1:4 (015x60 mm)的陶瓷柱，装填中极性大孔吸附树脂NKA (南开大学化工厂)。原液依次通过一级吸附柱7 BV、 二级吸附柱4 BV、三级吸附柱7 BV，使各柱都达 到穿透点，控制溶液的流速为12 BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的 柱温为25'C。选用30%乙醇水溶液作为洗杂液，依次冲洗一级吸附柱2 BV、 二级吸附 柱1BV、三级吸附柱2BV，洗脱流速为12BV/h，至流出液无糖无蛋白。接着用pH值 为8的30。/。甲醇水溶液对一级吸附柱5BV、 二级吸附柱4BV、三级吸附柱5BV进行 动态的洗脱，洗脱流速为12BV/h，柱温10'C，至流出液中无绿原酸；分别收集该洗脱 过程中一级吸附柱、二级吸附柱、三级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定， 得到绿原酸溶液纯度为85. 67%,收率为46.23%。
实施例8
本实施例采用pH值为1、浓度为2.0 mg/mL的金银花水提原液，串联吸附柱级数 为二级，各级吸附柱为高径比1:8 (015x 120 mm)的带陶瓷内衬的不锈钢柱，装填中 极性大孔吸附树脂NKA (南开大学化工厂)。
原液依次通过一级吸附柱IOBV、 二级吸附柱8BV，使各柱都达到穿透点，控制溶 液的流速为12BV/h，控制一级吸附柱、二级吸附柱的柱温为25°C。选用水作为洗杂液， 依次冲洗一级吸附柱4 BV、 二级吸附柱2BV，洗脱流速为12BV/h，至流出液无糖无 蛋白。接着用pH值为8的甲醇对一级吸附柱10BV、二级吸附柱8BV进行动态的洗脱， 洗脱流速为12BV/h，柱温7(TC，至流出液中无绿原酸；分别收集该洗脱过程中一级吸 附柱、二级吸附柱的洗脱液，合并洗脱液。经HPLC法测定，得到绿原酸溶液纯度为 90.24%，收率为51.23%。
权利要求
1、一种吸附分离高纯度绿原酸的新方法，包括吸附过程、洗杂过程、洗脱过程，其特征在于将绿原酸原液通过装填大孔树脂的、至少二级串联吸附柱动态吸附至穿透后，流加洗杂溶液洗杂，最后用洗脱液经行洗脱至无绿原酸流出，并收集流出液。
2、 根据权利要求1所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在于其 具体操作步骤包括-(1) 吸附过程将绿原酸原液通过装填有按常规方法处理后的大孔树脂的、至少二级串联的 吸附柱动态吸附穿透，其中一级吸附柱对绿原酸原液动态吸附至贯穿所需体积为 2BV 10BV， 二级吸附柱对绿原原液动态吸附至贯穿所需体积为1BV 8BV， 二级以上吸附柱对绿原酸原液动态吸附至贯穿所需体积为2 BV 10 BV，绿原酸 提原液流速5 BV/h 30 BV/h;(2) 洗杂过程用洗杂液冲洗步骤(1)中经动态吸附达到穿透点的串联吸附柱，其中一级 吸附柱洗杂液所需体积为0.5 BV 4 BV， 二级吸附柱洗杂液所需体积为0.5 BV 2 BV， 二级以上吸附柱洗杂液所需体积为0.5 BV 4 BV,洗杂液流速6 BV/h 30 BV/h;(3) 洗脱过程用洗脱液对步骤(2)洗杂后的串联吸附柱经行洗脱至无绿原酸流出，并收 集流出液即绿原酸纯溶液，洗脱时各柱温度为10'C 7(TC, —级吸附柱洗脱液 所需体积为2BV 10BV， 二级吸附柱洗脱液所需体积为2BV 8BV， 二级以 上吸附柱洗脱液所需体积为2 BV 10 BV，洗脱液流速6 BV/h 30 BV/h。
3、 根据权利要求1和2所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在 于所述的绿原酸原液包括金银花提取液、烟草提取液、杜仲提取液。
4、 根据权利要求l、 2和3所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征 在于所述的本发明所述绿原酸原液的绿原酸浓度为0.1 mg/mL 5.0 mg/mL， PH 值为1 7。
5、 根据权利要求1和2所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在 于所述的大孔树脂包括非极性大孔树脂、中极性大孔树脂、弱极性大孔树脂。
6、 根据权利要求1和2所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在 于所述的各级吸附柱包括玻璃柱、耐有机溶剂、耐酸碱不锈钢柱、陶瓷内衬的不 锈钢柱、陶瓷柱。
7、 根据权利要求l、 2和6所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征 在于所述的各级吸附柱的高径比为1:4 1:10。
8、 根据权利要求1和2所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在 于所述的洗杂液包括水、酸溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液。
9、 根据权利要求1和2所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特征在 于所述的洗脱液包括甲醇、甲醇水溶液、酸性乙醇、酸性乙醇水溶液、酸性乙酸 乙酯、酸性丙酮、乙酸。
10、 根据权利要求l、 2和9所述的吸附分离高纯度绿原酸的新方法，其特 征在于所述的本发明所述的洗脱液PH值为1.0 8.0。
全文摘要
本发明提供了一种吸附分离高纯度绿原酸的新方法，包括吸附过程、洗杂过程、洗脱过程，其特征在于将绿原酸原液通过装填大孔树脂的、至少二级串联吸附柱动态吸附至穿透后，流加洗杂溶液洗杂，最后用洗脱液洗脱至无绿原酸流出，并收集流出液。通过本发明所述的方法得到纯绿原酸溶液经HPLC检测纯度可达92％以上，浓度可达0.1mg/mL～0.8mg/mL，可广泛应用于食品，医药，化妆品等领域中。本方法制得的绿原酸纯溶液直接干燥得到的固体，干燥绿原酸粉无需再加工即可直接应用，便于运输。
文档编号C07C69/732GK101314568SQ200810124130
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者凌岫泉, 卢定强, 张淑敏, 梁铭鑫, 声 洪, 俊 王 申请人:南京工业大学