专利名称：一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法。
技术背景铁是植物生长发育必须的微量元素之一，利用生物学技术解决植物的缺铁问题 是一个行之有效的方法。小金海棠是全球第一个耐缺铁的苹果属植物，研究小金海 棠抗逆反应机理对培育抗逆果树品种显的尤为重要。蛋白质组分析是研究植物抗逆 反应的重要技术手段，有助于研究植物的耐缺铁机理。蛋白质双向电泳是蛋白质组 分析中常用的技术方法，迄今为止还没有适于苹果属植物的双向电泳分析方法。这 是由于小金海棠植物体内富含多糖、酚类及核酸类物质，这些物质的存在对双向电 泳的干扰很大，导致与苹果属植物相关的蛋白质组研究相对滞后。合适的蛋白样品 制备方法、适宜的蛋白质上样量和凝胶染色方法在苹果属植物蛋白质组分析中起重 要作用。 发明内容本发明的目的是提供一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法。 本发明提供的苹果属植物蛋白质双向电泳方法，依次包括以下步骤1) 将苹果属植物材料在液氮中研碎后，向所述植物材料中加入-2(TC预冷的含 有10%的三氯乙酸和0.07%的e-巯基乙醇的丙酮溶液继续研磨成匀漿，-2(TC下放 置l h，然后12000 rpm离心15 min，弃上清，保留沉淀；2) 向所述沉淀中加入所述沉淀的4倍体积的含有0.07%的巯基乙醇的丙 酮溶液，混匀后，放置于-20°C 1 h，然后12000 rpm离心15 min，弃上清，保留 沉淀；3) 重复步骤2) 6次，得到苹果属植物蛋白质；4) 对步骤3)的苹果属植物蛋白质先进行等电聚焦电泳，然后再沿其垂直方向 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中，所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为300 ug/170 mm胶条，所述聚丙 烯酰胺凝胶电泳中采用的染色方法是银染；所述百分数均为质量百分含量。本发明的苹果属植物蛋白质双向电泳方法，是从蛋白质的提取入手，改进了蛋白提取步骤中清洗沉淀的方法，使得后续的蛋白样品在进行等电聚焦过程中在胶条 表面的褐色物质减少，有利于等电聚焦的顺利进行。本发明的蛋白质双向电泳方法适合于所有的苹果属植物，如小金海棠(#WMxz'a。yi/ e/ 57's)、 山定子(Afo/附6"ccflto(Z., Borkh)等。同时，本发明的蛋白质双向电泳方法适合于苹果属植物的各个组织和器官的总 蛋白双向电泳，如白色幼嫩初生根。木本的苹果属植物的总蛋白在进行双向电泳，由于植物中核酸，酚类物质等含 量多，提取的蛋白中的杂质影响双向电泳结果。本发明改进了清洗蛋白沉淀的方法、 确定了适合于苹果属植物的蛋白上样量以及蛋白染色方法，解决了苹果属木本植物 中提取的蛋白质存在大量杂质的问题，有效减少了聚焦过程中吸附在胶条上的褐色 物质以及对双向电泳结果产生干扰的技术问题，有利于后续的质谱分析鉴定蛋白。 本发明将在苹果属木本植物的蛋白质利用方面得到广泛的应用。
图1为小金海棠总蛋白质双向电泳图具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 下面以小金海棠(ifeJ^ u'ao力'/j朋Ws)为例，阐明本发明的苹果属植物蛋白 质双向电泳方法。实施例l、小金海棠(￥a7ws H'ao力'/3朋s&)的蛋白质双向电泳 本发明的蛋白质双向电泳包括样品的制备，蛋白定量，双向凝胶电泳，蛋白染色及胶图像分析等步骤，具体方法如下1.样品的制备1) 将小金海棠(勸7m xi朋力'/2e/7w;s^e/ 《/i朋《)(国家苹果种质资源圃 中的编号为DGB0458)的幼嫩的白色初生根系2g，置于液氮中冰浴研磨至呈白色粉 末状；2) 加入2 1111-20〔预冷的含有10%的三氯乙酸和0.07%的e-巯基乙醇的丙酮 溶液继续研磨成匀浆，转入离心管中，-2(TC下放置1 h，然后4'C 12000rpm离心 15min，弃上清；3) 向沉淀中加入4倍沉淀体积的含0.07% e-巯基乙醇的丙酮溶液充分涡旋， 放置于-20°C 1 h，然后4。C 12000rpm离心15min，弃上清；4)重复步骤3) 6次，然后冻干。2. 蛋白定量用Brandford法定量蛋白，然后分装放入-80。C备用。3. 双向凝胶电泳水化及第一向等电聚焦电泳参考B10-RAD公司仪器说明进行。pH5-8的17cm IPG 胶条(购自美国Bio-Rad公司，163-2011)分别在300y L的样品混合液l、样品混合 液2和样品混合液3中水化12h;样品混合液l、样品混合液2和样品混合液3的组分如 下样品混合液l， 300uL水化液中含有300ug的步骤l中制备的总蛋白；样品混合 液2， 300y L水化液中含有600ug的步骤l中制备的总蛋白；样品混合液3， 300uL 水化液中含有1200ug的l中制备的总蛋白。上述水化液的组成如下7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4g/100ml表面活性剂Chaps， 65 mmol/L 二硫苏 糖醇，0.2%(体积百分比)两性电解质CA;接着进行第一向等电聚焦电泳，参数设置为250 V/0. 5 h， 1000 V/1 h， 10000 V/ 5 h， 10000 V/60000 VH， 500 V/1 h。等电聚焦结束后，胶条依次在平衡液I (6. 0 mol/L尿素，2 g/100 ml SDS， 0. 375 mol/L Tris-HC1 pH8. 8， 20 ml/100 ml 甘油，130 mmol/L二硫苏糖醇)和平衡液II (6.0 mol/L尿素，2 g/100 ml SDS， 0.375 mol/L Tris-HC1 pH8. 8， 20 ml/100 ml甘油，135咖ol/L碘代乙酰胺)中 各平衡15 min。第二向的SDS-PAGE在美国BI0-RAD公司，164-5050垂直板电泳仪上进行，12% 分离胶浓度的不连续缓冲液系统，参数设置为起始电流5 mA/gel/17 cm，浓縮成一 条线后，加大电流为20 30 mA/gel/17 cm。4. 蛋白染色及凝胶图像分析上样量300 ug总蛋白的胶和上样量600 ug总蛋白的胶用快速硝酸银染色方 法染色，快速硝酸银染色方法如下1) 将凝胶放入固定液(40ml/100ml乙醇，10 ml/100 ml乙酸)中固定30min2) 倒出固定液，加入致敏液(30 ral/100 ml乙醇，0. 2 g/100 ml硫代硫酸钠， 6.8 g/100 ml乙酸钠)致敏30 min3) 倒出致敏液，用蒸馏水洗凝胶3次，每次IO min4) 倒出蒸馏水，加入染色液(0.25 g/100 ml硝酸银，0.04 ml/100 ml甲醛 原液)，染色20 min5) 倒出染色液，加入蒸镏水洗2次，每次l min6) 将凝胶置于显色液(2. 5g/100ml碳酸钠，0.02 ml/100 ml甲醛原液)中， 见背景加深时终止显色7) 倒出显色液，加入终止液(1.46 g/100 ml EDTA)处理凝胶10 min，停止显色8) 倒出终止液，蒸馏水洗洗凝胶3次，每次IO min。上样量1200ug总蛋白的胶在考马斯亮兰染色液(用50 ml/100 ml甲醇，10 ml/100 ml乙酸，0.25 g/100 ml考马斯亮蓝R250)中染色过夜。然后使用脱色液 (5%乙酸，10%甲醇)溶液脱色，反复更换脱色液直至蛋白质点在背景上变得清晰。用Koda校准卡校正Image master Lab scan扫描仪，扫描时光学分辨率设为 300 dpi, ID SDS-PAGE胶用Lab scan软件进行灰度扫描，双向凝胶电泳的胶用 Unimagic scan软件进行真彩色扫描后利用Image master 2DElite v5. 0软件进行 分析。以上电泳实验均重复3次。蛋白染色及凝胶图像分析的结果表明，上样量300 u g总蛋白的胶银染后的图 像中蛋白质分离较好且染色后出现的负染点少，如图1A。而上样量600ug总蛋白 的胶银染后的图像中尽管显现出一些低丰度蛋白点，但由于上样量的增大出现了负 染，严重影响了后续的图像分析，如图1B。上样量1200"g总蛋白的胶用常规考马 斯亮蓝染色后的图像中蛋白点有475个，如图1C，明显少于上样量300ug总蛋白 的胶银染图像中的蛋白点。对于蛋白含量少的小金海棠根部总蛋白，在进行双向电泳时尽管提高了上样 量，但是用常规考马斯亮蓝染色，仍然不利于分离和显示低丰度的蛋白。因此，小 金海棠根部总蛋白进行双向电泳时适用硝酸银染法，上样量为300u g总蛋白。
权利要求
1. 一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法，依次包括以下步骤1)将苹果属植物材料在液氮中研碎后，向所述植物材料中加入-20℃预冷的含有10％的三氯乙酸和0.07％的β-巯基乙醇的丙酮溶液继续研磨成匀浆，-20℃下放置1h，然后12000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀；2)向所述沉淀中加入是所述沉淀的4倍体积的含有0.07％的β-巯基乙醇的丙酮溶液，混匀后，放置于-20℃1h，然后12000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀；3)重复步骤2)6次，得到苹果属植物蛋白质；4)对步骤3)的苹果属植物蛋白质先进行等电聚焦电泳，然后再沿其垂直方向进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为300ug/170mm胶条，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中采用的染色方法是银染；所述百分数均为质量百分含量。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述苹果属植物为小金海棠。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述苹果属植物材料为白色 幼嫩初生根。
全文摘要
本发明公开了一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法。该方法包括以下步骤1)将植物材料在液氮中研碎，加入-20℃预冷的含有10g/100ml的三氯乙酸和0。07ml/100ml的β-巯基乙醇的丙酮溶液继续研磨成匀浆，-20℃放置1h，然后12000rpm离心15min，保留沉淀；2)向沉淀中加入4倍沉淀体积的含有0.07ml/100ml的β-巯基乙醇的丙酮溶液，混匀-20℃放置11，然后12000rpm离心15min，保留沉淀；3)重复步骤2)6次，得到总蛋白；4)对步骤3)的总蛋白进行等电聚焦电泳，蛋白质上样量为300ug/170mm胶条，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后进行银染。
文档编号C07K1/00GK101260146SQ20081010485
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者李天忠, 忆 王, 王晶莹, 许雪峰, 韩振海 申请人:中国农业大学