专利名称：：一种分离、纯化相思子毒素的方法及其产品的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种植物活性成分的分离、纯化方法，尤其涉及一种从云南豆科植物相思子G4brusprecatorius)种子中分离、纯化毒素(abri'n)的方法，属于植物化学领域。
背景技术：
：相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子C46rusprecatorius)种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ric&)同为II型核糖体失活蛋白0I"家族成员，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，相思子毒素类似于蓖麻毒素，是一种植物蛋白毒素，具有极强的细胞毒性作用，特别是对某些恶性肿瘤细胞的毒性更强，这使它成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。相思子毒素是一种分子质量约为63icu67;oj的糖蛋白，分子由4、S两条多肽链通过1个二硫键连接而成。完整毒素在SDS-PAGE分析时呈一条蛋白带，经二巯基乙醇处理后，爪S两条链分离开，其中4链呈酸性，分子质量约为30Au，与蓖麻毒素4链存在102个相同的氨基酸残基；S链呈中性，分子质量约35ioi。有关试验表明，相思子毒素两条链经二巯基乙醇还原分离开后，其活性并不丧失。迄今为止，从相思子种子中分离和纯化毒素和凝集素的方法有多种。大多经过离子交换，凝胶过滤，亲和层析等多步层析，才能得到纯品，方法较为繁琐，费用，成本相对较高。例如，国外从70年代开始进行相思子毒素的分离纯化，首先经DE-52阴离子交换层析，然后经凝胶过滤，S印harose4B亲和层析，操作过程较为烦琐，流程较长，费用和成本也相对较高，制约了对相思子的开发和利用，所以寻找一种步骤简捷、制备成本低的相思子毒素的分离和纯化方法,对于相思子的开发和利用具有重要的意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种分离、纯化相思子毒素的方法，该方法步骤简捷、生产成本相对较低。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种分离、纯化相思子毒素的方法，包括(1)将云南相思子粗毒素上酸化的S印harose4B亲和层析柱，先用初始平衡缓冲洗脱掉杂蛋白，然后用半乳糖梯度洗脱液进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；(2)将步骤(1)所收集的洗脱液浓縮后加样于DEAE-S印haroseFF凝胶面上，先用洗脱平衡液洗脱掉杂蛋白；然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL进行梯度洗脱，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，分别浓縮后进行脱盐处理，即得h、P2。为了达到更好的分离或纯化效果，步骤(l)中所述的酸化的S印harose4B亲和层析柱按照以下方法制备得到将凝胶Sepharose4B酸化处理，经洗涤、脱气、平衡后装层析柱;其中，所述的酸化处理优选用盐酸处理凝胶S印harose4B5-6小时。步骤(1)中所述的初始平衡缓冲液优选是10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH=7.4;所述的半乳糖梯度洗脱液优选为含0—0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液，pH=7.4;步骤(2)中所述的洗脱平衡液优选为10mmol/L的Tris-HCL，pH为7.0;步骤(2)中所述的脱盐处理优选为用脱盐柱进行脱盐处理，更优选的，以S印hadexG-25(30X2.Ocm)为脱盐柱，将浓縮液上脱盐柱后用水洗脱，流速为0.8ml/min，280nm检测，收集第一主峰。本发明中所述的相思子优选为云南相思子UfcrasprecatoriusL)，其分布于云南南部较热地区以及广东、广西、福建和台湾等地，1200米以下山坡、灌丛、路边等地。云南相思子粗毒素可从市场购买得到，也可按照常规的方法从云南相思子种子中制备得到。作为参考，可按照以下方法制备得到相思子粗毒素将相思子种子捣碎后，去掉种皮，种仁用5%的稀乙酸4'C浸泡过夜，次日用研钵磨碎，冷冻离心，取上清加入35。/。(NH4)2S04，低温静置，冷冻离心，取上清，加入9596的饱和(NH4)2S04，低温静置，冷冻离心，得到沉淀物，将沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH=7.4)透析3天，离心，取上清，得相思子Abrin粗毒素；本发明方法采用酸化的S印harose4B亲和层析柱可显著提高分离效果。相思子毒素具有乳糖结合专一性，而S印harose4B是一种含有半乳糖功能基的多糖载体，用HCL处理使S印harose4B发生部分酸水解，增加半乳糖残基数，可以提高基质的亲和容量。另外，本发明采用半乳糖梯度洗脱毒蛋白，同时去除凝集素，简化了分离步骤。在植物种子中，毒素与凝集素是共存的，其分子相差一倍左右,一般使用凝胶过滤分离开,而本发明方法使用半乳糖梯度洗脱，在洗脱毒蛋白的同时，将凝集素除去，省略了凝胶过滤层析，简化了纯化步骤。再者，本发明采用DEAE-S印haroseFF为离子交换介质可获得相思子两种毒蛋白成分。传统的纤维毒介质DE-52，由于流速太慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH值改变，难以纯化样品，而且纤维素不能承受0.lmol/NaOH的在位清洗，重生效果差，寿命短。鉴此，本发明采用化学稳定性高，流速快的高度偶联琼脂糖DEAE-S印haroseFF为介质。DEAE-S印haroseFF是在琼脂糖凝胶基础上改进的新产品，它是琼脂糖珠体经充分交联后得到的一类具有高通透能力的半刚性层析材料，引进功能基DEAE后具有阴离子交换能力，DEAE-S印haroseFF保留了天然多糖化合物的极好的亲水性及大网架结构，与生物活性大分子有很好的相容性，实验证明，其分离效果很好总之，本发明方法利用两次层析就可以得到相思子的两种毒素蛋白纯品，不仅简化了纯化步骤，而且在纯度，产率上均有显著提高，为大规模的纯化奠定了基础。由本发明方法所分离的相思子毒素由&和P2两种相思子毒素组成，其中P!分子量为64000，等电点为6.9，含糖量为9.4%;P2的分子量在62000-63000之间，等电点为6.0-6.2，含糖量为3.3%。体外抗肿瘤活性试验结果表明，本发明所分离的相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用。观察本发明所分离的相思子^动物移植性肿瘤抑制作用的试验结果表明，會^1^$(励物移植性肿瘤的增殖活性。本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的本发明所分离的相思子和药学上可接受的载体或辅料组成。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有10%-99%重量的相思子毒素，优选为含有10-50%重量的相思子毒素。将本发明所分离得到的相思子^t加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的药物制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体可以是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种，优选为甘露醇或乳糖。图1Abrin和AAG从S印harose4B的洗脱图。图2Abrin和AAG从酸处理的S印harose4B的洗脱图。图3凝集素从S印harose4B的洗脱图。图4凝集素从酸处理的S印harose4B的洗脱图。图5经酸化S印harose4B得到的两种毒素混合物再经过DEAE-S印haroseFF离子交换层析结果。图6本发明纯化的毒素经SDS-PAGE电泳结果。图7蛋白质分子量标准曲线。图8本发明所分离的P2的HPCE结果。图9通过HPCE确定的P2的分子量结果。图10标准蛋白各自的相对迁移率与其分子量的对数线性关系图。图11本发明所分离的Pi的MALDI-T0F-MS分析结果。图12为等电聚胶电泳pH-cm图谱(横坐标为从阴极到阳极的距离，纵坐标为pH值)。8图13本发明所分离的P2的毛细管等电聚胶电泳图。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料1云南相思子"brusprecatoriusL.)种子购自中国科学院昆明植物研究所。2凝胶S印harose4B(购自Pharmacia公司)，S印hadexG-25(购自Pharmacia公司)，DEAE-S印haroseFF(购自四川成都晨光化工研究院)。3层析系统HD-8858型紫外检测仪(上海精科实业有限公司)，FBS-100型自动部分收集器(上海青浦沪西生化仪器厂)，TH-1000型梯度混合议(上海沪西分析仪器厂)，3057型记录仪(四川仪表四厂)，DW-II型层析冷柜(浙江嵊县中爱恒温设备厂)。4层析柱20X1.6cm，20X2.6cm，30X2.Ocm等规格(购自上海锦华实验仪器厂)。5离心机日立55-P7型超速冷冻离心机(日立公司)。6分光光度计日立340型UV-VIS分光光度计(日立公司)。7冷冻干燥机LGJ型(军事医学科学院实验仪器厂)。8试剂Nacl、(NH4)2S04、NA2HP04、NaH2P04、Gal、HAC(均为分析纯，北京化工厂出品)，BSA(Serve公司出品)。实施例1一、实验方法1、相思子Abrin粗毒素的制备云南相思子"ferusprecatorius)种子100g捣碎后，去掉种皮，种仁用5%的稀乙酸41:浸泡过夜，次日用研钵磨碎，lOOOg冷冻离心20min，得到的上清中加入3596(NH4)2S04，4"静置2h，lOOOg冷冻离心10min，去除沉淀，留取上清，加入959&的饱和(NH4)2S04,4'C静置2小时，lOOOg冷冻离心20min，得到沉淀物，将沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH=7.4)透析3天，3000g离心去除变性蛋白，上清为相思子Abrin粗提取液，冷冻干燥保存；2、酸化S印harose4B的制备取适量S印harose4B，用HCL处理5-6小时，用水洗涤，缓冲液平衡后备用；3S印harose4B及酸化S印harose4B柱层析将酸化的S印harose4B凝胶经常规清洗后脱气，装柱(20X1.6cm)平衡，将粗毒素溶于初始平衡缓冲液(O.005mol/LPBS，pH=7.4)中，用吸管将其加到凝胶面上，以0.3ml/min的速度进入凝胶，先用初始平衡缓冲液(0.005mol/LPBS，pH=7.4)洗脱杂蛋白，洗脱流速为0.7ml/min，然后用含0-0.5mol/LGal的PBS梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；4DEAE-S印haroseFF柱层析将所收集的半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰用DEAE-S印haroseFF初始平衡缓冲液(O.Olmol/LTris-HCL,pH=7.0)透析，浓縮10后，加样于DEAE-S印haroseFF柱层析(2.6X20cm)凝胶面上，以0.3ml/min的速度进入凝胶，先用初始平衡缓冲液(0.005mol/LPBS，pH二7.4)洗脱杂蛋白，然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液(洗脱流速优选为O.8ml/min)，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，即分别得到P2，将PhP2经浓縮后进行脱盐处理(脱盐柱为S印hadexG-25(30X2.Ocm)，用水洗脱，流速为0.8ml/min.280nm检测)，冷冻干燥，样品保存于-20。C。5蛋白含量测定采用Lowry法。二、实验结果1采用酸化的S印harose4B亲和层析提高分离效果HCL处理S印harose4B不同时间对亲和容量的影响，见表1._表1HCL处理S印harose4B不同时间对亲和容量的影响_处理时间(小时)5i^^^^^^^^~凝胶吸附蛋白量(mg/2ml凝胶)3.283.253.503.673.743.863.853.773.483.493.38由表1可知，HCL处理S印harose4B的时间不同，在亲和容量上是由差异的:未处理的凝胶吸附蛋白量为3.28mg/2ml凝胶，随着处理时间的延长，吸附蛋白量增加，处理5-6小时达到最大，吸附蛋白量最高达到3.86mg/2ml凝胶，比未处理凝胶高17.7%.但如果继续延长处理时间，吸附蛋白量又下降,所以本发明选择亲和容量达到最大的条件,用HCL处理5-6小时，作为实验分离介质。(2)为了确定亲和容量的提高是否为特异性增加，做了对比实验，在同样条件下用S印harose4B和酸处理的S印harose4B进行分离，蛋白含量比较见表2，分离图谱见图l和图2。表2从S印harose4B和酸化的S印harose4B洗脱的蛋白含量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表2可见，酸化S印harose4B滞留280mg毒蛋白，而S印harose4B滞留200mg毒蛋白.可见，酸化S印harose4B亲和容量可提高特异性蛋白(Abrin)的增加，而不增加凝集素或杂蛋白的增加。从图1和图2还可以看出，采用酸化的S印harose4B可以滞留两种毒性成分，而S印harose4B只滞留一种毒性成分，由此结果分析，酸化S印harose4B亲和容量的提高是因为多滞留了一种毒性成分Pi，另外，采用酸化S印harose4B除去杂蛋白所需要的时间縮短，用S印harose4B亲和层析洗脱杂蛋白峰有较长的拖尾现象，按48ml/h.3ml/管计算，洗脱杂蛋白需要6h，而用酸化的S印harose4B洗脱杂蛋白只需要2.5h，可大大节省了时间。2、采用半乳糖梯度洗脱毒蛋白的同时将大量凝集素去除文献报道洗脱毒蛋白时都是使用半乳糖一次性洗脱(见图3、图4)，将毒素与凝胶素混在一起收集，以后再用凝胶过滤除去凝胶素，但很难完全去除凝胶素。本发明采用半乳糖梯度洗脱，在洗脱毒蛋白的同时就可以去除大量凝胶素，简化了纯化步骤.3、采用新型的DEAE-S印haroseFF离子交换介质获得两种毒蛋白成分经酸化S印harose4B得到的两种毒素混合物再经过DEAE-S印haroseFF离子交换层析，结果见图5;两种毒蛋白完全分开，并将极少量的凝集素去除。试验结果相思子毒素分离纯化过程中蛋白产率结果见表3。_表3从lOOg相思子种子中分离得到的蛋白馏分的产率_分离或纯化方式蛋白种类总蛋白(mg)~~蛋白收率(％)酸处理的S印harose4B杂蛋白2460.25Bi+B22800.28B34320.43DEAE-S印haroseFFPi740.07P21620.16从表3可看出，匀桨上清液产率为9.87%，粗提液产率约1%，最后层析纯化的Pi、P2产率分别为0.07%，0.16%，毒蛋白总产率为0.23%，而文献报道含量为0.19%,可见本发明的纯化方法在产率上得到很大提高。试验例1本发明方法所分纯化的相思子毒素(Abrin)的毒性及理化性质试验一试验材料1、实验动物昆明种小白鼠.雌雄兼用，体重20土2g;新西兰大白兔；购自海淀通利实验养殖厂。2、仪器DYY-II型稳压流电泳仪(北京六一仪器厂)，双垂直电泳槽(大连捷迈高新技术公司)，日立340型分光光度计(日立公司)，普通离心机(上海医用离心机厂)，日立835-50型氨基酸自动分析仪，ABI-491蛋白序列分析仪，ZabspecTlatformPlatform-ESI型质谱仪(英国质谱公司VGTOFSPEC)。3、试剂标准分子量蛋白，两性电解质(均为上海丽珠东凤生物技术有有限公司出品)，考马斯量兰R-250(Fluka出品)，甘露糖，丙稀酰胺，甲叉双丙稀酰胺(均为Sigma公司出品).SDS,苯酚，貼04等其它试剂(国产分析纯)。4、受试样品本发明实施例l所分离、纯化的相思子毒素(Abrin)。二试验方法131、分子量测定采用SDS-PAGE,HPCE，MALDI-TOF-MS检测。(1)SDS-PAGE，按Laemmli方法(Laemmli，V.K.CleavageofstructureproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，Nature,227:680-685,1970.)进行，按Weber方法测定分子量采用不连续垂直板状电泳，分离胶浓度为10%，浓縮胶浓度为4.0%，先于20mA电泳lh，待样品进入分离胶后，再调电流至40mA电泳3-4h，电泳完毕，凝胶条以考马斯兰R-250染色。(2)HPCE:使用未涂渍毛细管，电进样10KVX5秒，分离温度20'C，分离电压15KV,检测波长220nm，电泳方向由负到正。(3)MALDI-TOF-MS:实验条件如下激光能量为4档185:加速电压为23608V;检测器电压为1850V;线性方式，正离子量程，2mV;基质为CHCA。2.等电点测定IEF按照文献所公开的方法(张龙翔，张庭芳，李令媛主编生化实验方法和技术，高等教育出版社，1997，7)进行；两性电解质聚合于7.5%的凝胶中，正极电泳液为lmol/LH3P04，负极为lmol/LNa0H,恒压580伏，电泳2-3h,至电流接近于O.电泳完毕，从胶板一侧切下一条胶条，切成O.5cm的小块，用少量蒸馏水浸泡过夜，测定pH值，绘制pH-cm图谱。毛细管电泳使用涂渍毛细管,压力进样60sec，聚焦和迁移温度均为27°C,聚焦电压15KV,条件为电流到0.4uA，迁移电压为18KV.检测波长280nm，电泳方向由正到负。3.氨基酸组成分析日立835-50型氨基酸自动分析仪，样品经6NHCL1l(TC，&保护下水解24h，离子交换柱分离，茚三酮柱衍生检测。4、肽链N-末端测定ABI-491蛋白序列分析仪，反相柱填料为C18，采用Edman降解法测定。5、含糖定性定量测定定性测定采用SDS-PAGE分离蛋白后，用PAS染色，可定性显示糖蛋白条带。定量测定采用苯酚-H2S04法，以甘露糖为标准，以每克蛋白含糖量表示。6、血凝活性测定按孙册方法进行(孙册，大蒜凝集素的分离纯化及性质研究生物化学及生物物理学报19(3):188_194，1987)，采集兔抗凝血，1500rpm离心5分钟，去掉血浆,红细胞用生理盐水洗3次，按红细胞压积计算，配成2%的红细胞悬液，待测样品倍比稀释,然后加入等体积红细胞悬液,室温放置4h，肉眼观察结果，以能够引起红细胞凝集的最小浓度表示。7、毒性测定昆明种小白鼠，设4-7个剂量组,每组6-8只动物，新西兰大白兔，设4-7个剂量组，每组4只动物，受试样品(毒素)用生理盐水配成适宜浓度,静脉或腹腔给药后观察一周.实验结果用药理学计算与程序中的Bliss法计算LD5。。三试验结果1分子量测定(1)SDS-PAGE分析从图6可以看出，按本发明纯化方法得到的PKP2均达到电泳纯，用2-硫基乙醇处理后P2出现两条链.推测P:和凝集素P3均出现3条链.推测P,出现3条带可能是亚基的降解产物。图7为SDS-PAGE测定蛋白质分子量标准曲线，根据蛋白质的相对迁移率计算分子量，见表4表4所分离蛋白质和亚单位的分子量方法类别完整的蛋白亚单位SDS-PAGEPI68000360003300031000P2620003500029000P36600063000390003700031000HPCEP263000MALDI-TOF-MSPI64000(2)HPCE测定毛细管电泳鉴定h纯度，见图8。P2为单一峰，纯度达到95%，毛细管电泳测定分子量结果见图9、图10。从图9可以得到8种标准蛋白各自的相对迁移率，图10为标准蛋白各自的相对迁移率与其分子量的对数线性关系图，可以得到h的分子量为63000，与SDS-PAGE的实验结果相似，表明SDS-PAGE测定的P2的分子量数据可靠。(3)MALDI-TOF-MS分析PL的MALDI-TOF-MS检测分子量结果见图11。Pi分子量为64000，为单一成分。2.等电点测定(1)IEF结果图12为等电聚胶电泳pH-cm图谱(横坐标为从阴极到阳极的距离，纵坐标为pH值)，Pi，P2，P3的等电点分别为6.9，6.2，5.3;三种蛋白均为单一成分。(2)P2经毛细管等电聚焦电泳P2经毛细管等电聚胶电泳，见图13;可以得到P2的等电点为6.0-6.2。在聚胶过程中，由于氯离子的加入，阴极的pH值降低，电流逐步加大，已经聚胶成带的蛋白质逐步经过监测器，先是等电点最高的蛋白质，其它的依次通过。3、氨基酸组成分析从氨基酸组成分析，P2成分的大部分氨基酸，如Arg，Lys，asp，thrser，gil，leu，tyr，his的含量与文献报道的AbrinC，Abrina的相应氨基酸含量相似,而Giu含量比文献报道的结果高，Pro，Ala，Met，Iso，Val比文献报道的结果偏低，尤其是Pro，Ala.Met与文献报道的结果差异很大，Pro,Ala含量几乎为文献报道的1/3，MET为文献报道的1/5，原因可能是在酸水解过程中，部分MET被氧化破坏，因为氨基酸组成分析采用酸水解，全部的Trp，大部分Cys，部分Met被氧化破坏掉。4.N-末端分析P2由两条链组成，推测应出现两个N端，实际测得N末端序列只有一个，为IVEKS，与文献报道的Abrina的一级结构比较，此序列与Abrina的B链N末端相一致，所以P2的A链N-末端是封闭的,通过Edman降解法不能测定A链N末端.考虑到Abrina的A链N末端为Glu，推测P2的A链N末端封闭基团为焦谷胺酸，可能用焦谷胺酰氨肽酶处理，可以暴露A链N末端游离a-NH2。5.糖含量的定性定量测定SDS-PAGE凝胶电泳后使用高碘酸-Schiff试剂染色，确定亚基的含糖情况。P、A的2条链均为糖蛋白，而h只有1条链是糖蛋白，根据分子量判断，A链没有显示出来，所以P2的A链不含糖基或含极少量不能显示出来，以甘露糖为标准测得Pi,P2,P3的含糖量分别为9.4%，3.3%，10.5%。6.血凝活性以兔红细胞为凝血活性测定的材料，测得Pi,P2，P3引起红细胞凝集的最小浓度分别为19lig/ml，2.5ug/ml，0.3ug/ml。7、本发明所分离的云南Abrin与国外Abrin比较据理化性质分析，本发明所分离的h类似于Wei，C等人分离的AbrinA，Olsnes，S.等人分离Abrin,b，它们均为含糖量高，凝集红细胞活性低，等电点较高，毒性相对低的毒素。但是，从分子量比较，质谱检测h的分子量为64000，而AbrinA为60100，Abrinb为67000，差别很大。据理化性质分析，本发明所分离的P2类似于Wei，C等人分离的AbrinC、Olsnes，S.等人分离的Abrina，它们均为含糖量低，凝集红细胞活性高的毒素。P2的毒性结果，ip小鼠，观察期为3天，LD5。为4.02ng/kg，比文献报道的性质相似的毒素毒性高，AbrinCLD5Q为g/kg，Abrina的LD5。为10ug/kg，可能由于相思子种子产地的差异，分离纯化的毒素不同。。本发明采用5种方法(SDS-PAGE，HPCE，MALDI-TOF-MS，IEF，N-末端分子)鉴定毒素的纯度，Pi成分通过SDS-PAGE鉴定，完整蛋白为单一成分，但二硫键裂解后有3个亚基.通过质谱分析完整蛋白含有单一成分，所以h成分的3个亚基中有一个可能为肽链降解产物，可能是在样品保存或处理过程中形成的。h成分通过4种方法鉴定均为单一成分.综合毒性与理化性质分析，本发明分离的hP2可能为中国云南产相思子中特有的毒素，与文献报道的性质类似的毒素均有差异。印度学者分离的AbrinII被认为是目前毒性最大的相思子毒素，为LD5。2.4ug/kg(ip小鼠)，对S印harose4B无结合活性，而本发明所分离的P2成分却有很强的结合活性，显然两者并不相同。试验例2本发明所分离的相思子毒素体外抗肿瘤活性试验18一、试验材料受试样品本发明实施例1所分离的相思子毒素，白色粉末，用DMSO溶解;药品及试剂RPMI1640购自GIBCO公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT购自Sigma。细胞株KB(人口腔上皮癌)，KB/VCR(人口腔上皮癌耐药细胞)，A2780(人卵巢癌细胞)，A549(人肺腺癌细胞)，HCT-8(人结肠癌细胞)，Bel7402(人肝癌细胞)。A549/Taxo1(人肺腺癌耐药细胞)，CNE-2Z(人鼻咽癌细胞)，PC-3M(人前列腺癌细胞)，BGC803(人胃癌细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，CaEs-17(人食管癌细胞)(中国医学科学研究院肿瘤研究所)。仪器BIORAD550型酶标仪。二、试验方法MTT法测定收集生长良好的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基制成1X107ml细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔100ii1(含1000肿瘤细胞)，置37-C，5%0)2温箱内培养24h后加药，实验设空白对照及溶剂对照，阳性对照药为顺铂。受试样品设5-6个浓度，每浓度3个平行孔，置37'C，5%0)2温箱内培养4天。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/ml，RPMI1640配制)100u1，37。C孵育4小时。弃去上清夜，每孔加入DMS0150ul，溶解Fomazan颗粒，轻度震荡后，用550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长450nm下测定0D值。结果计算以药物不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC5。)。三、试验结果试验结果见表5。_表5MTT法人癌细胞杀伤实验结果(X土SD)瘤株IC5。(ng/ml)相思子毒素顺铂Bel7402(人癌细胞)0.000007±0.00000021.051±0.250HCT-8(人结肠癌细胞)0.000039±0.0000111.257±0.592CNE-2Z(人鼻咽癌细胞)0.000041±0.0000121.159±0.628MCF-7(人乳腺癌细胞)0.000047±0.0000030.489±0.016CaEs-17(人食管癌细胞)0.000063±0.0000090.585±0.151AM9(人肺癌细胞)0.000073±0.0000011.023±0.278PC-3M(人前列腺癌细胞)0.000088±0.0000092.341±0.996KB(人口腔上皮癌细胞)0.000349±0.0001991.076±0.108A2780(人卵巢癌细胞)0.000378±0.0000882.327±1.065BGC-803(人胃癌细胞)0.000528±0.0000871.541±0.421A549/T(人肺癌耐药株)0.000083±0.0000051.300±0.581KB/V(人口腔上皮癌耐药株)0.000083±0.0000151.267±0.049试验结果表明受试样品相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用。试验例3本发明所分离的相思子毒素对动物移植性肿瘤抑制作用的观察试验一、试验材料1、受试样品本发明实施例所分离的相思子毒素(Pi、P2)，白色粉末。2、实验动物中国医学科学院实验动物中心繁育的KM，C57BL品系二级实验动物和中国医学科学院肿瘤所生产的SPF级BALB/C系裸鼠。体重18-22g或16-18g(裸鼠)，合格证号分别为医动字第01-3001，01-3004号和京动许字(1999)第015号。实验动物设施合格证号为京动管准字(1994)第103号，动物实验设施合格证号为京动管准字(1996)第007号。二、试验方法每次试验分5组，即空白对照组(H2020ml/kg，PO)、阳性对照药组(环磷酰胺CTX30mg/kg，ip)，受试样品低剂量组(50ug/kg)、受试样品中剂量组(75ug/kg)、受试样品高剂量组(100ug/kg);口服给药，每组10动物，小鼠性别根据肿瘤性质采用雄性或雌性。每次试验的50只小鼠接种肿瘤后24h，将动物随机分为5组，每组10只，分组标号后，按体重计算给药剂量，并开始给药，每天1次，给药次、10次或14次。药效评定根据公式肿瘤生长抑制率=(1_治疗组瘤重/对照组瘤重)X100%如抑瘤率超过30%，则进行t测定三、试验结果试验结果分别见表7-表13。表7受试样品相思f^素对小鼠移植性肿瘤S180的抑瘤活性观察<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>与对照组比较，***P<0.001,**P<0.01表8受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤Ehrlish癌实体型抑瘤活性观察l跟J剂量，物数体重变化(g)瘤重g抑瘤率<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>相思转素0.075po1010相思f^素0.100po101018.5±1.222.9±1.91.51±0.1449.19.2±1.220.8±2.50.96±0.2064.77***与对照组比较，***P<0.001,*P<0.05表9受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤H22抑瘤作用观察船'J剂量麟动物数体重变化g瘤重g鹏率mg/kg錄始终始终(x土SD)("对照组恥20mlpo101019.2±1.223.6±1.62.19±0.92cn30ip101019.9±1.120.8±1.10.41±0.1881.28***相思a素0.050po101019.9±0.921.8±1.71.60±0.7126.48相思f4素0.075po101019.7±0.919.7±2.41.30±1.1740.64相思子毒素0.100po101020.3±1.221.0±3.30.44±0.2172.67***与对照组比较，***P<0.001表10受试样品相思子毒素对小鼠移植性肿瘤肺癌Lewis抑瘤作用观察M^J剂量^动物数mg/kg始终体重变化g始银瘤重g(x土SD)(%)对照组H2020mlpo101019.8±1.321.7±0.82.82±0.52CTX30ip101020.0±1.322.3±1.31.08±0.2361.700.050po101019.3±1.319.0±0.91.68±0.3940.43相思^t素0.075po101020.1±1.517.6±1.41.45±0.28*相思^4素0.10po101020.2±1.416.3±0.81.16±0.2658，86*林与对照组比较，***P<0.001表11受试样品相思子毒素对裸鼠移植的人成骨肉瘤OS732抑瘤作用观察船'J剂量mg/kg麟动物数錄始终体重变化g始沐瘤重g鹏率(x±SD)(%)22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>与对照组比较，***P<0.001表12受试样品相思子毒素对津白小鼠移植性乳腺癌CA891的抑瘤作用观察<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>与对照组比较，***P<0.001<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>与对照组比较，***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05对动物移植性肿瘤抑制作用的观察试验结果表明本发明所分离的相思子^t能^mWl^恸物移植性肿瘤的增殖活性。权利要求1、一种分离、纯化云南相思子(AbrusprecatoriusL.)毒素P1、P2的方法，包括(1)将云南相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B亲和层析柱，先用初始平衡缓冲洗脱掉杂蛋白，然后用半乳糖梯度洗脱液进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液的前面两个在280nm处有吸收的峰；(2)将步骤(1)所收集的洗脱液浓缩后加样于DEAE-SepharoseFF凝胶面上，先用洗脱平衡液洗脱掉杂蛋白；然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL进行梯度洗脱，分别收集在280nm处有吸收的前两个较大的峰，分别浓缩后进行脱盐处理，即得P1、P2。2、按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(1)中所述的酸化的S印harose4B亲和层析柱按照以下方法制备得到将凝胶S印harose4B酸化处理，经洗涤、脱气、平衡后装层析柱。3、按照权利要求2的方法，其特征在于所述的酸化处理是用盐酸处理凝胶S印harose4B5-6小时。4、按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(1)中所述的初始平衡缓冲液是10mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH=7.4;所述的半乳糖梯度洗脱液为含0一0.5mol/L半乳糖的磷酸盐缓冲液，pH二7.4;步骤(2)中所述的洗脱平衡液为10mmol/L的Tris-HCLpH为7.0;5、按照权利要求l的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的脱盐处理如下以规格为30X2.0cm的S印hadexG-25为脱盐柱，将浓縮液上脱盐柱后用水洗脱,流速为0.8ml/min,280nm检测，收集第一主峰。6、权利要求1-5任何一项方法所分离、纯化得到的云南相思子毒素。7、按照权利要求6的云南相思子毒素，其特征在于所述的相思子毒素由Pi和P2组成；其中，Pi分子量为64000，等电点为6.9，含糖量为9.4%;P2的分子量在62000-63000之间，等电点为6.0-6.2，含糖量为3.3%。8、权利要求6的云南相思子毒素在制备抗肿瘤药物中的用途。9、按照权利要求6的云南相思子毒素，其特征在于将所述的云南相思子^m加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的药物制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂。10、一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于该药物组合物由治疗上有效剂量的权利要求6所述的云南相思子和药学上可接受的载体或辅料组成。全文摘要本发明公开了分离、纯化云南相思子毒素的方法，包括将相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B亲和层析柱，先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后用半乳糖进行梯度洗脱，收集半乳糖梯度洗脱液；浓缩后加样于DEAE-SepharoseFF凝胶面上，洗脱杂蛋白，梯度洗脱，收集梯度洗脱液，浓缩、脱盐，即得。本发明方法利用两次层析就可以得到相思子的两种毒素蛋白纯品，不仅简化了纯化步骤，而且再纯度，产率上均有显著提高，为大规模的纯化奠定了基础。体外抗肿瘤活性试验和动物移植性肿瘤抑制作用试验结果表明，本发明所分离的相思子毒素对Bel7402等10余种肿瘤细胞均有很强的抑制作用，能有效的抑制动物移植性肿瘤的增殖活性。文档编号C07K14/415GK101560243SQ20081010421公开日2009年10月21日申请日期2008年4月17日优先权日2008年4月17日发明者红林,高南南申请人:高南南