具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白与编码基因及其应用的利记博彩app

专利名称：具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白与编码基因及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及蛋白及相应编码基因与其应用，特别是涉及在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护功能的蛋白与相应编码基因以及它们在制备鼠疫疫苗中的应用。
背景技术：
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的一种A类传染病，在历史上曾引起三次世界性的 大流行。2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病，多重耐药鼠疫菌株的产 生以及鼠疫菌可以用做生物武器和生物恐怖的可能给鼠疫菌的预防、治疗带来了困 难。有效的疫苗接种能够阻断鼠疫的传播，达到最终消灭鼠疫的目的。但是，迄今为 止，还没有一种能够在大范围内使用而且切实有效的鼠疫疫苗。目前已研究的鼠疫疫 苗包括灭活全菌苗、减毒活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗与核酸DNA疫苗等。灭活及减 毒活疫苗在20世纪亚洲鼠疫流行地区中的应用十分广泛，免疫原性与反应性的变异 以及短期的保护力意味着通过在整个疫区接种这类疫苗来防御鼠疫并不可行。鼠疫亚 单位疫苗和DNA疫苗的研究主要集中在鼠疫耶尔森氏菌已知的两个主要保护性抗原F1 (荚膜抗原)抗原(Andrews GP, Heath DG, Anderson GW, Jr., Welkos SL， Friedlander AM: Fraction 1 capsular antigen (Fl) purification from _Tej\si/ fa peso's C092 and from an ^sc力er/c力/s co7_z' recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge, i/ /ect /層/ 1996， 64(6) :2180-2187)和LcrV(V抗原)(Anderson GW， Jr., Leary SE， Williamson ED， Titball RW， Welkos SL, Worsham PL, Friedlander AM: Recombinant V antigen protects mice against pneumonic and bubonic plague caused by Fl—capsule—positive and -negative strains of rarsy/w.s /"/ecf /層/2 1996， 64(11) :4580-4585)上。Fl抗原由鼠疫耶尔森氏菌pMT 质粒上的Fl操纵子编码，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，起到抗吞噬细胞吞 噬的功能。Fl抗体通过阻断Fl蛋白的抗吞噬作用从而起到免疫保护作用(Du Y， Rosqvist R， Forsberg A: Role of fraction 1 antigen of yei-si/^'a /jesfis in inhibition of phagocytosis. Zn/e" /厕"2002， 70 (3) : 1453-1460) 。 V抗原是一 种多功能蛋白，与鼠疫耶尔森氏菌的抗吞噬能力有关，具有免疫保护和免疫抑制作用 (Pettersson J， Holmstrom A， Hill J, Leary S， Frithz-Lindsten E， von Euler-Matell A， Carlsson E， Titball R， Forsberg A， Wolf-Watz H: The V-antigen of fersi7w'3 is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation. #cJ #z.c_roZ iW 1999, 32(5) :961-976)。基于 鼠疫菌已知的具有免疫保护性的蛋白亚单位Fl与LcrV抗原基础上的疫苗对腺型鼠疫 具有理想的保护效果，由USAMRIID研制的Fl、 V融合亚单位疫苗已经在鼠和部分非人类灵长动物体内被证明对鼠疫有效；在英国，重组F1、 V蛋白联合亚单位疫苗己经 完成在人类的一期安全性试验，正在进行二期试验(Williamson, E. D., Flick-Smith， H. C. ， Lebutt, C. et a丄 Human immune response to a plague vaccine comprising recombinant Fl and V antigens, /"/e" /顺朋2005， 73(6) :3598-3608)。但是 这类疫苗对肺型鼠疫的免疫保护效果还有待进一步提高(M. L. Pitt, Animal Models and Correlates of Protection for Plague Vaccines Workshop, Gaithersburg, MD， 13 to 14 October 2004， http://www.fda.gov/cber/minutes /workshop-min. htm)，而且，Fr鼠疫菌株同样能在人类引起感染，LcrV抗原存在血 清学变异。除体液免疫外，细胞免疫是鼠疫免疫的一个重要的组成部分。同时能够刺激机体 产生体液免疫和细胞免疫的疫苗将能更有效地预防鼠疫。目前，关于鼠疫感染后细胞 免疫的研究还很少，最近的研究发现，鼠疫菌在感染过程中产生的T细胞免疫不仅仅 只针对Fl和LcrV蛋白，其它蛋白在鼠疫菌的细胞免疫保护过程中可能起到作用(Philipovskiy AV, Smiley ST， Vaccination with live Fersim'a pe边.s primes CD4 and CD8 T cells that synergistically protect against lethal pulmonary _K 戸"s infection. T) /"e" /應"2007， 75(2) :878-885)。 发明内容本发明的目的是提供在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且 能够产生免疫保护功能的蛋白。本发明所提供的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，是下述氨基酸残基序列之一 (氨基酸残基序列来源于鼠疫耶尔森氏菌C092株)1)序列表中的SEQIDNO:1 (YP00606);2)序列表中的SEQIDNO:2 (YP00612);3)序列表中的SEQID NO:3 (YP01914);4)序列表中的SEQIDNO:4 (YP03119);5)序列表中的SEQIDNO:5 (YP03047);6)序列表中的SEQIDNO:6 (YP00420);7)序列表中的SEQIDNO:7 (YPCD1.05c);8)序列表中的SEQIDNO:8 (YP01377);9)序列表中的SEQID NO:9 (YP03720);10)将序列表中SEQ ID NO: 1-9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的 取代、缺失或添加且仍具有免疫保护功能的蛋白。序列表中的SEQ ID NO: 1由480个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 2 由381个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 3由234个氨基酸残基组成；序 列表中的SEQ ID NO: 4由421个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 5由423 个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 6由328个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 7由129个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 8由177个氨基 酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO: 9由421个氨基酸残基组成。编码上述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO10的DNA序列(YP00606);2)序列表中SEQIDNO11的DNA序列(YP00612);3)序列表中SEQIDNO 12的DNA序列(YP01914)4)序列表中SEQIDNO> 13的DNA序列(YP03119);5)序列表中SEQIDNO14的DNA序列(YPO3047);6)序列表中SEQIDNO15的DNA序列aP00420);7)序列表中SEQIDNO16的D跳序列(YPCD 1.05c);8)序列表中SEQIDNO17的DNA序列(YP01377);9)序列表中SEQIDNO18的DNA序列(YP03720);10) 与序列表中SEQ ID NO: 10-18限定的DNA序列具有90X以上同源性且具有 免疫保护功能的核苷酸序列；11) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO: 10-18限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件可为用0. 1XSSPE (或0. 1XSSC) ， 0. 1%SDS的溶液，在65"C下 杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO: IO由1440个碱基组成，其开放阅读框架为自5，端第 1-第1440位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列的蛋白质；序 列表中的SEQIDNO: 11由1143个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端第1-第1143 位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的 SEQ ID NO: 12由702个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端第1-第702位碱基， 编码具有序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO: 13由1263个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端第l-第1263位碱基，编码具有序 列表中SEQIDNO: 4的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQIDNO: 14由1269 个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端第1-第1269位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQIDNO: 15由984个碱基组成， 其开放阅读框架为自5'端第1-第984位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 6的 氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: 16由387个碱基组成，其开放阅 读框架为自5'端第1-第387位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 7的氨基酸残 基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: 17由531个碱基组成，其开放阅读框架为 自5'端第1-第531位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 8的氨基酸残基序列的 蛋白质。序列表中的SEQ IDNO: 18由1263个碱基组成，其开放阅读框架为自5'端 第1-第1263位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO: 9的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及各种宿主均属于本发明的保护范围。扩增本发明基因中任一片段的引物对也是本发明要保护的。 本发明还提供了一种表达上述具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法。 本发明所提供的表达上述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法，是将上述含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的相应基因的重组表达载体导入宿主细胞内，诱导表达从而获得具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。所述宿主可为任一可表达外源基因的原核或真核细胞，如大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为A co7i DH5 a 、 ￡ c。h' BL21、 ￡ co7i ToplO、 ￡ coh' JM109、 ￡ coh. BLR、 ￡ coh. BLR(DE3)等。所述真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞或植物细胞等，包括C0S-7、 CH0、 BHK-21、 C0S2. 7、 VeroE6、 HeLa、 HEK293和酵母细胞等。所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(A'c/l^ pa"on's)。其中，所述巴氏毕赤酵 母优选为巴氏毕赤酵母GS115、 KM71 (购自美国Invitrogen公司)或SMD1168 (购自 美国Invitrogen公司)。用于构建含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组大肠杆菌表达 载体的出发载体可为pET载体系列、pQE载体系列、pGEX载体系列、IMPACT 系统与 Gateway系统pDEST载体系列等，包括pET-22b (+) 、 pET-32a、 pET-28a、 pET-28b、 pET-28c、 pET-21a(+) 、 pET-30a、 pQE-30、 pMAL-2、 pMXB10、 pDEST17、 pDEST15、 pDEST14 与pDEST24等。以pDET17或pET32a为出发载体，构建的含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋 白的基因的大肠杆菌表达载体可为pDEST17-YP00606、 pDEST17-YP00612、 pDEST17-YP01914、 pDEST17-YP03119、 pDEST17-YP03047、 pDEST17-YP00420、 pET32a-YPCD1. 05c、 pDEST17-YP01377和pDEST17-YP03720。用于构建含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组真核表达载体 的出发载体可为pcDNA3. l(-)、 pEGFP-Nl、 pcDNA (pcDNA3. 1 (+)等)、pCMV5、 pSilencel. 0-U6、 pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo、 pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82、 pAAh5等。 上述重组表达载体和表达菌株或细胞系均可按照常规方法构建。 培养含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的宿主细胞的培养基和培 养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿 主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度可为0. 01-5. OmM/L，优选为 1.0raM/L;所述诱导温度可为15-42°C，优选为28°C;所述诱导时间可为2-8小时， 优选为4小时。本发明具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白可用于制备鼠疫亚单位疫苗，编码该蛋白 的基因可用于制备鼠疫核酸疫苗。需要的时候，以具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白制备的鼠疫亚单位疫苗或核酸疫苗中还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN-Y)、 白介素2 (IL-2) 、 TGF-P4等一种或多种细胞因子或微生物的成分(CpG，脂质A，霍 乱毒素，脂蛋白，大肠杆菌不耐热肠毒素)作为免疫佐剂。此外，本发明具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白可以相互或与Fl和/或LcrV亚单位联合免疫或制备多价亚单位疫苗。本发明的疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂等多种剂型。上述各 种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。上述核酸疫苗和亚单位疫苗的用量可采用药学领域中核酸疫苗和亚单位疫苗的 常规剂量，并可根据实际情况调整。本发明提供了具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白及其编码基因。实验证明，本发明 的蛋白在鼠疫菌的感染和免疫过程中能够剌激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保 护作用。可以本发明的蛋白或基因为活性成分制备鼠疫疫苗，同时将本发明的蛋白相 互或与现有的具有免疫保护作用的Fl、 LcrV亚单位联合免疫或制备的多价亚单位疫 苗将能增强现有鼠疫疫苗的免疫保护效果和免疫保护范围。本发明为寻找鼠疫菌具有 免疫保护功能的蛋白提供了一种新手段，将在鼠疫的防治中发挥重要作用，应用前景 广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图
附1为体外抗原再刺激鼠疫菌EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN- Y的Elispot图 图2为101个鼠疫菌蛋白体外再刺激EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN- Y的情况 图3为具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白原核表达产物的12% SDS-PAGE检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物合成及测序工作均由上海生物工程有限公司完成。 实施例l、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的筛选用下述方法筛选具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，具体过程包括以下步骤 一、候选基因的挑选及在大肠杆菌中的克隆、表达通过PS0RTb、 SignalP和ProtcompB软件对鼠疫菌C092株(鼠疫耶尔森氏菌第 一株测序株)染色体上的4016个基因编码蛋白的细胞定位进行分析，结果有1006个 基因编码的蛋白为膜相关、分泌性蛋白；对这些蛋白的跨膜区通过TopPred软件进行 分析，由于含有多个跨膜区的蛋白难以进行体外表达，将所有跨膜结构区超过3个的 蛋白去除。结果430个基因编码的蛋白的跨膜区少于4个；在这430个基因中，结合 已有的对鼠疫菌的研究，挑选出190个已证明或推测的与鼠疫菌毒力相关的基因，加 上38个鼠疫菌脂蛋白以及33个鼠疫菌质粒编码的毒力相关因子共261个基因进行体外克隆、表达。Array Designer软件设计相应引物，利用Gateway克隆表达技术(参 见invitrogen公司产品手册)将基因克隆到表达载体pDEST17或利用酶切的方法将 基因克隆到表达载体pET32a上。结果174个基因能够在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达 相应大小的蛋白。将表达相应蛋白的基因克隆株接种在含氨苄青霉素(100lig/mL) 的LB培养基中，以lmM/L IPTG诱导重组融合蛋白表达，利用Ni-NTA层析柱纯化重 组蛋白。纯化出的蛋白以0.01MPBS透析，最后用BCA蛋白检测试剂盒(PIERCE公司 产品，具休方法参见产品说明书)检测蛋白浓度，用12% SDS-PAGE检测蛋白纯度。 最终101个蛋白在纯度与浓度上满足下一步进行细胞免疫功能检测的需要。二、 鼠疫菌EV76株免疫BALB/c小鼠模型的构建将26"C培养的鼠疫耶尔森氏菌活疫苗EV76株通过肌肉途径免疫6-8周龄雌性 BALB/c小鼠(5X10tFU/只，动物由军事医学科学院实验动物中心提供)，PBS组为 对照组。28天后鼠尾取血，ELISA检测血清抗F1抗体的滴度，结果EV76免疫小鼠抗 Fl抗体的滴度为1:6400-1: 12800，说明鼠疫耶尔森氏菌活疫苗EV76株免疫小鼠后 能够刺激小鼠产生针对鼠疫菌的免疫反应。免疫后第35天眼球取血处死小鼠，无菌 取小鼠脾。三、 Elispot试验筛选在鼠疫菌免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应的蛋白 分别将3只EV76免疫小鼠或对照小鼠的脾合并，200目的铜网分离小鼠脾细胞。利用Elispot技术(BD公司产品，具体方法参见产品说明书)检测步骤一获得的101 个重组表达的鼠疫菌蛋白(10ug/mL)体外刺激EV76株免疫小鼠脾细胞中能够分泌 IFN-y的细胞数，从而筛选能够刺激T淋巴细胞反应的蛋白。结果如图l、图2和表 l所示，以分泌IFN-y的细胞数大于100/106脾细胞为标准，34个蛋白能够明显的 剌激鼠疫耶尔森氏菌EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN- y 。 表1在鼠疫耶尔森氏菌EV76活疫苗株免疫小鼠体内能够刺激T细胞反应的蛋白基丙编号蛋白名称基R注释YPCD1.05sycEputative yopE chaperone sycE， yerA， yopE targeting proteinYPCD1.19YopKputative viruJence determinant protein, yopK， y叩QYPCD1.26cYopMprobable targeted effector protein ， yopMYPCD1.28YopDputative Yop negative regulation/targeting component, yopDYPCD1.31clcrVV antigenYPCD1.55cYscFputative type III secretion protein, yscFYPO0420putative lipoproteinYPO0302putative outer membrane fimbrial usher proteinYPO0606yapFputative autotransporter proteinYPO0612putative sugar binding proteinYPO0698- —outer membrane usher proteinYPO0962———hypothetical proteinYPO1303psaApH 6 antigen precursor (antigen 4) (adhesin)YPO1304psaBchaperone protein PsaB precursorYP01377lolA， lplAputative outer-membrane lipoproteins carrier proteinYP01435ompA， tolG， tut，putative outer membrane porin A proteinYP01613putative lipoproteinYPO1910yersiniabactin biosynthetic proteinYP01914ybtQ， irp7inner membrane ABC-transporter YbtQYP01993putative dehydrogenaseYPO2092putative phage proteinYPO2109hypothetical phage proteinYPO2120putative phage proteinYP02958sftjA， yftaAiron(HI)-binding periplasmic proteinYPO3015cysPthiosulfate-binding proteinYPO3047ydeNputative sulfatascYP03118adk， plsA， dnaWadenylate kinaseYP03119htpGheat shock protein HtpGYP03382gsrA， degP， htrA,global stress requirement protein GsrAYP03596putative lipoproteinYP03566degQ， hhoAYP03678tcaCinsecticidal toxin complexYPO3720shlB， hpmBhemolysin activator protein四、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的筛选在上述34个蛋白中，关于YPCD1. 26c、YPCDL 28、YPCD1. 31c、YPCD1. 55c、YP01303、 和YP03015免疫保护性的研究已有文献报道(Benner GE， Andrews GP， Byrne WR, et. al， Immune response to Yersinia outer proteins and other 1^57'/7/<3 / e5^i51 antigens after experimental plague infection in mice. J"/"ecf //mz/i// 1999， 67(4):1922-1928; Leary SE， Griffin KF, Galyov EE, et. al， Yersinia outer proteins (Y0PS) E， K and N are antigenic but non-protective compared to V antigen, in a murine model of bubonic plague, 必cro力/^/zog 1999， 26(3):159-169; Tanabe M， Atkins HS， Harland DN，et. al， The ABC transporter protein OppA provides protection against experimental lfer57./7_z.3 pes"s infection, // /ecf J層m 2006， 74(6) :3687-3691; Matson JS， Durick KA， Bradley DS, et. al， Immunization of mice with YscF provides protection from yej^j'/^'s pestis infections. 5iC必'croZ^'o7 2005, 5(1) :38);而YP02092、YP02109和YP02120 的编码基因位于鼠疫菌91001株(与进行鼠疫菌攻击试验所用菌株122株同属于布氏 田鼠型鼠疫菌，Song, Y. ， Z. Tong， J\ Wang, et. al， Complete genome sequence of ■Terw'/n.a pesfis strain 91001， an isolate avirulent to humans. DNA Res, 2004, 11:179-97)中缺失的33Kb大片段上，无法进行免疫保护试验。因此对表1中其余的25个鼠疫菌候选疫苗靶标的免疫保护进行研究。以CpG1826 (5' -TCCATGACGTTCCTGA CGTT-3')为免疫佐剂，在第0、 21、 35天以15ug蛋白+10ugCpG佐剂100ul免疫 BALB/c小鼠(10只/组)，同时以单独免疫10ug CpG或PBS的小鼠为阴性对照，以 15 u g LcrV+10 u g CpG佐剂为阳性对照。在初次免疫后60天以鼠疫菌122株(与已测序菌株91001株分离于同一鼠疫疫 源地。属于布氏田鼠型，此类鼠疫菌对小鼠具有强毒性，但对人类无致病力。与对人 具有致病性的鼠疫菌C092株和KIM株相比，其染色体上缺失一 33kb的染色体片段。 此菌株由青海地方病研究所分离，对BALB/c小鼠的半数致死量LD50为6CFU)进行免 疫保护性检测(攻菌量分别为20LD50和100LD50，攻菌试验在BSL-3中操作与观察)。 结果YP00606、 YP00612、 YP01914、 YP03119、 YP03047、 YP00420、 YPCD1. 05c、 YP01377 和YP03720能够明显保护小鼠抵御20LD50鼠疫菌的攻击(P〈0. 01，差异具有显著性)， 说明这些蛋白能够在鼠疫菌感染过程中起到部分保护作用。其中，YPO0606具有序列 表中SEQ ID NO: l的氨基酸残基序列，由480个氨基酸残基组成，其编码基因具有 序列表中SEQ ID NO: 10的核酸序列；YP00612具有序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸 残基序列，由381个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO: 11的核 酸序列；YP01914具有序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸残基序列，由234个氨基酸残 基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO: 12的核酸序列；YP03119具有序列表 中SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列，由421个氨基酸残基组成，其编码基因具有序 列表中SEQ ID NO: 13的核酸序列；YP03047具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸残 基序列，由423个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO: 14的核酸 序列；YP00420具有序列表中SEQ IDNO: 6的氨基酸残基序列，由328个氨基酸残基 组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO: 15的核酸序列；YPCD1. 05c具有序列表 中SEQ IDNO: 7的氨基酸残基序列，由129个氨基酸残基组成，其编码基因具有序 列表中SEQ ID NO: 16的核酸序列；YP01377具有序列表中SEQ ID NO: 8的氨基酸残 基序列，由177个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ IDNO: 17的核酸 序列；YP03720具有序列表中SEQ ID NO: 9的氨基酸残基序列，由421个氨基酸残基 组成，其编码基因具有序列表中SEQ IDNO: 18的核酸序列。实施例2、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的原核表达及表达产物的纯化 用下述原核表达的方法获得具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，具体方法为 利用位点特异性重组,通过Gateway克隆技术，将具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白相 应基因编码序列(YP00606、 YP00612、 YP01914、 YP03119、 YP03047、 YP00420、 YP01377 和YP03720)克隆入表达载体pDEST17(invitrogen公司)，得到具有免疫保护功能的 鼠疫菌蛋白的原核表达载体(分别命名为pDEST17-YP00606、 pDEST17-YP00612、 pDEST17-YP01914、 pDEST17-YP03U9、 pDEST17-YP03047、 pDEST17-YP00420、 pDEST17-YP01377和pDEST17-YP03720)，对于具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白YPCD1. 05c编码序列采用限制性内切酶的方法克隆入表达载体pET32a，得到具有免疫 保护功能的鼠疫菌蛋白的YPCD1. 05c原核表达载体(pET32a-YPCD1. 05c)。将表达载体 转染至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。挑取PCR鉴定阳性的单克隆，接种至5mL LB 液体培养基中，37°C、 150rpm培养12小时，然后按1: 100的比例接种于200mL LB 液体培养基中，在37。C、 150rpm下振荡培养，待0. D600=0. 8时，加入IPTG(终浓度 为lmM/L) ， 28"C诱导4小时。离心收集菌体，重悬于7mL细菌裂解液(50mM/L NaH2P04， 300mM/L NaCl， 10mM/L咪唑pH=8)。超声波裂解仪裂解细胞，通过高速低温冷冻离 心机10000rpm离心30分钟，将上清与沉淀分开，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。 以Ni合琼脂糖层析柱纯化相应蛋白，以包涵体形式表达的蛋白以包涵体复性液稀释 (0. 1M/L Tris. Cl， IraM/L EDTA, 1M/L Urea, 0. 25mM/L GSSG， 2mM/L GSH， 0. 4M/L L-Arg，pH=8)复性。所有纯化出的蛋白均以O. 01M PBS透析24h。用12% SDS-PAGE 检测表达蛋白的纯化效果，检测结果如图3所示(M:蛋白低分子量marker; 1: YP00606; 2:YP00612; 3:YP01914; 4:YP03119; 5:YP03047; 6:YP00420; 7:YPCD1.05c; 8:YP01377; 9:YP03720)，表明经表达获得了纯度较高的约52. 7KD、 45. 6KD、 28. 1KD、 50. 7KD、 50. 3KD、 38. 7KD、 32. 1KD、 22KD、 49. 3KD的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。序列表<160〉 18<210> 1〈211〉 480<212〉 PRT<213> 鼠疫耶尔森氏菌C092株〈400> 1Asn Gly Val Val Asn Asn Gly Arg Leu Asp Val Ser Ala His Ala Ser15 10 15Ala Gly Asp Ala Arg Ala Thr Gly Uu His Thr Leu Ser Ala Asn Pro20 25 30Gly Val Asp Pro Asp Pro Trp Asn Pro Ala Asn Pro Thr His L>eu Met35 40 45Ser Asn Asn Gly Ser Leu Ser Val Thr Ala Ser Gly Asn Asn Ala Thr50 55 60Ala Ser Ala lie Ser Thr Glu Gly Glu Gly Val Tyr lie Tyr Asn Asn 65 70 75 80Gly Thr Leu lie Val Asp Ala Phe Ser Glu Ser Ala Gin Gly Gly Ala85 90 95Ser Ala Tyr Gly lie His Val Leu Asn Gly Ser Ala Thr lie Asn Ser100 105 110Ser Gly Arg lie Leu Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ser Gin Gin Gin Ala115 120 125Tyr Glu Val Met Ala Asp Gly Ser Val Val Asn lie Glu Arg Tyr Thr130 135 140Leu Ala Leu Gly Asn Glu Thr Pro Trp Ala Val Ser Asn Gly Gly Ser 145 150 155 160lie Val Leu Gly Asn Gly Thr Gin Gly Ala A印Leu Val Leu Met Ala165 170 175Gly Gin Ala Ser Glu Gly Phe Ala Tyr Gly Lys Glu Tyr Ser Leu Asp180Tyr Asp Thr ThrAsn Leu Ala 195Ala Gly Leu Tyr185Gly Gin Gin SerSer lie 210Ser Gly Ser Ser Ser 225Pro Asp Val SerSer 200lie Thr Pro AspGly 215Ser Leu Gly Ser190Thr Val Gly Gly 205Lys Val lie HisSer 230Ala Gly Val Serlie 220Ala Leu Val TyrHis 245Met Glu Gin Ala Ser Asn lie lie 260Ala Gly Cys AsnAla 235Leu Ala Gin ArgAla 250Ser Gin Leu HisVal Ser Asn 275Val Phe lie Thr Pro290 Ser Gly 305His PheTyr Ser Gly GlySer Thr AspAspCysTyrGin 310 GinSer 265Lys Leu Glu SerSer 255 GinAla 240 SerLeuAla 295 ArgLeuGin 280Gly Glu Tyr ArgSer 270Asp Ser CysTyr GlyPhe 325Asn Gly Thr SerGly TrpPhe 340Leu Gly Val GinValHis 330 GlyLeu 315 GlyArg 300 LeuGlyLysAla 285Asp Pro Val ThrGly Gin Asn TyrGluThr Leu Met 355Phe lie Ala Ala Thr Ser 370Asp Ser Asn Thr Tyr 385Ser Ser Gly LeuVal Gly Arg 345Gly Met Lys LeuGly 360Trp Phe Ser SerThr 375Gly Val Gly SerGluSer 365 ThrSer 335 lieGin 320 AlaAsnTyr 390Thr Asp Val SerAsp 380Ser Gly SerGlu 350Glu Ser Leu Asp Tyr SerTyr 405Ala Met Thr ProGin 395Gly Asn Ser TrpAsn Arg Asn Tyr 420Gin Gin Arg Asp Gly Tyr Thr 435Val 410Val Gly Leu ThrVal 440Met 425Ser Ser Asn Asn 14Lys 445His 430 AsnTyrTyrGin 415 lieTyrAsp 400 LeuTrpAspLeu lie Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Tyr Ser Asp His Ala Val Ala Leu450 455 460His Ala Gly Val Arg Uu Asp Gly Arg Tyr Pro Uu Thr Asn Glu Thr 465 470 475 480〈210〉 2〈211〉 381<212> PRT〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株<400> 2Phe Met Arg Asn Thr Val Thr Pro Glu Phe Asn Lys Leu Tyr Pro Glu15 10 15Val Asn Leu Val Val Ser Asn Asp Glu Gin Leu Asp Thr Arg Met Ala20 25 30Ala Gly Asp Asn Pro Asn Val Tyr lie Gly Val Phe Gly Tyr Gin Pro35 40 45Ala Lys Leu Ala Lys Leu Gly Lys Leu Ala Tyr Leu Asp Lys Phe Pro50 55 60Gly Phe Ala Glu Leu Asn Glu Arg lie Asp Pro His Phe Leu Arg Glu 65 70 75 80Asn Phe Gly Arg Thr Tyr Tyr lie Pro Trp Asn Ala Thr Thr Gin Met85 90 95Met lie Tyr Asn Lys Glu Uu Phe Ala Glu Ala Gly Leu Asp Pro Glu100 105 110Arg Pro Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Leu Leu Ala Ala Glu Lys lie115 120 125Ser Ala Leu Pro Pro Arg Ser Asp Gly Ser Lys Val Tyr Gly Thr Val130 135 140Phe Trp Asn Asp Val Leu Ser Phe Gly Ser Trp Tyr Trp Asn Leu Leu 145 150 155 160Ala Pro Met Tyr Tyr Asn Val Asn Gin Gly Gin Tyr Gin Leu Leu Asn 165 170 175Arg TyrGin PheMet Glu 210 Gly Phe 225Val ValGly A印Lys AspLeu Met 290 Leu Pro 305Glu AlaPro PheSer LysThr Ser 370Gly Thr 180 Met Arg 195Lys SerGly T卬Gly Ginlie His 260 Glu Ala 275Arg AspThr LeuGin ProAla Asn 340 Val Val 355Ala GinAsp lie Val Phe Asp Arg Pro Asp Ala Asn Met Ala 185 190Thr Met GinPhe PheLys Ala 230 Asp Val 245Tyr SerArg LysAsp lieLys Ala 310 Phe Val 325Ala MetSer 215 ThrGin 200 ArgAlaAsn lieGin Arg Phe GlyLeu Ser SerAla lie AlaVal LeuGluAsn 295 LeuGin 280 LeuAsp 265Pro 250 GlyAla 235 lieMet 220 AlaAla 205 TrpProLeu ThrLeu Gin PheGlu Arg ProPro Val GinArg Ser Trp AlaAla lieGin Ala AsnGin Asp AlaGin Gin LeuGlu ValLeu Lys GlyAla Ala Arg 375Glu 360 GinAla 345 lieGin 330 AsnPro 315 Hislie 300 TyrLeu 285 AlaMet 270 CeuThr 255 lieAla lie Leulie lie LeuSer Pro GluLeu Leu AsnGlu 380Gin 365 HisAla 350AlaSer 335 AsnMet 240 LysPheAsn LeuLeu Gly GinPhe Gin SerAla 320 GluTyrVal Ala〈210〉 3〈211〉 234〈212〉 PRT〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株<400〉 3Glu Arg 1Met ProGlu GluAla Ala 50Thr Val 65lie SerAsn SerThr LeuGlu Val 130 Arg Leu 145Leu SerLys Asnlie GluAsn Arg 210 Ala Gly 225Phe MetGlu Arg20 Gly Asp 35Ser MetThr Lyslie GlyLeu lie 100 Leu Ala 115Glu GluPro GinGly GlyAla Pro 180 Ser Glu 195Thr Val Asn lieAla lie 5Tyr AspGly HisSer AlaLeu Leu 70Gly Val 85Ser ValAsn lieAla AlaGly Trp 150 Glu Arg 165Val ValLeu Alalie lieLeu Val 230AlalieAlaleu55MetAspValArgArg 135 LeuGinlieVallie 215 MetProArgLeu40ValArgliePhelie 120 AlaThrArgLeuGin 200 AlaGluLeuPhe25AsnGlyTyrArgGin 105 AlaAlaProlieAsp 185 LysHisGluPro10AspHisAlaAlaArg90AspArgGinMetSer 170 GluAlaArgGlyValAsnValSerAsp75LeuValProCysGly 155 lieProlieLeuAlaValSerGly60ProThrTrpGinLeu 140 GluAlaThrAspSer 220GluSerCeu45AlaGinProLeuAla 125 GluMetArgAlaAsn 205 ThrGinTyr30ThrGlyGinGluPhe 110 ThrPheGlyAlaAla 190 LeulieSer15ArgPheLysGlyGin95AspArglieGlyLeu 175 LeuValAlaGluTyrProThrGin80LeuAspGinSerGin 160 l>euAspHisGly〈210〉 4 〈211〉 421 〈212〉 PRT<213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株 〈400〉 4Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe lie Val Ala Asp Lys Val Thr<image>image see original document page 18</image>Ala Lys Leu Leu Arg Phe Ala Ser Thr His Thr Asp Ser Ser Ala Gin275 280 285Thr Val Ser Leu Glu Asp Tyr Val Ser Arg Met Ala Glu Gly Gin Glu295 300 Ala Asp Ser Tyr Ala AlaGlyLeuVal 290lie Tyr Tyr lieLys 305Pro His Leu GluSer Asp ArgAsp LysLeu 325 AspAla 370Pro Phe Val GluGlu 385Asp Val Arg LeuThr Asp Ala Asp 420Thr 405 GluThr 310 PheGluAlaGly Lyslie 340Phe Gin SerAla 355Asp Glu Glu AsnArg Lys Trp MetSer Tyr Ala 315Lys Gly lie Glu Val Leu 330Ser Tyr Leu ThrMet 345Lys Ala Asp AspSer Ser 320 Leu Leu 335Phe GluVal Ser 360Pro Glu Gin Gin Glu Ala 375 380 Val Lys Thr Leu Leu GlyArg 390His Arg Leu ThrSer 365 GluGluGlu 350Leu Asn Lys Lys Ala Leu ArgLeu Leu Gly Glu Arg Veil Lys 395 400Asp Thr Pro Ala lie Val Thr410 415〈210〉 5〈211> 423〈212〉 PRT〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株〈400〉 5Ser Thr Pro Thr Leu Leu Ser Leu Met Asp Glu Gly Val Arg Leu Thr15 10 15Asn Gly Tyr Val Ala His Gly Val Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala lie20 25 30Met Thr Gly Arg Ser Pro Ala Arg Phe Gly Val Tyr Ser Asn Thr Asp 35 40 45Ala Gin Asn 50Gin Asn Asn 65Lys lie SerAsnTyrVal 85 ThrLeu 55Thr Ala Ala lieGly lie Ser Leu Glu Glu Thr Phe Leu Pro Glu Leu Leu GlyTyr 70Pro Val ProLeu 60Lys Trp HisGly 75Glu Gin Thr ArgHis Asp Asn Phe 100Gin Tyr Phe MetArg Gly Phe 115Tyr Asn Ser Pro Ser Leu 130Gly Tyr lie Ser Asp 145Arg Ala Lys SerGlu Ala 90Thr Tyr Ser Ala Asp Glu Trp Gin 105Tyr His Ala AlaPhe 135 LeuGly 120 HisThrGin 150Asp Glu ProAsn Lys Asp GluLeu 165Pro Asn Asp AsnGluAla 155 MetGly 125 ValPro 110 ThrLysArg 140lie Gly ValLeu Ser 80 Asp Tyr 95Gin Asn Ala Tyr Ala LysAla Pro His Leu 180Thr Gly Ser GinHis Phe Asn 195Tyr Ser Val Asp 210Asn Gly Gin Tyr 225Ala Val lie AspPhe Met 170 Pro Ala 185Ala Asp Asn PheTyr AspPro Asp GluAla Asn 160Leu Ala Tyr Ser 175Gin LysThr 200Lys Arg Leu LeuGin Gly Val 215Thr lie lie MetGlu 220 ThrTyr 190Tyr Ala Ser Val 205Gin Leu Lys LysSerLys Ser Gin Thr 260Lys Leu Gin ThrTrp Lys Gly 275Met Asp Phe Met Pro Thr Ala 290 295 Asn Asn Leu Asp Gly Val Ser LeuAsp Asn Thr lie lie Met Phe 230 235 Gly Pro Leu Pro Leu Asn Gly Asn Gin 245 250 Phe Pro Gly Gly Thr His Thr Pro Met 265Asn Tyr AspAsp LysAsn Gly 240 Gly Tyr 255lie TrpGly 280Leu Glu Ala AlaLeu Pro Tyr 20LysGlu 300 LeuLeu 285 liePhe 270lie Ser AlaAsp Ala Pro Thr Gly Lys Ser305Lys Ala Glu ProTrp PheVal ArgLeu Ser 370 Tyr Thr 385Asn GinAspAsn 355 GinTyrLysGlu 340 GluMet Gin AlaHis 325 GluGinGlu 420Asp 405 Met310LysPhe Ser Tyr Glu GlyAsn 390 LeuTyr Leu ThrAsn lie ProSer AsnGlu Tyr 360 Thr lie 375Lys LeuArg Asn<210> 6〈211〉 328<212〉 PRT<213> 鼠疫耶尔森氏菌C092株Phe 345 ProArgAsnAla Ser Thr315 Trp Val Thr 330Trp Asp GlyLys Asn ProSer Asn Asp 380Leu Tyr Lys395 His Pro Asp 410320Ser Tyr Thr His 335Tyr His Lys Phe 350Asn Thr Glu Asp 365Tyr Ser Leu ThrLeu Ser Asp Leu 400Val Val Lys Val 415<400〉 6Pro Glu Thr Val Glu Ser Val Arg Pro Val Lys lie Phe Met Val Glu15 10 15Asp Ser Gly Gin Asn Gly Thr Arg Tyr Phe Pro Ala Arg Leu Gin Ala20 25 30Gly Asp Glu Thr Gin Leu Ser Phe Lys Arg Gly Gly Gin Leu Gin Glu35 40 45Leu Leu Val Arg Glu Gly Glu Gin Val Lys Lys Gly Gin Lys lie Ala50 55 60Met Leu Asn Asp Thr Asp Leu Ser Leu Arg Val Arg Asp Arg Gin Ser 65 70 75 80Thr Phe Asn Leu Ala Arg Asp Gin Phe Asn Arg Phe Asn Thr Leu GinGly Arg SerMet GluAsp Ala 130 Val Arg 145Ser AlaSer 115 ThrAla 100 Ala85 ValSer Arg AlaGin Ala Alalie lie AlaAsn His GinLeu AspPhe Thr ThrLeu AsnThr Thr 210 Met Lys 225Val ArgHis 195 SerLeu 180 MetThr 165 AspVal 150 LeuPro 135 MetLeu 120 PheAsp 105 Asp90 LeuAsp lie Arglie Ala Arg Asp Gly lieAla AlaAsp Val Vallie Ser AsnPro Gly ArgThr Thr SerArg Pro Alalie Asnlie Val ProAsp Ala Arg 275Glu Glu Arg290 Val Thr Ser 305Gly Glu LeuVal 260 ValLysGlyArgSer 245 GluAsp 230 GlyAla 215 MetGlu 200 SerArg 185 PheGlyPhe 170 AsnGin 155Serlie 140 ProLys 125 AlaArg 110 Glu95Ala Glu Leu SerAsn Val AsnVal AlaVal Pro GluTyr Lys Prolie Ala GluGin Thr PhePro Leu LeuAsn Leu SerAla Val PheTrp Val lieVal GinLeuPro 325Ala 310 GinVal 295 AspLys 280 GlyAsn 265 AsnGly 250 ProSer 235 ThrGin 220 GlyTyr 205 ValThr 190 LysThr Leu 160 Arg Leu 175Vsl Leu Glu HisThr Leu Thrlie SerAsp His Pro Asp HisAsp Asn AspGin Leu ValGly Glu Ginlie 315Glu 300 ValAla Gin 270 Gin Met 285Asn GlyGly Arg 240 Thr lie 255Leu Asn His Val lie GinAla Ala Gly Thr 320Gin Val<210> 7<211〉 129 〈212> PRT〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株 〈400> 7Tyr Ser Phe Glu Gin Ala lie Thr Gin Leu Phe Gin Gin Leu Ser Leu15 10 15Ser lie Pro Asp Thr lie Glu Pro Val lie Gly Val Lys Val Gly Glu20 25 30Phe Ala Cys His lie Thr Glu His Pro Val Gly Gin lie Leu Met Phe35 40 45Thr Leu Pro Ser Leu Asp Asn Asn Asp Glu Lys Glu Thr Leu Leu Ser50 55 60His Asn lie Phe Ser Gin Asp lie Leu Lys Pro lie Leu Ser Trp Asp 65 70 75 80Glu Val Gly Gly His Pro Val Leu Trp Asn Arg Gin Pro Leu Asn Ser85 90 95Leu Asp Asn Asn Ser Leu Tyr Thr Gin Leu Glu Met Uu Val Gin Gly100 105 110Ala Glu Arg Leu Gin Thr Ser Ser Leu lie Ser Pro Pro Arg Ser Phe 115 120 125Ser〈210〉 8 〈211> 177 〈212〉 PRT〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株 〈400〉 8Ala Ser Thr Asp Leu Gin Asn Arg Leu Ser Lys Val Asn Ser Phe His 1 5 10 15Ala Ser Phe Ser Gin Ala Val Thr Ser Ser Asp Gly Ala Val Val Gin 20 25 30Glu Gly Glu Gly Glu Leu Trp Val Lys Arg Pro Asn40Ser Val LeuHisGlu 35Thr Ser Pro AspMet 50Trp Phe Tyr AsnLeu 65Lys Asn AlaGlu 55Phe Val Glu GinLeu Phe Asn Trp 45Asp Gly Glu ThrPro 70Asn Thr ProThr Gly 85Pro Asp Asp Trp Lys Gin Tyr Asn 訓Pro Lys Ser AlaGlu Leu Thr 115Thr Pro Ser GlySerVal 130Gly Gin Arg SerAsp 145Val Asp AlaThr 135 TyrSer Lys 165Ser 120 lieThrAla 150Phe Thr PhePhe Met 90Val Lys 105Gly AsnLys SerLeu LysThr Pro 170lie Ser 60Ala Thr Ala Thr Trp 75Leu lie Thr ArgGin Lys Leu LysAsn 95 AspLeu80AsnPheGly Asp 110Gin Phe Ala lie 125Ala Val Glu GinPhe Thr 140Ser Gin Gin Ser Ser 155Pro Lys Gly VaJ Thr 175Val 160 LeuAsp〈210〉 9 〈211〉 421 〈212〉 PRT<213> 鼠疫耶尔森氏菌C092株 <400〉 9Gin Gin lie Thr Gin His Asn Thr Gly Gin Ser Glu Leu Ser Arg Pro15 10 15Ala Pro Pro Ala Pro Val Leu Pro Glu Asp Thr Gin Cys Leu Pro lie20 25 30Asn Gly Val Tyr lie Gin Gly lie Thr Leu Leu Thr Glu Asp Asp Leu 35 40 45Ser Glu Leu Ser Ala lie Pro Glu Gin Cys lie His Pro Asp Asn lie50 55 60Asn Leu Leu Thr Arg Glu Leu Thr His lie Tyr Met 65lie Thr Ala ArgPro 55Glu Leu Thr His 70Gin Phe lie ProGly Leu Thr GlyAsp lie 100 Leu Asp 115lie Thrlie 85Thr Glu Gly Phelie Tyr75 Pro Asp 90Glu AlaAlalieGly ArgVal 105Phe Pro Asn MetLeu Asn 130Pro Ser Asn Lys Val 145Gly Ser lie LeuGlu Thr Val 120Gin Gly Leu AspLeuAsp 135Thr Val Asp lie 150Leu His Asn ThrGin 140 GlyAsp Lys Gly Tyr 80Asp Gly Lys Leu 95Asp Ser Thr Asp 110lie Gly Lys Pro 125Ala Asn Arg LeuLys 165Asp Asn Tyr GlyThr Thr Ser Met 180Ser Arg Asn Ala Leu Ser Phe 195lie Asn lie 'SerAsn 185 AsnVal Ser 210 Ser Arg 225Phe SerAsp 200Thr Val Asp ArgAla Tyr Gly PheSerMet 230 SerAsn 215Phe Tyr SerLeu Pro Gly Thr Leu Pro Gly 155 160 Pro Ser Thr Pro Trp His Leu 170 175 Lys Asn Thr Gly Lys Trp Leu 190Pro Leu Gly Leu Ser Asp Ser 205Gin His Asn TyrGly 245Ala Lys Leu HisGin Phe Asn Thr 260Arg Ala Asp Tyr Val Phe Tyr 275Gin Leu Thr TyrVal Pro 235Tyr Ala Glu Tyr Arg 250Glu ThrPro 220 TyrTyrGinGly 265Asp Gin Ser GinSer Ala Gin Leu Thr Tyr Lys 290 295 Lys lie Ala lie Ser Ser Pro Thr LeuArg 280Arg Ala Ser AsnGly Ala Leu Thr 240Pro Met Lys Leu 255Gin His Gly Leu 270lie Asn Gly Leu 285Leu Asn Glu GluThr lie25Tyr 300Phe Glu Leu Gly Leu305Asn His Leu His Val 325Leu Glu Gin Gly Leu 340Leu Ala Asn Tyr Gin 355Thr Ser Asn His Tyr 370Asn Gin Phe Tyr Gly 385Trp Leu Ser lie Thr 405Thr Leu Ser Ala Asp 420310Leu Pro Met GlyPro Trp Leu Gly 345Asp Ser Gin Phe 360Phe Ala Leu Phe 375Gin Tyr Thr Arg 390Asp Ser Ser AlaLeu 330 AlaThrAspAsplie 410315Phe Asn lie AsnGlu Arg Lys AlaSer320 Val Ser 335 Asn Gly Pro 350Thr Ser lieAsp Thr 380Arg Leu Pro Gly 395Arg Gly Phe SerLys 365Tyr Leu Phe SerVal Glu 400 Arg Asn 415〈210〉 10〈211〉 1440〈212〉 ■〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株〈400〉 10組ggcgtggcgggc獄cgcccgctaaccaacaatgcgaggg織ctgaattcatgtgcaccggcggaagaacgctataatcgtgctggg犯ggtttcgggccagcagaaaggtgattcccggatgtcttccaatatcstc犯c犯tgg gcctgcatac ccactcatct ccgcaagcgc tcgttgatgc tcaacggc6Lg gccaacagca cactcgcctt gtaacggtac cctatggtaa gt已cggtggg acagcggtag ctcatgccgg tctcctcgca gtgccgatag cctccggttaccgtctggat cctctctgcc gatgagcaac gatcagtacc atttagcgag tgccacgatc agcctatg犯 ggg認tgag gcaaggggcc agagtacagc gggttctatt cagcagtagt agtctccgca ￡tctgcatagt ctgcgtcttt cagcggtcaggtcagtgctc aacccaggcg aatggctcgt g鄉gcgaag3gtgCgC3ggaactccEigcg gtgatggccg acaccgtggg gatctggtgcttggBCei￡LtCgcggggttgt tcgttgggat ttggceicsgc C3gctggtaa atceLcacctt cgctatgggg26atgccagtgc tcgatcccga tgtcagtcac gggtctacat gcggtgcatc gcagaatttt acggttcggt cggtcagtaa tgatggctgg tggcttacga acggtattac ctgctgcact gttcttccat gt犯cgccgg atgctggtg已 tattgctcggtggcgatgca tccatggaac ggccagcggt ctacaacaac cgcctatggt ggcgacagcc agttaatatt tggcggttcg gcaggccagt taccacctcc gcctgatatc ggtgtatgca ggagceiggca ttgtsaccag gtaccgtcgt tcagaaccaa60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960cattttggcgatttccagcttggctggcacggcggttatg卿gtgcc已gcaccgatttt1020aatggtacctctgtagggcgtaagg鄉3gattaatacgctgatgctgggggttcagggc1080ggaatg犯gctctctgagagtctgtttattgc3gcg3cca<gtacgtggttcagcagtgac1140accgattacagtgacagcaatacctactacggcgtgggcagccagagcggcagctatgat1200agcagtggcctctacaccgatgtctccgtgggtaatagctggcagttg犯tCgC3ELCtat1260gccatgacaccgatggtcgggctgacgcatatctggcagc^CgCg3tggctatactgtc1320tcatccaataac aaaaac t atgatcttatcgacacccgct3tagC3gCt3cgtgcgaccat1380gcagtcgctctccatgctggagtacgtctcgatggtcgctatccactgacc犯cgagaca1440〈210〉 11〈211〉 1443<212> ■<213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株〈400> 11tttatgcgtaataccgtcacccctgaatttaataagctctatcccgaggttaatttagtg60gtatccaatgacgaac^ctggatacccgaatggccgccggggataaccccaatgtttac120atcggtgtattcggctatcaaxxcgcc^actggcg犯gcttggcaagctggcgtatttg180gataaattccccggttttgccgaattaaatg犯cgtatcgatcctcacttcttacgcgaa240aactttggccgt￡LCCt￡Lttatattccgtggcccagatgatgatttataat300aaggagctatUgctgaggcCCtg3gCgCCctccagcgacctgggatg犯360tttttactggcggccgaaaagatctccgccttgccccctcgctc聊cggtagcaaagtc420tacggcacggtattctggaatgatgtgctgtcattcggcagttggtactggaatctgctg480gcacccatgtattac犯cgttaatcagggccagtatcagttgcta犯ccgctacggtacc540gacatcgt已ttcgaccgtcccgacgccaacatggcgcagtttatgcgtaccatgcagc￡Lg600gcgcagcgctttgcgccactgaccatggaaaaaagcttcttctcccgtaatatcggcatg660tggctacaattcggcttcggctggaaggccaccctctcgtcggcggctgaacgcccaatg720gtggt鄉cc3gg3CgtggCcatcgccccgatcccggtac￡L￡L8LCC3￡lgggcgacatccac780tactcggtattggatggtcgggccatcatgattttcaaggatg鄉ccagg￡Laaga<gc￡La<840ctcagttgggcgctgctcaacctacttatgcgcgacgateitcaatctscaggccaatatt■gccctgggtcagctccctacgttgaaggcgctgcaagatgctccctattttcagtccgca960gaggcscagccgttcgteicacatgcgatcctgsgtgsgcctttcgccaat1020gcgatggaggtggcg犯tattattctcgcc犯ctacagcaaagtggtactga^gggga^1080atatccccggaacaagcggttgccacctcggcac鄉ccgcacgccaactgctc犯tg犯1140C3C1143〈210〉 12〈211> 702〈212〉 DNA〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株<400> 12
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〈210〉 13 <211〉 1263 〈212〉 DNA
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株 〈400〉 13
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〈211〉 1269
〈212〉 腿
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株
〈400〉 14
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1269
〈210〉 15
〈211> 984
〈212〉 腿
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株
〈400〉 15
cctgaaaccg tcgaaagtgt gcgcccagta aaaatcttta tggtggaaga cagcgggcaa 60
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〈210〉 16
〈211〉 387
〈212〉 DNA
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株
〈400〉 16
tattcatttgaacaagctatcactcaatta tttcaacaac tttcgttgtctattccagat60
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ctaatctcaccaccacggtcatttagt387
〈210〉 17
〈211〉 531
〈212〉 DNA
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株
<400〉 17
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〈210〉 18
〈211〉 1263
〈212〉 DNA
〈213〉 鼠疫耶尔森氏菌C092株
〈400> 18
c犯cagatcacacaacacaacaccggacaaagtg犯ttatctcgtccggccccccctgca60
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caacataattatagccgtgcttactcaatgttttattcggtcccttacggtgccttgacc720
tttagtggctttggtagttatgccgaataccgttatccaatga犯ttgc已gtttsataca780
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tggctcagcatcactgacagcagtgccatccgtggctttagccgcaataccttatccgcc1260
权利要求
1、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)序列表中的SEQ ID NO4；5)序列表中的SEQ ID NO5；6)序列表中的SEQ ID NO6；7)序列表中的SEQ ID NO7；8)序列表中的SEQ ID NO8；9)序列表中的SEQ ID NO9；10)将序列表中SEQ ID NO1-9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且仍具有免疫保护功能的蛋白。
2、 编码权利要求1所述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 10的DNA序列;2) 序列表中SEQ ID NO: 11的DNA序列;3) 序列表中SEQ ID NO: 12的DNA序列;4) 序列表中SEQ ID NO: 13的DNA序列;5) 序列表中SEQ ID NO: 14的DNA序列；6) 序列表中SEQ ID NO: 15的DNA序列;7) 序列表中SEQ ID NO: 16的DNA序列；8) 序列表中SEQ ID NO: 17的DNA序列;9) 序列表中SEQ ID NO: 18的DNA序列;10) 与序列表中SEQ ID NO: 10-18限定的DNA序列具有90X以上同源性且具有免疫保护功能的核苷酸序列；11) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO: 10-18限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3、 含有权利要求2所述基因的表达载体。
4、 含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。
5、 含有权利要求2所述基因的宿主菌。
6、 一种表达权利要求l所述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法，是将含有 权利要求2所述编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组表达载体导入宿主 细胞，表达得到具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于用于构建含有权利要求2所述编 码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组大肠杆菌表达载体的出发载体为 pET-22b(+)、 pET-32a、 pET-28a、 pET-28b、 pET-28c、 pET-21a(+)、 pET-30a、 pQE-30、 p亂-2、 pMXB10、 pDEST17、 pDEST15、 pDEST14或pDEST24。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于以pDEST17或pET32a为出发载体，构建的含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的大肠杆菌表达载体为 pDEST17-YP00606、 pDEST17-YP00612、 pDEST17-YP01914、 pDEST17-YP03119、 pDEST17-YP03047、 pDEST17-YP00420、 pET32a-YPCD1. 05c、 pDEST17-YP01377和 pDEST17-YP03720。
9、 权利要求1所述的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白在制备鼠疫亚单位疫苗中 的应用。
10、 权利要求2所述编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因在制备鼠疫核酸 疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生细胞免疫保护功能的蛋白与编码基因及其在制备鼠疫疫苗中的应用。实验证明，本发明的蛋白在鼠疫菌的感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护作用。可以本发明的蛋白或基因作为活性成分制备鼠疫疫苗，同时将本发明的蛋白或基因相互或与现有的具有免疫保护作用的F1、LcrV抗原或基因联合免疫或制备重组融合多价亚单位疫苗或DNA疫苗将能增强现有鼠疫疫苗的免疫保护效果和免疫保护范围。本发明为寻找鼠疫菌具有细胞免疫保护功能的蛋白提供了一种新手段，将在鼠疫的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C07K14/24GK101245100SQ20081010314
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者蓓 李, 杨瑞馥, 王效义, 郭景玉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所