专利名称：：可溶性猪水疱病vp1抗原的制备方法
技术领域：
：本发明涉及猪水疱病VP1抗原的制备方法，更具体地，涉及可溶性猪水疱病VPl抗原的制备方法。
背景技术：
：猪水泡病(SwineVesicularDisease,SVD)是由小RNA病毒科肠道病毒属的猪水泡病病毒(SVDV)引起的猪的一种急性传染病，其临床表现为口鼻腔黏膜和蹄部等出现水泡或溃烂，与猪口蹄疫极其相似，极易误诊，因而其防治引起了人们广泛关注。目前，我国已经消灭了猪水泡病，因此利用完整病毒粒子建立诊断方法存在潜在的散毒危险，在实践中不可取。SVDV基因组含有一个大的开放阅读框架，编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白，其中编码的结构蛋白为VP4(IA，69aa)、VP2(1B，261aa)、VP3(1C，238aa)和VPl(1D，283aa);非结构蛋白为2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。SVDV粒子衣壳由4种结构蛋白构成，VP4为内壳蛋白，VP2、VP3和VP1为外壳蛋白。对SVDV结构蛋白的研究发现，病毒的中和性抗原位点在病毒的外壳蛋白上，其中VP3和VP1是诱导中和性抗体产生的主要抗原蛋白。进一步研究证实，VP3和VP1不仅为序列依赖性抗原多肽，而且还具有抗变性作用。有的研究者认为结构蛋白VP1的87、88位残基为一中和性抗原位点；有的认为VP1的l-40位氨基酸残基为一中和性抗原位点；还有人认为VP1的95、98位氨基酸残基为一中和性抗原位点。以上研究成果表明SVDV的抗原中和位点应集中在结构蛋白VP1上。大肠杆菌是目前应用最为广泛和高效的外源蛋白表达系统，但外源蛋白常以无活性的包涵体形式存在，只有经过变性和复性等过程才能部分恢复重组蛋白的生物学活性，且蛋白的复性效率一般不超过30%，因此限制了重组蛋白在科学研究中的应用。
发明内容本发明要解决的技术问题是在大肠杆菌中表达产生生物学活性良好的可溶性VPl蛋白，减少包涵体的形成，避免复杂的变性和复性过程。为解决上述问题，本发明一方面提供了一种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VPl抗原的方法，所述方法包括以下步骤(l)克隆VP1基因；(2)构建rVPl;(3)诱导rVPl表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白。其中诱导剂为IPTG,其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。优选IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。其中诱导温度为16-20°C。优选诱导温度为18°C。本发明另一方面提供了一种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VPl抗原的方法，所述方法包括以下步骤(l)克隆VPl基因；(2)构建rVPl;(3)低浓度诱导剂和低诱导温度诱导rVPl表达产生可溶性VPl蛋白；和(4)纯化可溶性VPl蛋白。其中所述诱导剂为IPTG,其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。优选IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。其中所述诱导温度为16-20°C。优选诱导温度为18°C。本发明的有益效果在于在大肠杆菌中表达产生了可溶性VPl蛋白，纯化所得VPl蛋白纯度高，免疫学特性与SVDV粒子相似，可替代SVDV粒子作为检测用抗原建立敏感、特异、安全和可靠的SVDV血清抗体的间接ELISA检测方法。具体实施方式实验试剂和材料亏1物的合成和测序由Takara公司完成，组织总RNA提取试剂盒、扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高4呆真的7b《酶、限制性核酸内切酶(五co/M、屈o/I)和T4DNA连接酶均购自Takam/>司；酶标仪、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪和羊抗鼠IgG、底物TMB、诱导剂IPTG、核酸电泳和蛋白电泳所用试剂均购自Sigma7>司；Ni-NTAHis*BindResin层析柱填料、超滤浓缩管和咪唑购自安玛西亚；96孔板和血清管购自深圳金杣华有限^^司；紫外分光光度仪、蛋白质电泳仪和酶标仪购自Bio-lab公司。VP1基因的克隆VP1基因的克隆按照以下步骤进行(1)病毒RNA的提取参照试剂盒操作提取病毒RNA;(2)反转录65t:预热提取的总rna10mL和片段下游引物1JUL10min，水浴5min，加入5倍量反转录緩沖液4|iL、dNTP2(iL和AMV1pL，加水使总体积为20pL,42。C反应2h，65。C作用15min,灭活反转录酵；(3)PCR取反转录产物5pL、10倍量PCR緩冲液5nL、MgCl23pL、dNTP4pL、引物各1pL和Taq酶0.5pL，加水至50jliL,并在以下条件扩增95°C50s，48°C60s,72°C90s，35个循环，在72。C延伸10min。(4)nPCR取一扩产物1mL，加入上下游引物各1jnL，并在以下条件扩增95。C50s，55。C30s，72。C90s，35个循环，72。C延伸10min。其余条件及步骤同PCR。rVPl的构建通过PCR法在VP1基因5'端引入BamHI酶切序列，在3'端引入Xhol酶切位点。将此VP1基因与PGEM-Teasy载体连4矣，转化大肠杆菌，小量制备质粒。用^3附//1和^01双酶切阳性质粒，纯化回收目的片l殳，并4吏其与用Bam别、屈ol酶切的pProEX-HTb连接以构建重组表达载体，将此重组表达载体转化感受态细胞BL21(DE3)，将转化菌涂布于含氨节的LB琼脂平板上，培养过夜，小量制备质粒，经酶切、PCR及测序鉴定得阳性克隆rVPl。表达产物的鉴定(1)SDS-PAGE蛋白质电〉永收集诱导后的菌液，离心，弃上清，用lxPBS(pH7.3)緩沖液悬浮，加入等体积的2xSDS-PAGE上样緩冲液，于沸水中煮10min得到加样样品。积层胶浓度为5%，分离胶浓度为12%,每孔上样10piL。电泳结束后用考马斯亮兰R250染色，脱色，观察在约19KDa位置是否出现特异性蛋白质条带。(2)Westernblotting按照常规操作程序进行蛋白质转膜，转膜结束后，取出NC膜，用封闭液浸泡NC膜过夜，用PBST洗涤5次，加入SVD阳性血清，37。C结合2h,用PBST洗涤5次，加入辣才艮过氧化物酶标记兔抗豚鼠二抗，37。C结合lh,PBST洗涤5次，显色，观察在约19KDa位置是否出现特异性蛋白质条带。实施例以下实施例是对本发明的进一步描述，其不对本发明范围构成任何限定。对照实施例rVPl在大肠杆菌中的常规表达挑取rVPl的单个菌落接种于3mL含100pg/mL氨爷青霉素的2xYT培养基中，培养过夜，取500nL接种于50mL2xYT培养基中，37。C培养至OD600为0.81.0,加IPTG至终浓度为2.5mmol/L,37°C继续培养，在4h收菌。如上SDS-PAGE蛋白质电泳表明在19KDa处出现了特异蛋白质条带，如上Westernblotting表明在约19KDa位置也出现了特异性条带。由此可见构建的rVPl能诱导表达产生VP1蛋白。超声裂解所得诱导表达菌，对上清液进行SDS-PAGE蛋白质电泳表明重组蛋白存在于沉淀中，进而说明重组VP1蛋白在常规诱导条件下，以包涵体形式存在。实施例1挑取rVPl的单个菌落接种于3mL含100jag/mL氨千青霉素的2xYT培养基中，37。C振荡培养至少16h,取500pL接种于50mLLB培养基中，于37。C培养至OD600达0.81.0，加IPTG至终浓度为0.10mmol/mL,将培养瓶置于18。C控温摇床中，250转/min培养16h。lxPBS(pH7.3)收菌，离心后收集沉淀，水浴超声裂解菌体，高速离心。SDS-PAGE蛋白质电泳表明裂解后的菌体上清液在19KDa处有明显的蛋白条带；Westernblotting表明该条带可以被SVDV特异性阳性血清识别。过滤超声裂解菌体后的上清夜，将滤液转移至预装有Ni-NTAHis.BindResin的层析柱中，室温作用15min,然后用25mmol/L咪唑的緩沖液(pH8.5)洗去未结合的蛋白，用150mmol/L咪唑的緩沖液(pH8.5)洗脱已结合在层析柱上的VP1蛋白，将收集的洗脱液用超滤浓缩管浓缩得VP1蛋白。实施例2如实施例1诱导rVPl表达并纯化所得VP1蛋白，只是IPTG终浓度为0.05mmol/mL,i秀导温度为16°C。SDS-PAGE蛋白质电泳表明裂解后的菌体上清液在19KDa处有明显的蛋白条带；Westernblotting表明该条带可以被SVDV特异性阳性血清识别。实施例3如实施例1诱导rVPl表达并纯化所得VPl蛋白，只是IPTG终浓度为0.20mmol/mL，诱导温度为20°C。SDS-PAGE蛋白质电泳表明裂解后的菌体上清液在19KDa处有明显的蛋白条带；Westernblotting表明该条带可以被SVDV特异性阳性血清识别。敏感性试验和交叉反应试验结果(1)敏感性试验利用大肠杆菌表达的SVDVVPl蛋白和鼠组织毒灭活抗原，分别包板，进行敏感性测定，结果表明SVD阳性血清在相同的稀释倍数条件下，测定的结果均为阳性，说明二者的敏感性相近。纯化的SVDVPl蛋白同SVDV鼠组织抗原一样具有反应原性，可以作为检测SVDV抗体的检测用抗原。(2)交叉反应试验将VPl蛋白作为抗原检测已知猪口蹄疫A型、O型和Asial型血清，结果全部为阴性，说明VPl蛋白不同口蹄疫血清反应，可以将SVDV血清同口蹄疫病毒血清区分开。表1SVDVP1的敏感性和交叉反应试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1OD值是两孔的平均值;2SVD的P/N值为SVD阳性血清OD值和阴性血清OD值的比；口蹄疫血清的P/N值为口蹄疫血清OD值与同一阴性血清的比；如果P/N值>2.1即可判定为阳性。权利要求1.一种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VP1抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)克隆VP1基因；(2)构建rVP1；(3)诱导rVP1表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白。2.权利要求l的方法，其特征在于，其中诱导剂为IPTG,其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。3.权利要求2的方法，其特征在于，其中所述IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。4.权利要求l的方法，其特征在于，其中诱导温度为16-20°C。5.权利要求4的方法，其特征在于，其中所述诱导温度为18°C。6.—种制备可用于检测猪水泡病病毒血清抗体的VP1抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)克隆VP1基因；(2)构建rVPl;(3)低浓度诱导剂和低诱导温度诱导rVPl表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白。7.权利要求6的方法，其特征在于，其中所述诱导剂为IPTG,其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL。8.权利要求7的方法，其特征在于，其中所述IPTG的最终浓度为0.1mmol/mL。9.权利要求6的方法，其特征在于，其中所述诱导温度为16-20。C。10.权利要求9的方法，其特征在于，其中所述诱导温度为18°C。全文摘要一种制备可溶性猪水疱病VP1抗原的方法，所述方法包括以下步骤(1)克隆VP1基因；(2)构建rVP1；(3)诱导rVP1表达产生可溶性VP1蛋白；和(4)纯化可溶性VP1蛋白；其中诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-1.00mmol/mL；其中诱导温度为16-20℃。所述方法在大肠杆菌中表达产生了可溶性VP1蛋白，减少了包涵体的形成，避免复杂的变性和复性过程。纯化所得VP1蛋白纯度高，免疫学特性与SVDV粒子相似，可替代SVDV粒子作为检测用抗原建立敏感、特异、安全和可靠的SVDV血清抗体的间接ELISA检测方法。文档编号C07K14/085GK101285070SQ20081006737公开日2008年10月15日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者刘湘涛,孙世琪,尚佑军,尹双辉,宏田申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所