专利名称：姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明提供一种姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用，属于生物医学技术 领域。
背景技术：
免疫调节肽在其生理浓度、有盐和血清存在的条件下具有广泛的生物学活 性，包括在先天性免疫细胞(嗜中性粒细胞、上皮细胞)中与炎症反应、先天性免 疫和适应性免疫相关的活性，在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中作为先天性免疫和适应性免疫的沟通桥梁。抗菌肽可以中和G—菌脂多糖、G+菌脂磷壁酸和细 菌未甲基化CpG DNA等细菌信号分子。这些信号分子可以与宿主细胞表面Toll 样受体结合，启动信号级联放大和细胞因子(如TNF-a、 IL-6等)正调节。低 浓度细菌信号分子可引发机体有益的炎症反应和发热，但是如果反应剧烈或持续 时间延长，可以导致全身循环障碍、器官衰竭，甚至死亡。抗菌肽可抑制脂多糖 与血清脂多糖结合蛋白因子结合，防止内毒素血症和死亡。免疫调节肽还参与宿 主天然免疫的其他反应，比如.，通过有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路或是其 它信号通路提高单核趋化蛋白的水平来刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作 用、促进肥大细胞组织胺的释放、抑制组织蛋白酶以及促进创伤愈合。细胞因子是一类主要由免疫细胞和相关细胞产生的高活性、多功能小分子蛋 白质。细胞因子的产生细胞非常广泛，除淋巴细胞、单核/巨噬细胞可产生多种 细胞因子外，粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞也能产生。 通常休止期细胞不产生或仅自发产生少量的细胞因子，当受抗原、丝裂原或其他 激活剂激活后可大量产生一定种类的细胞因子。细胞因子通过与耙细胞表面的相 应受体结合后发挥生物学功能。由于细胞因子与其受体间具有很高的亲和力，因 此极微量细胞因子就能产生明显的生物学效应。一般根据细胞因子的名称和生物 学活性可分为主要起免疫调节作用的白细胞介素、有抗病毒作用的干扰素、能刺 激骨髓造血前体细胞生长和分化的集落刺激因子、有一定抗肿瘤活性并有明显炎 症介质作用的肿瘤坏死因子、能刺激细胞生长的生长因子以及对免疫细胞有趋化 作用的趋化性细胞因子等六类。细胞因子的异常表达，常与临床上许多疾病的发生有密切的关联。 一方面， 细胞因子表达过高、过低或缺陷，均会导致与机体免疫有关疾病的发生；另一方 面，伴随着临床上许多疾病进程，某些细胞因子的表达量也会出现明显的变化。虻科昆虫俗称牛虻，属于吸血节肢动物，其寄生成功的关键是通过产生特异 唾液拮抗剂来影响宿主免疫反应。根据国内外文献报道，这些物质存在显著的生 化和药理学多样性，其天然多样性用在药物治疗和生化研究中将有很好前景，同 时也对于扩展我们对宿主保护机制性机制的理解以及对唾液产品和先天性免疫 间作用的研究。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的是基于上述技术和理论基础，提供一种具有免疫调节活性，如 抑制肿瘤坏死因子(TNF-a )、单核趋化蛋白一1(MCP-1)、白细胞介素一2(IL-2)、 白细胞介素一8 (IL-8)和白细胞介素一IO (IL-10)的姚虻唾液腺免疫调节多肽 及其基因和应用。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案姚虻唾液腺免疫调节多肽姚虻唾液腺免疫调节肽是中国虻科昆虫唾液腺免疫调节肽基因编码的一种线状多肽，其全序列为甘氨酸一甘氨酸一缬氨酸一丝氨酸一甘氨酸一缬氨酸一丝氨酸一天冬氨酸一苯丙氨酸一谷氨酸一脯氨酸一异亮氨酸一谷氨酸一缬氨酸 一丝氨酸一甘氨酸一谷氨酸一天冬氨酸一酪氨酸-天冬酰胺一丝氨酸一天冬氨 酸_谷氨酸一丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸一天冬氨酸-甘氨酸_赖氨酸_丙氨 酸姚虻唾液腺免疫调节肽基因的克隆包括姚虻唾液腺总RNA提取，mRNA纯 化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选免疫调节肽基 因。扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5 ' CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT 3， ， PCR另一扩增引物为CL0NTECH公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCR Primer引物，其序列为5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。 所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码姚虻唾液腺免疫调节多肽的基因由362个核苷酸组 成，自5'端至3'端序列为atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg aaaaggaggc 120 ■gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240 atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 attgagtaat gatatggaaa aatatatgca aattaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 3a 362编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115 — 204位核苷酸，其氨基酸序列为 Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro He Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr 15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30本发明的有益效果在于由姚虻唾液腺免疫调节肽编码基因推导其氨基酸结 构，合成的姚虻唾液腺免疫调节肽具有显著的抑制肿瘤坏死因子(TNF-a)、单核趋化蛋白1 (MCP-1)、白细胞介素8 (IL-8)、白细胞介素10 (IL-10)、白细 胞介素2 (IL-2)的作用。该多肽能够抑制多种细胞因子，能从姚虻唾液腺产品 和先天性免疫之间的关系角度揭示吸血节肢动物寄生的机制。具有结构简单、人 工合成方便、抗菌活性强等特点。
第一效蒸发器的管程，壳程用蒸汽加热，第一效蒸发于常压下蒸发，蒸发出的肼和水的混和 蒸汽进入第二效蒸发器的壳程作为热源，冷凝后的水合肼溶液进入水合肼贮槽，第二效蒸发 器是在真空下蒸馏的，真空度最好为0.04-0.09Mpa，蒸汽冷凝后进入水合肼贮槽。列管式蒸 发器全部采用降膜式操作，可以有效防止结晶的盐堵塞管道。经过蒸发后的溶液控制含盐量 40-60%,进入犁刀式蒸发器中。多效列管式蒸发器蒸发后的溶液含盐量不能太高，否则容易 堵塞蒸发器，控制较低的含盐量虽可防止结晶出大量氯化钠，但蒸发效率降低。进入犁刀式蒸发器含盐量40-60%的水合肼溶液，在犁刀搅拌下，控制蒸发温度110-140 °C，直至水合肼蒸发完毕，蒸出的蒸汽进入列管式多效蒸发器第二效的壳程做为热源。由于 犁刀式蒸发器的搅拌较强，搅拌无死角，盐碱蒸发后得到粉末状的产品，不会堵塞出料口， 主要成分为含少量结晶水的碳酸钠、氯化钠和氢氧化钠。所述铵盐母液成分主要为氯化铵或硫酸铵，其中含极少量的联二脲縮合过程中未反应完 全的水合肼，可以添加少量次氯酸钠或双氧水，将其中的水合肼进行氧化处理，得到无盐、 无水合肼的纯氯化铵或硫酸铵溶液，然后通过多效蒸发器进行浓縮或进入晒盐池自然蒸发， 结晶得到氯化铵或硫酸铵，分离后做为氮肥或化工原料。传统的碱式碳酸锌的制备方法是采用硫酸锌溶液加入加入碳酸氢铵，在70。C以上碳化， 脱二氧化碳后生成，或硫酸锌直接与碳酸钠加热反应制成。传统碱式碳酸镁的制备则采用氯 化镁溶液和碳酸钠在一定温度下反应直接生成。本发明以生产水合肼蒸馏后副产盐碱做为原料生产碱式碳酸锌或碱式碳酸镁。将犁刀式 蒸发器中放出的盐和碱重新溶解，配制成20%-40%水溶液，然后边搅拌边加入氯化镁溶液、 锌的硫酸盐或氯化物溶液，在0-5(TC下，搅拌反应生成碱式碳酸镁或碱式碳酸锌沉淀，反应 过程不需要传统制备过程的高温下碳化水解，过滤洗涤后得到碱式碳酸镁或碱式碳酸锌。可 以根据副产盐碱中氢氧化钠含量来补加适量的氢氧化钠，使合成工艺和产品质量更为稳定。 由于副产盐碱中本身含有氢氧化钠，因此无需加热至较高温度进行碳化水解，常温或较低温 度下即可生成碱式碳酸盐，节省了能耗。另外由于不需要加热碳化水解过程，因此可以大大 縮短反应时间，提高反应效率。与氯化镁或氯化锌反应生成碱式碳酸镁或碱式碳酸锌，过滤分离掉其中的碱式碳酸盐，(3)制备化合物3 [W-托利洛尔] 将化合物2 (2.3g， O.Olmol)和异丙胺(17mL， 0.20mol)溶于34mL DMF 中，60 70"C反应6小时，反应完毕,先常压回收异丙胺，再减压回收DMF,加入 60mL 1M的NaOH溶液溶解，乙酸乙酯(50mLx3)萃取，合并有机层，无水 Na2S04干燥，过滤，滤液减压浓縮至干，石油醚重结晶得白色固体^^-托利洛尔 1.83g，收率82.1%，实验数据如下mp 53-55 °C; [a]D20=+9.9(c 1.0, EtOH); iHNMR(400MHz， CDC13) S(ppm): 1.09(d, J=6.4, 6H,(CH3)2), 2.31(s, 3H,CH3), 2.72-2.75 (m， 1H，CH)， 2.78-2.90 (m,2H,CH2NH), 3.96-4.03(m,3H,ArOCH ，CH), 6.70-7.18(m,4H, ArH) 。 IR (KBr)cm":3430， 3306， 2924， 2874， 1680， 1581， 1470， 1383， 1291， 1255， 895， 766， 687。 CI-MS: 224(M+1)。实施例2:(1) 制备化合物1 [rW-3-间甲苯氧基-l，2-丙二醇]将间甲酚(10.8g， O.lmol)溶于120mL无水甲醇中，室温下分批加入氢氧 化钠(8.0g， 0.2mol)，再加入相转移催化剂四丁基溴化铵(0.16g， 0.5mmol)， 滴加(7 」-3-氯-l,2-丙二醇(25.4g， 0.23mol)，滴毕，55 60。C反应10小时，反应 完毕，趁热过滤，滤液减压浓縮，无水乙醇和四氯化碳(V:V=5:95)重结晶得 白色固体(7 」-3-间甲苯氧基-l,2-丙二醇14.9g，收率81.6%， mp 60-62°C ， [a]D2()=-9.3(;c l.O，EtOH)。(2) 制备化合物2 [ "J-4-间甲苯氧甲基-1,3,2-二氧硫戊环-2-氧化物] 将化合物l (9.1g， 0.05mol)溶于70mL二氯甲烷中，控温-15 -10。C滴加氯化亚砜(8.8g， 0.074mol)和lOmL二氯甲烷的混合溶液，滴毕，控温5 1(TC 反应约1.5小时，反应完毕后，缓慢加入60mL水,分层，二氯甲烷(50mLx3)萃 取，合并有机层，水(60mLx2)洗有机层，无水Na2S04干燥，过滤，减压浓 縮得浅黄色液体(5J-4-间甲苯氧甲基-1，3,2-二氧硫戊环-2-氧化物10.9g，收率 95.3%，气相色谱含量含量97.3%， [a]D2Q=-47.2(cl.0,EtOH)。 G)制备化合物3 [(7 >托利洛尔] 将化合物2 (2.3g， O.Olmol)和异丙胺(85mL， l.Omol)溶于34mL乙腈中， 50 60。C反应10小时，反应完毕,先常压回收异丙胺，再减压回收乙腈，加入 60mL 2M的NaOH溶液溶解，乙酸乙酯(50mLx3)萃取，合并有机层，无水 Na2S04干燥，过滤，滤液减压浓縮至干，甲苯重结晶得白色固体(7 >托利洛尔 1.86g，收率83.4%， mp53画55。C; [a]D20=+9.9(c 1.0, EtOH)。7. 16,000 g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。D. 大肠杆菌DH5 a感受态细胞的制备1. 挑取单个DH5a菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37 。C 培养过夜，次日取上述菌液按比例l:100再接种于50ml LB培养液中， 37。C振荡2小时。当OD,值达到O. 35时，收获细菌培养物。2. 将细菌转移到一个无菌、 一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙 烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至(TC。3. 于4。C以4100r/min离心10min，以回收细胞。4. 倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。5. 每50ml初始培养液且30ml预冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液 (80mmol/L MgCl2, 20誦ol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。6. 于4。C以4100r/min离心10min，以回收细胞。7. 倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。8. 每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0. lmol/L CaCl2重悬每份 细胞沉淀，分装后备用。E. 酶切、连接以及连接产物的转化1. 在微量离心管中力ti入1 u 1 Takara pMD18-T载体、4u 1无指盘臭蛙 cDNA双链溶液，全量为5 yl。2. 加入5 Pl (等量)的连接酶缓冲混合物。3. 16'C反应2小时。4. 全量(10 u 1)加入至100ulDH5a感受态细胞中，冰中放置30分 钟。5. 42'C加热90秒钟后，再在冰中放置l分钟。6. 加入37。C温浴过的LB培养基890ul， 37。C缓慢振荡培养60分钟。7. 取200 u 1涂布于含有X-Gal、 IPTG、 Amp的LB培养基上37。C培养16 小时，形成单菌落。8. 每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。构建 的cDNA大约含l X 106个单独克隆。IV、姚虻唾液腺免疫调节肽基因克隆筛选扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5' CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT 3， ， PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCR Primer引物，其序列为5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。PCR反应在如下条件下进行94 °C 30秒钟，56°C 3 0秒钟和72 °C 60 秒钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含IOOU g/inl氨苄青霉素的LB培养 基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于 首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8X8矩阵铺板(共64孔，每孔100 "I), 37 'C过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR 鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。V、姚虻唾液腺免疫调节肽基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST Sequencing Primer RV-M禾卩BcaBEST Sequencing Primer M13-47, BcaBEST Sequencing Primer RV-M序列5、 GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3' ， BcaBEST Sequencing Primer M13-47: 5， CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，。基因测序结果自5'端 至3'端序列为atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg犯aaggaggc 120 gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccat肌c agcaaagcca 240 atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 3ttg3gt犯t gat3tgg犯3 aatatatgca犯tta犯caa 3a^aaaa犯a aaaa^aaaaa 360 — . 362姚虻唾液腺免疫调节肽基因核苷酸的序列表为序列长度为362个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源姚虻 唾液腺。编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115 — 204位核苷酸，其氨基酸序列为 Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr 15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30姚虻唾液腺免疫调节肽基因作为基因工程制备姚虻唾液腺免疫调节肽的应用。实施例二制备姚虻唾液腺免疫调节肽I 、姚虻唾液腺免疫调节肽的制备方法根据编码姚虻唾液腺免疫调节肽的 基因推断姚虻唾液腺免疫调节肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序 列。通过HPLC反相ds柱层析脱盐、纯化。II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS )，以甘油间硝基苄醇二甲亚砜(1:1:1， V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为lyA,发射电压为25Kv。III、纯化的姚虻唾液腺免疫调节肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度， 分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测 序仪测定氨基酸序列结构。实施例三姚虻唾液腺免疫调节肽的药理实验1、 姚虻唾液腺免疫调节肽对肿瘤坏死因子(TNF-a )抑制的作用(图1): 大鼠脾细胞的准备和培养:'大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml 注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将 沉淀悬浮于含10%胎牛血清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基， 调整细胞浓度至2Xl(^个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加 入浓度为lmg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml,设2个重复孔； 同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设 2个重复？L. 37°C， 5%0)2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1. 5ml 离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于一20°C，用于细胞因子 的检测。将保存于一2(TC，用于TNF-a检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空 白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中 加入10ul的生物素标记液；在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37'C孵育反应 60分钟；洗涤液5次，每次静置10—20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37 。C下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm 的酶标仪上读取各孔的OD值;'以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘 制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。2、 姚虻唾液腺免疫调节肽对单核趋化蛋白一l (MCP-1)抑制的作用(图2):大鼠脾细胞的准备和培养大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml 注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将 沉淀悬浮于含10%胎牛血清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基， 调整细胞浓度至2X 1()S个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加 入浓度为lmg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml,设2个重复孔； 同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设 2个重复？L. 37°C， 5%(;02及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1. 5ml 离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于细胞因子 的检测。将保存于—20。C，用于MCP-1检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空 白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中 加入10ul的生物素标记液；在样品孔中加入100ul的酶标记溶液；37"C孵育反应 60分钟；洗涤液5次，每次静置10 — 20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37 'C下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm 的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘 制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。3、 姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素一8(IL-8)抑制的作用(图3): 大鼠脾细胞的准备和培养大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织,在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml 注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将 沉淀悬浮于含10%胎牛血清、2ug/ml细菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培养基， 调整细胞浓度至2Xl()S个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul，并加 入浓度为lmg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml,设2个重复孔； 同时设置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设 2个重复？L. 37°C， 5%0)2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于1. 5ml 离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于细胞因子 的检测。将保存于一2(TC，用于IL-8检测的细胞上清加入ELISA试剂盒的空白 微孔中100ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样品孔中 加入50ul的酶标记溶液；37'C孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10 — 20 秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37'C下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul 终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的0D值；以OD值为纵坐 标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值査找对应的浓度 范围，2个重复孔的浓度取平均值。4、 姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素一10(IL-10)抑制的作用(图4): 大鼠脾细胞的准备和培养大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml 注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将 沉淀悬浮于含10%胎牛血清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养 基，调整细胞浓度至2Xl(^个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul， 并加入浓度为lmg/ml的牛虻免疫调节肽4ul，使之终浓度达20ug/ml，设2个重复 孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对 照，设2个重复孔.37'C， 5%0)2及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于 1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min,保留上清，并保存于一20。C，用于细 胞因子的检测。将保存于一2(TC，用于IL-10检测的细胞上清加入ELISA试剂 盒的空白微孔中50ul/孔，设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样 品孔中加入10ul的生物素标记液；在样品孔中加入50ul的酶标记溶液；37'C孵 育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置10 — 20秒；每孔加入底物A、B液各50ul; 37'C下避光孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm 的酶标仪上读取各孔的OD值；以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘 制曲线图；根据样品的OD值查找对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。5、 姚虻唾液腺免疫调节肽对白细胞介素一2(IL-2)抑制的作用(图5):大鼠脾细胞的准备和培养大鼠断颈椎处死，无菌取出脾脏并剥离脂肪组织，在RPMI1640培养基中冲掉血迹，无菌剪碎脾脏后转移至200目铜网，并用2ml 注射器芯将脾脏研磨分散成单个细胞。1000rpm/min离心10分钟，弃上清，将 沉淀悬浮于含10%胎牛血清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培养 基，调整细胞浓度至2Xl(^个/ml。于96孔板的每个孔中加入细胞悬液196ul， 并加入浓度为lmg/ml的牛虻免疫调节肽4nl，使之终浓度达20ug/ml,设2个重复 孔；同时设置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫调节肽的细胞作为对照，设2个重复孔.37'C， 5%(:02及饱和湿度下培养48小时，收集细胞培养液于 1.5ml离心管中，2000rpm/min离心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于细 胞因子的检测。将保存于一20'C，用于IL-2检测的细胞上清加入ELISA试剂盒 的空白微孔中100ul/ L,设2个重复孔；根据ELISA检测试剂盒说明书，在样 品孔中加入50ul的酶标记溶液；37'C孵育反应60分钟；洗涤液5次，每次静置 10 — 20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37'C下避光孵育反应15分钟；每孔 加入50ul终止液，终止反应；于波长450nm的酶标仪上读取各孔的0D值；以 OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的OD值査找 对应的浓度范围，2个重复孔的浓度取平均值。姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用-ST25 SEQUENCE LISTING<110〉中国科学院昆明动物研究所<120〉姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用<130> 1<160〉 2<170〉 Patentln version 3.4<210〉 1<211〉 362<212〉 腿<213〉 Tabacus yao Macquart<400> 1atgttgttaaaaagt ucgttttctttmUgagcctgctcattgtgggactgt tUca60tcatgtgatgcggatgcccaatatgaggatctcgtcacaggcUUUcg謹aggaggc120gtUgtggagttagtgactttgaacccatcgaggtctctggcgaagactataacagtgat180gaagcggacgaagacggaaaagcgtaattctaccacctttaacccataacagcaaagcca240atgaagcagagtgcaattUgtttgaaugttttatgtatttcatatggc300at tgagUatgatatggaaaaatatatgcaaat Uaacaaaaemaaaaaaaaaaaaaaa360362<210> 2 <211〉 30 <212> PRT<213〉 Tabacus yao Macquart <400> 2Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly 15 10 15Glu Asp Tyr Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30
权利要求
1.姚虻唾液腺免疫调节肽，其特征在于该免疫调节肽是中国虻科昆虫唾液腺免疫调节肽基因编码的一种线状多肽，其全序列为甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸。
2. 姚虻唾液腺免疫调节肽基因核苷酸序列，其特征在于免疫调节肽基因由362个核苷酸组成，其自S'端至3'端序列为atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg a犯aggaggc 120gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcg犯gacta taacagtgat 180gaagcggacg犯gacggaaa agcgt犯ttc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240atgaagcaga gtgc犯ttta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 3003ttg3gtaat g3t3tgg犯3犯tatatgc3犯tta^acaa朋aa肌犯aa aaa犯aaaaa 360犯o
3. 权利要求2所述的姚虻唾液腺免疫调节肽基因核苷酸序列，其特征在于， 编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸，其氨基酸序列为Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala20 25 ' 30
4.权利要求1所述的姚虻唾液腺免疫调节肽，其特征在于该免疫调节肽作为抑制肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素8 (IL-8)、 单核趋化蛋白l (MCP-1)、白细胞介素IO (IL-10)的应用。
全文摘要
本发明涉及一种姚虻唾液腺免疫调节肽及其基因和应用，属于生物医学领域。该免疫调节肽是中国虻科昆虫唾液腺免疫调节肽基因编码的一种线状多肽，其全序列为甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸。免疫调节肽基因由362个核苷酸组成，其中编码成熟编码姚虻唾液腺免疫调节肽为第115-204位核苷酸。该姚虻唾液腺免疫调节肽作为抑制多种细胞因子的应用。本发明的免疫调节肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强等特点。
文档编号C07K14/435GK101220091SQ20081005807
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者徐学清, 李东升, 静 武, 仞 赖, 马冬莹 申请人:中国科学院昆明动物研究所