专利名称：：一种具有抗癌活性的Ru(Ⅱ)配合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及金属配合物，具体为一种具有抗癌活性的Ru(n)配合物及其制备方法。技术背景金属配合物与DNA有三种作用方式，它们分别为l、静电结合；2、沟渠结合；3、插入结合。静电结合是指带正电荷的金属配合物与DNA中带负电荷的磷酸根以静电吸引的方式相结合；沟渠结合是指配合物结合到双螺旋DNA的沟渠部位；插入结合是指配合物利用其含有的平面芳香杂环插入到DNA的碱基对中，并与其碱基对发生堆积。这三种方式中以第三种方式为最佳的结合方式，因为可以插入到DNA的碱基对中，直接使碱基对受损，在癌症等遗传病中由于其母代DNA的错配导致子代DNA也以错配形式复制，若金属配合物能够识别这样的错配并插入到错配的碱基对中，它便阻止其复制，这样我们便可将其作为一种好的抗癌药物，从根本上治疗遗传病或分子病。目前，有人合成芳香环Co配合物，但芳香环Co配合物与DNA的键合常数的数量级一般在10、—'左右，在抗肿瘤活性方面表现平平，并且由于在制备该种含有芳香环Co配合物的时候，使用噻吩为原料，而噻吩中的S杂原子为亲软金属原子，不亲硬金属，无法同人体内的生命金属进行络合，因而该种含有芳香环Co配合物的抗肿瘤活性难尽人意o
发明内容本发明目的在于提供一种具有抗癌活性的Ru(II)配合物及其制备方法。本发明提供的一种具有抗癌活性的Ru(II)配合物，其分子结构式为本发明提供的一种具有抗癌活性的Ru(II)配合物的制备方法，包括如下步骤第一步取lmol1,10-菲咯啉，分5次加入到1.2L浓硫酸中，并搅拌使之溶解，再加入lmol的溴化钠，然后缓慢加入0.6L浓硝酸，加热回流2小时，冷却到室温，缓慢倒入800mol的冰水中，用10M的氢氧化钠将上述溶液中和至pH值二6.57.4，静置30min后过滤，再将滤饼用沸水溶解、过滤，然后将两份滤液混合，用CH2Cl2进行萃取，将无水硫酸镁加入萃取液中除去萃取液中的水分，再将除去水分的萃取液旋转蒸发，使其产生黄色固体，再用甲醇将黄色固体重结晶，得黄色针状产物l,10-菲咯啉(phen)-5,6-二酮，反应式第二步在氩气保护下，将第一步制成的1,10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮与等摩尔的3,4-二胺基呋喃溶于30L乙醇中，回流反应68h;等待反应混合物冷却后，过滤析出的固体，用无水乙醇重结晶，得配体b联吡啶并[3,2-a;2'，3-0|-呋喃-[3，4《]吖嗪，反应式第三步将lmolRuCl:,H20和2mo1的1，IO-菲咯啉,溶于6LN，N'一二甲基甲酰胺中，在氩气保护下，加热回流34h，接着旋转蒸发除去大部分溶剂，剩余溶液冷却至室温，加入52L丙酮，置于O'C的环境中过夜；抽滤所得晶体，并用冰水洗涤；然后将粗产品溶于1:1的乙醇和水中，加热回流l2h，过滤后除去不溶物，于滤液中加入124mo1LiCl，旋转蒸发除去溶液中的乙醇，剩余水溶液于冰浴中冷却，得到墨绿色晶体[Ru(phen)2Cl2]2H20，反应式第四步:在氩气保护下，将第二步所得的配体L溶解在5(TC-6(rC100L的甲醇中，将第三歩所得到的[Ru(phen)2ClJ2H20溶入25L沸腾的乙腈溶液中，再将沸腾液滴加入上述含有配体L的甲醇溶液中，.混合溶液保持在8(TC反应68h，冷却到室温，再搅拌3小时，形成悬浮液体，过滤，用乙腈洗涤被过滤掉的固体，将洗漆液与过滤液混合后旋转蒸发，加入高氯酸钠的饱和溶液，直到沉淀量不再增加为止，过滤，用水、乙醇、乙醚依次洗涤沉淀物，真空干燥；然后将干燥后的沉淀物在乙腈/甲醇/饱和高氯酸钠中重结晶，最终得到Ru(II)配合物，反应式Ru(II)配合物具有明显的抗癌活性，可用于制备抗癌药物。实验证明浓度在O.lnM时便能够与胃癌细胞株7901作用，并且有效抑制率(11%)=36.60%，当配合物浓度为lnM时有效抑制率达到最大(11%)=49.33%。Ru(II)配合物还可以用于制备抗艾滋病的药物。由于Ru(II)配合物具有分子光开关功能，同时具有抑制拓扑异构酶的活性，因此可以用于制备抗艾滋病的药物。与现有技术相比，本发明Ru(II)配合物的抗癌活性明显优于Co配合物及顺铂药物;Ru(II)配合物与DNA具有很高的亲和性，键合常数的数量级一般在105M—'左右；在插入配体的选择上，由于选用呋喃为原料，呋喃中含有0原子，0亲硬金属，即Cu、Fe、Ca等生命原子，同时0又可与H"等形成氢键。Ru(II)配合物不仅可用于制备抗癌药物，还可以用于制备抗艾滋病的药物。图l配合物对胃癌细胞株7901的抑制效应图2complex+DNA的紫外吸收光谱图3配合物与EB-DNA复合物的荧光光谱图4配合物在不同的浓度下对DNA黏度的影响图5配合物在不同的浓度下与pBR322DNA作用的电泳图，图中Lane1:DNAcontrol;Lane2-6:[complex]=0.5，1，2,3，5xl0-5mol*L-1。具体实施方式实施例lRU(II)配合物的制备第一步将5克(25翻1)1,10-菲咯啉(phen)分批加入到30ml浓硫酸中，并不断搅拌使之溶解，再加入2.5克溴化钠，然后缓慢加入15ml浓硝酸，将所有物质溶于酸性介质后，反应物加热回流2小时，冷却到室温，缓慢倒入400克冰水中，用150mllOM的氢氧化钠中和至pH值=7，静置30min后过滤，滤饼用100ml沸水溶解，除去不溶物，将两份滤液混合，用5X100mlCH2Cl2萃取，有机相用50ml水洗涤，于无水硫酸镁中干燥，旋转蒸发产生黄色固体，用甲醇重结晶，得2.76克黄色针状产物(1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮)；第二歩在氩气保护下，将1,10-菲咯啉(phen)-5,6-二酮(0.24g,1.14画1)，3,4_二胺基呋喃(0.074g，lmmol)溶于乙醇中，回流反应6h。等待反应混合物冷却后，滤出析出的固体，用无水乙醇重结晶，得配体b联吡啶并[3，2-a;2'，3'-c]-呋喃-[3，4-c]吖嗪；第三步将RuCl;,.H20lg(4.82画1)，1,10-菲咯啉(phen)1.91g(9.64mmol)溶于30mlN,N-二甲基甲酰胺中，在氩气保护下，加热回流3h，接着旋转蒸发除去大部分溶剂，剩余溶液冷至室温，加入丙酮250ml,置于O'C过夜。抽滤所得晶体并用冰水洗涤。然后将粗产品溶于乙醇和水(l:l)混合溶剂中加热回流lh，过滤所得溶液除去不溶物，于滤液中加入23gLiCl，旋转蒸发除去溶液中的乙醇，剩余水溶液于冰浴冷却得到墨绿色晶体。用乙醚洗涤后真空干燥；第四步在氩气保护下，将0.0976g(0.4mmo1)配体L溶解在45ml热的甲醇中，滴加入沸腾的[Ru(phen)2"2].2H20(0.227g，0.4隨o1)的10ml乙腈溶液。滴入几滴冰醋酸，混合溶液保持在80'C反应6小时，混合物冷却到室温后，再搅拌3小时，过滤形成的悬浮液体，然后用乙腈洗涤。在浓缩的过滤液体中，加入高氯酸钠的饱和溶液，过滤，以水、乙醇、乙醚洗涤沉淀,在干燥器中真空干燥两天;然后在乙腈/甲醇/饱和高氯酸钠中重结晶,得到Ru(n)配合物。Ru(II)配合物的元素分析及核磁数据Found:C，49.23;H,2.49;N，l1.48%.Calc.ForC40H24C12N8O9Ru:C,51.50;H,2.57;N，12.02%.'HNMR(ppm,DMSO-漆):8,92(d，2H),8.72(dd，4H),8.63(s,2H)，8.34(s,4H)，8.17(m,4H),8.08(d,2H)，7.76(m,4H),7.68(t,2H).(m，multiplet).实施例2Ru(II)配合物抗癌活性实验抗癌活性实验通过细胞毒性来实现，是通过利用四唑鐵盐3-(4,5-二甲噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑錄(MTT)为染料进行的。配合物用磷酸冲液配制置于4'C冰箱中备用。系列储备溶液在96眼微孔滴定盘中的培养基中备好。配合物以浓度梯度(lnM-luM)的方式加入到细胞培养液中，并且24小时内不用更换介质。在设定反应时间结束时，培养基被移到含有0.5mg/mlMTT的200iiL的介质中同时微孔滴定盘被放置在培养箱中37'C恒温4小时。介质中加入100ulDMSO以增加这种紫色染料的溶解度。最后，产品通过在595nm荧光下测定每个孔的光密度得数值。抑制率(11%)通过下列公式计算II(%)=(l-7/C)X100%，其中分别代表经过配合物处理过的部分和未处理过的部分的光密度值。重复以上实验三次。本次实验利用胃癌细胞株7901来完成，配合物浓度在O.lnM时便能够与胃癌细胞株7901作用，并且有效抑制率(11%)=36.60%。当配合物浓度为lyM时有效抑制率达到最大(11%)=49.33%。如图1所示。这些结果表明Ru(II)配合物能够有效抑制胃癌细胞，这可为药物制备提供一些有价值的信息。实施例3Ru(II)配合物与DNA的相互作用实验吸收光谱研究图2曲线a为Ru(II)配合物的紫外吸收光谱，曲线bh为Ru(II)配合物中加入DNA后的紫外吸收光谱，由图可见当加入DNA后配合物的吸收峰强度降低。根据文献报道[1(']，当小分子以嵌入方式结合于CT-DNA双螺旋碱基对之间时，其吸收光谱表现出减色效应；当小分子以静电方式结合于CT-DNA时，其吸收光谱表现出增色效应；因此，Ru(II)配合物此时与CT-DNA之间的相互作用应以嵌插作用为主。配合物对DNA-EB荧光光谱的影响溴化乙锭(EB)为一共扼平面分子，本身荧光很弱，但能专一性地插入DNA双螺旋或三螺旋内部的碱基对之间使荧光显著增强，当EB从DNA中出来或DNA双螺旋减少时，荧光发生猝灭，因而EB可用作DNA结构探针。".由图3可看出，在缓冲溶液中，随着配合物浓度的不断增加，DNA-EB荧光逐渐下降。说明Ru(II)配合物与DNA是以嵌插方式相结合的。CTDNA的热变性实验通过测定DNA的热变性温度(O可以区分配合物与DNA的作用模式(嵌插,外部键合)。配合物与DNA发生插入反应，将稳定DNA的双链结构，并使二急剧上升；而配合物仅与DNA发生外部键合时，则"上升幅度较小或不上升[12]。在本实验条件下,DNA的"为64'C。当DNA与Ru(II)配合物作用后，其4为70'C。这表明Ru(II)配合物与DNA是以嵌插方式相结合的。黏度研究具有光学活性的光物理探针对于探讨键合模式一般可以提供必要的但不是充分的证据["].在缺乏晶体数据的情况下，黏度测定一般被认为是确定键合模式最有力的证据之一["]。从图4可出，DNA与配合物相互作用后，黏度值升高。黏度对分子长度变化非常敏感。当小分子配合物以经典插入方式与DNA相互作用时，DNA相邻碱基对的距离会增大以容纳插入的配合物分子，导致DNA螺旋伸长，相应DNA黏度增加。DNA本身是一多聚阴离子，在溶液中，由于负电荷之间的相互静电排斥，使DNA大分子较为伸展，而当配合物阳离子与DNA带负电荷的磷酸氧基团以静电作用结合时，使得DNA的负电荷被部分中和，导致DNA螺旋收縮，分子长度变小，相应DNA黏度降低.电化学行为研究根据循环伏安曲线所得的式量电位的移动可以判断小分子与DNA相互作用模式^。通常，当外源小分子与DNA发生插入作用时，小分子的式量电位正移；反之，如果外源小分子与DNA骨架上的带负电荷的磷酸基发生静电作用，则其式量电位负移。由表l可见，纯粹Ru(Il)配合物的阳极峰电位(Epa)和阴极峰电位(Ep。)分别为1.1481V和-0.9001V，式量电位(E^)为0.1240V.Ru(II)配合物与DNA作用后的阳极峰电位(EP)和阴极峰电位(EJ分别为I.1592V和-0.8704V，式量电位(E,")为O.1444V.式量电位正移，说明Ru(II)配合物与DNA以经典插入方式相互作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>凝胶电泳分析为了进一步研究Ru(II)配合物与DNA的相互作用，我们做了凝胶电泳实验。由图5可看出，当Ru(II)配合物浓度达到0.5xl(^mol，L"时便可将pBR322DNA切割成线性(formIII)，当配合物浓度达到1.0xl(TSmol，L"时线性很明显，并且随着配合物浓度增大，线性逐渐增加，超螺旋DNA(formI)逐渐减少直至消失。说明该配合物具有较高的切割质粒DNA的活性。权利要求1、一种具有抗癌活性的Ru(H)配合物，其特征在于，分子结构式为全文摘要本发明提供了一种具有抗癌活性的Ru(II)配合物，其制备步骤包括氧化1，10-菲咯啉得1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮；1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮与3，4-二胺基呋喃反应得配体L；RuCl<sub>3</sub>与1，10-菲咯啉反应得到[Ru(phen)<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>]·2H<sub>2</sub>O；再与配体L反应得终产物。本发明Ru(II)配合物的抗癌活性明显优于Co配合物及顺铂药物；Ru(II)配合物与DNA具有很高的亲和性，键合常数的数量级一般在10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>左右；在插入配体的选择上，由于选用呋喃为原料，呋喃中含有氧原子，氧亲硬金属即Cu、Fe、Ca等生命原子，使其更具有好的抗癌效果。文档编号C07F15/00GK101220059SQ200810054429公开日2008年7月16日申请日期2008年1月8日优先权日2008年1月8日发明者席小莉,频杨申请人:山西大学